JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье описан хорошо зарекомендовавший себя и воспроизводимый анализ лектиновых пятен для всего препарата сетчатки и протоколы, необходимые для количественного измерения сосудистых параметров, часто изменяющихся при пролиферативных и непролиферативных ретинопатиях.

Аннотация

Ретинопатии представляют собой гетерогенную группу заболеваний, которые поражают нейросенсорную ткань глаза. Для них характерны нейродегенерация, глиоз и прогрессирующее изменение сосудистой функции и структуры. Хотя начало ретинопатий характеризуется тонкими нарушениями зрительного восприятия, модификации в сосудистом сплетении являются первыми признаками, обнаруженными клиницистами. Отсутствие или наличие неоваскуляризации определяет, классифицируется ли ретинопатия как непролиферативная (NPDR) или пролиферативная (PDR). В этом смысле несколько животных моделей пытались имитировать специфические сосудистые особенности каждой стадии, чтобы определить основные механизмы, участвующие в изменениях эндотелия, гибели нейронов и других событиях, происходящих в сетчатке. В этой статье мы предоставим полное описание процедур, необходимых для измерения сосудистых параметров сетчатки у взрослых и мышей с ранними родами на послеродовой день (P)17. Мы подробно расскажем о протоколах проведения окрашивания сосудов сетчатки изолектином GSA-IB4 в целых креплениях для последующей микроскопической визуализации. Также предусмотрены ключевые этапы обработки изображений с помощью программного обеспечения Image J Fiji, поэтому считыватели смогут измерять плотность сосудов, диаметр и извилистость сосудов, ветвление сосудов, а также аваскулярные и неоваскулярные области. Эти инструменты очень полезны для оценки и количественной оценки сосудистых изменений как при непролиферативных, так и при пролиферативных ретинопатиях.

Введение

Глаза питаются двумя артерио-венозными системами: сосудисто-сосудистой, внешней сосудистой сетью, орошающей пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы; и сосудисто-нервно-ретинальные сосуды, которые орошают слой ганглиозных клеток и внутренний ядерный слой сетчатки1. Сосудистая система сетчатки представляет собой организованную сеть сосудов, которые доставляют питательные вещества и кислород к клеткам сетчатки и собирают отходы для обеспечения надлежащей визуальной сигнальной трансдукции. Эта сосудистая система имеет некоторые отличительные особенности, в том числе: отсутствие автономной иннервации, регуляция сосудистого тонуса внутренними механизмами сетчатки и наличие сложного сетчаточно-гематоэнцефалического барьера2. Поэтому сосудистая система сетчатки была в центре внимания многих исследователей, которые широко изучали не только васкулогенез во время развития, но и изменения и патологический ангиогенез, которым подвергаются эти сосуды при заболеваниях3. Наиболее распространенными сосудистыми изменениями, наблюдаемыми при ретинопатиях, являются дилатация сосудов, неоваскуляризация, потеря сосудистой арборизации и деформация магистральных сосудов сетчатки, что делает их более зигзагообразными4,5,6. Одно или несколько из описанных изменений являются самыми ранними признаками, которые будут обнаружены клиницистами. Визуализация сосудов обеспечивает быстрый, неинвазивный и недорогой метод скрининга7. Обширное изучение изменений, наблюдаемых в сосудистом дереве, определит, является ли ретинопатия непролиферативной или пролиферативной, и дальнейшее лечение. Непролиферативные ретинопатии могут проявляться аберрантной морфологией сосудов, снижением плотности сосудов, бесклеточными капиллярами, гибелью перицитов, макулярным отеком и др. Кроме того, пролиферативные ретинопатии также развивают повышенную проницаемость сосудов, внеклеточное ремоделирование и образование сосудистых пучков к полости стекловидного тела, которые легко разрушаются или индуцируют отслоение сетчатки8.

После обнаружения ретинопатию можно контролировать через ее сосудистые изменения9,10. За прогрессированием патологии можно следить через структурные изменения сосудов, которые четко определяют стадии заболевания11. Количественная оценка сосудистых изменений в этих моделях позволила соотнести изменения сосудов и гибель нейронов и протестировать фармакологическую терапию для пациентов в разных фазах заболевания.

В свете вышеуказанных утверждений мы считаем, что распознавание и количественная оценка сосудистых изменений являются фундаментальными в исследованиях ретинопатий. В этой работе мы покажем, как измерять различные сосудистые параметры. Для этого мы будем использовать две модели животных. Одним из них является модель мышиной ретинопатии, индуцированная кислородом12, которая имитирует ретинопатию недоношенных и некоторые аспекты пролиферативной диабетической ретинопатии13,14. В этой модели мы будем измерять аваскулярные области, неоваскулярные области, а также дилатацию и извилистость магистральных сосудов. В нашей лаборатории была разработана модель мыши метаболического синдрома (MetS), которая индуцирует непролиферативную ретинопатию15. Здесь мы оценим плотность сосудов и ветвление.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

С мышами C57BL/6J обращались в соответствии с руководящими принципами ArVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Экспериментальные процедуры были разработаны и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (CICUAL) факультета химических наук Национального университета Кордовы (Res. HCD 1216/18).

1. Приготовление буферных растворов и реагентов

  1. Приготовление 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS): Добавьте 8 г хлорида натрия (NaCl), 0,2 г хлорида калия (KCl), 14,4 г дигидрата динатрия-водород-фосфата (Na2HPO4 2H2O) и 0,24 г калия-дигидрофосфата (KH2PO4) до 800 мл дистиллированной воды. Перемешайте раствор до полного растворения солей. Отрегулируйте рН до 7,4 с хлоридной кислотой (HCl) и отрегулируйте объем до 1 л с дополнительной дистиллированной водой. Отфильтруйте раствор и храните при температуре 4 °C.
  2. Приготовление 4% параформальдегида (PFA): Добавьте 40 г твердого PFA к 800 мл свежеприготовленного PBS. Размешайте раствор в нагревательной пластине при постоянной температуре 60 °C. Добавьте 1 M гидроксида натрия (NaOH) до полного растворения PFA, проверяя, что pH поддерживается в диапазоне 7,2-7,4. Добавьте объем до 1 000 мл с помощью PBS и перемешайте. Выключите нагревательную пластину и фильтруйте раствор, когда его температура ниже 35 °C. Хранить раствор при температуре 4 °C до 3 дней.
    ВНИМАНИЕ: PFA вреден при проглатывании или вдыхании и, вероятно, является мутагенным соединением. Используйте перчатки и маску для лица в течение всего процесса и работайте в кабине безопасности.
  3. Приготовление 1x Tris-буферного физиологического раствора (TBS): Добавьте 6,1 г Tris и 9 г NaCl к 800 мл дистиллированной воды. Перемешайте раствор до полного растворения солей. Отрегулируйте pH до 7,4 с HCl и отрегулируйте объем до 1 л с помощью дополнительной дистиллированной воды. Отфильтруйте раствор и храните при температуре 4 °C.
  4. Приготовление TBS- 0,1% Triton X-100: Добавьте 0,1 мл TritonX-100 до 100 мл TBS. Осторожно перемешайте и храните при 4 °C в течение 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку Тритон является очень плотным моющим средством, слегка отрежьте клемму наконечника для лучшего пипетирования.
  5. Приготовление TBS-5%-бычьего сывороточного альбумина (BSA)-0,1% Тритона-X-100: Взвесить 5 г BSA и добавить TBS-0,1% раствор тритона X-100 до конечного объема 100 мл. Осторожно перемешать. Аликвот и хранить при -20 °C до 2 месяцев.
  6. Изолектин GSA-IB4 Alexa fluor-488 конъюгат (Isolectin GSA-IB4): Вес 36,75 мг дигидрата хлорида кальция (CaCl2·2H2O) и добавьте его в 500 мл свежеприготовленного PBS. Перемешайте раствор с перемешиванием. Пипетку 500 мкл раствора CaCl2/PBS и добавляют ее во флакон, содержащий 500 мкг лиофилизированного порошка изолектина GSA-IB4. Аккуратно перемешать и аликвотировать раствор в тубах по 0,5 мл. Храните их при температуре -20 °C в защищенном от света месте.
  7. Поли (виниловый спирт) в глицерине / Трисе: взвесьте 2,4 г поли(винилового спирта), добавьте 6 г глицерина и осторожно перемешайте. Затем добавьте 6 мл воды и продолжайте помешивать в течение нескольких часов при комнатной температуре. Добавьте 12 мл предварительно нагретого 0,2 М раствора Триса (рН: 8,5) и нагрейте при постоянной температуре 50 °C в течение 10 мин и периодически перемешайте. Наконец, центрифугируют раствор при 5000 х г в течение 15 мин для осветления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте раствору остыть при комнатной температуре, аликвотируйте его и храните при -20 °C.

2. Флуоресцентное окрашивание лектином

  1. После жертвоприношения мышей путем вдыхания углекислого газа (CO2) энуклеируйте глаза ножницами16. Зафиксируйте энуклеированные глаза свежеприготовленным 4% PFA в течение 1 ч при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация также может быть выполнена путем инкубации глаз в 4% PFA в течение ночи (ON) при 4 °C. Мыши были принесены в жертву в соответствии с руководящими принципами Заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (CICUAL) факультета химических наук Национального университета Кордовы (Res. HCD 1216/18).
  2. Под рассекающим микроскопом удаляют роговицы ножницами, разрезая вдоль лимбуса и рассекая всю сетчатку. Отбросьте передний сегмент глаза, а затем отделите сетчатку от RPE-сосудистой оболочки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно удалите оставшийся мусор и подъязычные сосуды из сетчатки щипцами.
  3. Поместите сетчатку в трубки по 200 мкл. Затем блокируют и пермеабилизируют сетчатку в 100 мкл раствора трис-буферного физиологического раствора (TBS), содержащего 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% тритона-X-100 в течение 6 ч при 4 °C с мягким перемешиванием в шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в течение 2 ч на RT.
  4. Затем переверните трубку, чтобы поместить сетчатку в колпачок и удалите блокирующий раствор пипеткой.
  5. Добавьте 100 мкл раствора, содержащего 0,01 мкг/мкл изолектина GSA-IB4 (GSA-IB4). Оберните трубки алюминиевой фольгой, чтобы защитить образцы от света. Инкубировать сетчатку раствором лектина ON при 4 °C или в течение 2 ч при RT с мягким перемешиванием в шейкере.
  6. Промыть сетчатку 100 мкл TBS, содержащей 0,1% Triton-X-100, в течение 20 мин с мягким перемешиванием в шейкере. Для правильного мытья поместите сетчатку в колпачок трубки, перевернув ее. Верните трубку в стоячее положение и извлеките среду, оставшуюся в контейнере. Повторите этот шаг три раза.
  7. Поместите сетчатку в слайд и добавьте каплю PBS. Под рассекающим микроскопом выполните четыре одинаково удаленных разреза от краев сетчатки в сторону зрительного нерва.
  8. Чтобы развернуть лепестки сетчатки, используйте щипцы или небольшие кусочки фильтровальной бумаги. Убедитесь, что сторона фоторецептора обращена вниз.
  9. Удалите оставшуюся PBS слайда с помощью фильтровальной бумаги. Затем добавьте монтажную среду (Поли(виниловый спирт) в глицерине/Трисе) и крышку. Дайте высохнуть в течение 1 ч на RT.
  10. Храните слайды при температуре 4 °C, защищенные от света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатка также может храниться в PBS при 4 °C до конфокальной микроскопической визуализации.

3. Визуализация конфокальной микроскопии и получение микрофотографии

  1. Перед визуализацией инкубируйте слайды в течение 10 минут на RT, покрытом светом.
  2. В конфокальном микроскопе поместите слайд в пластину лицевой стороной вниз.
  3. Сфокусируйте верхнее сплетение сосудистой системы сетчатки и выберите область для начала получения изображения.
  4. Установка общих параметров лазера в программном обеспечении: Длина волны: 488 нм; Интенсивность лазера; ВН; Смещение; Прибыль.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера, PMT, смещение и усиление могут варьироваться в зависимости от условий и использования лампы. Оптимальные настройки обеспечивают четкое изображение сосудов, избегая насыщения в чувствительности фотоумножителя трубки, имеющей линейную зависимость от флуоресцентного сигнала.
  5. Установите другие параметры сбора: Режим; Размер; Объектив, без масштабирования; Нет Кальмана; Размер шага.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации контрольных и экспериментальных образцов должны использоваться идентичные условия сбора.
  6. Установите координаты по осям x и y: сканирование сетчатки в фокусе 2x. Если область показывает сосуды, выделите ее, дважды щелкнув область, чтобы отметить ее для последующего получения изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется выбирать область сетчатки, следуя верхнему сосудистому сплетению, так как флуоресценция более крупных сосудов выше.
  7. Переместите сетку к соседнему квадрату, сфокусируйте сетчатку и выберите область, если она соответствует. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока выбранная область не составит всю сетчатку.
  8. Выберите одну область и задайте координаты по оси z, чтобы определить экстент толщины для сканирования. Для этого визуализируйте сетчатку в фокусе 2х; с помощью микрометра перейдите в верхнюю часть сетчатки и нажмите «Установить » в начальном положении. Затем переместитесь в нижнюю часть сетчатки и нажмите «Установить » в конечном положении.
  9. Повторите шаг 3.8 на каждой области, выбранной в сетке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы глубоко проверить отсканированную область, нажмите Go в начальном положении. Если сосуды все еще визуализированы, перенастройте положение, переместив микрометр, а затем нажмите «Установить». Повторите процесс в позиции End.
  10. Инициализируйте автоматическое сканирование.
  11. После завершения процесса сканирования откройте изображение.
  12. Выберите формат Series , чтобы записать изображение как мозаику и сохранить его с предпочтительным расширением. Наконец, сшитое изображение будет показано на экране.

4. Обработка изображений

  1. В программном обеспечении ImageJ FIJI перейдите в строку меню и нажмите «Файл > Открыть». Выберите изображение для обработки. В окне Параметры импорта биоформатов выберите Отображение метаданных OME-XML и нажмите кнопку ОК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения с похожим именем должны быть сохранены в отдельных папках.
  2. В окне Метаданные OME найдите информацию о размере пикселя с именами PhysicalSizeX, PhysicalSizeY и PhysicalSizeZ. Скопируйте эти данные.
  3. Для калибровки изображения перейдите в строку меню и выберите Image > Свойства. Скопируйте информацию об изображении на шаге 4.2 и нажмите OK. Изображение открывается в виде окна с несколькими фотографиями, каждая из которых представляет собой микрофотографы, полученные на оси z.
  4. Присвойте изображению предпочтительный лут, чтобы придать цвет флуоресцентной этикетке. Для этого перейдите в строку меню и нажмите на значок LUT .
  5. Чтобы визуализировать все стеки в одном изображении, перейдите в строку меню и выберите Image > Stacks > Z Project.
  6. В появившемся окне Z Projection выберите все стеки, в которых визуализируются сосуды. В поле Тип проекции выберите «Средняя интенсивность» и нажмите «ОК».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результат суммы стеков будет показан на новом изображении с именем AVG (имя изображения).
  7. Отрегулируйте яркость и контрастность в результирующем изображении, чтобы уменьшить фон и выделить сосуды. Перейдите в строку меню и нажмите «Изображение> «Настроить> «Яркость/Контрастность». В окнах B и C перемещайте стержни до тех пор, пока не будет наблюдаться лучшая интенсивность. Нажмите «Применить» и сохраните изменения.
  8. Скопируйте параметры, выбранные для параметров Яркость/Контрастность; они должны быть одинаковыми для всех изображений.
  9. Перед количественной оценкой изображения определите параметры, которые будут измеряться. В строке меню выберите Анализ > Набор измерений. В процедурах, описанных здесь, необходимо будет получить Площадь и Периметр (это в конечном итоге также необходимо для измерения расстояний). Нажмите OK.
  10. Загрузите плагин, необходимый для количественной оценки плотности сосудов17, и следуйте инструкциям по установке, предоставленным плагином.
  11. Продолжайте с количественной оценкой конкретного сосудистого параметра.

5. Количественная оценка аваскулярных областей

  1. В строке меню выберите инструмент «Палочка». Выберите область сетчатки, в которой отсутствуют сосуды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большие или меньшие области могут быть выбраны в зависимости от допуска. Чтобы настроить допуск, дважды нажмите на значок инструмента палочки. Используемый режим: Наследие.
  2. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Повторите шаги 5.1 и 5.2 со всеми аваскулярными областями сетчатки.
  3. Нажмите « Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить информацию об аваскулярной области. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На некоторых изображениях можно предпочесть выбрать аваскулярные области вручную. В этом случае выберите инструмент «Выделение полигонов», рисуйте короткие расстояния вокруг аваскулярной области и нажимайте на изображение, когда новое расстояние вот-вот начнется. Закройте выбранную область, нажав на первую точку.
  4. Повторите шаги 5.1, 5.2 и 5.3, чтобы измерить общую площадь сетчатки.
  5. Рассчитайте аваскулярную область сетчатки как сумму всех измеренных аваскулярных областей, деленную на общую площадь сетчатки.

6. Количественная оценка неоваскулярных областей

  1. В строке меню выберите инструмент «Палочка».
  2. Увеличьте масштаб изображения, чтобы лучше визуализировать неососуды. Выделите неососуды один за другим с помощью инструмента «Палочка».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте допуск не выше 20, чтобы обеспечить выбор одного неососуда. Этот уровень допуска должен оставаться постоянным во время всех количественных показателей изображения.
  3. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Повторите шаги 6.1 и 6.2 со всеми неоваскулярными областями сетчатки.
  4. Нажмите «Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить данные о области. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
  5. Повторите шаги 6.1, 6.2 и 6.3, чтобы количественно оценить общую площадь сетчатки.
  6. Рассчитайте неоваскулярную область сетчатки как сумму всех измеренных площадей неосколков, деленную на общую площадь сетчатки.

7. Количественная оценка диаметра сосуда

  1. В строке меню выберите инструмент «Прямая линия».
  2. Увеличьте изображение, чтобы лучше визуализировать стену сосуда. Выполните три поперечные линии к основному судну перед первой веткой. Это необходимо сделать, проведя линию от границы одной стенки сосуда к противоположной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линия должна быть идеально перпендикулярна стенке сосуда, чтобы избежать ошибок количественной оценки.
  3. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI. Повторите шаги 7.1 и 7.2 на всех судах, которые необходимо количественно оценить.
  4. Нажмите «Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить данные о расстоянии. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.

8. Количественная оценка извилистости судна

  1. В строке меню щелкните правой кнопкой мыши значок инструмента «Прямая линия» и выберите «Сегментированная линия» или «Линия от руки». Проведите линию внутри сосуда от зрительного нерва до первого разветвления сосуда после сосудистой формы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линия должна следовать за сосудистой формой, чтобы избежать ошибок количественной оценки.
  2. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.
  3. В строке меню выберите инструмент «Прямая линия». Проведите линию от зрительного нерва до первого разветвления сосуда.
  4. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.
  5. Нажмите «Измерить» в менеджере ROI, чтобы получить данные о расстояниях. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
  6. Рассчитайте индекс извилистости следующим образом: расстояние, полученное с помощью сегментированной линии, деленное на расстояние, полученное с помощью прямой линии.

9. Количественная оценка сосудистых ветвей

  1. С помощью овального инструмента строки меню определите область, применяемую одинаково ко всем экспериментальным условиям. Выбранная область должна представлять собой концентрический круг, нарисованный вокруг зрительного нерва.
  2. Нажмите букву T на клавиатуре, чтобы записать выбранную область в менеджере ROI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае рекомендуется сохранить РЕНТАБЕЛЬНОСТЬ ИНВЕСТИЦИЙ, так как количественная оценка медленная, и во всех изображениях должна использоваться одинаковая рентабельность инвестиций. Для этого в ROI Manager нажмите на MORE > Сохранить.
  3. Вручную подсчитайте количество первичных ветвей, возникающих из основных сосудов внутри зоны выбора.
  4. Повторите шаги 9.2 и 9.3 в соседних областях, сохраняя критерии зрительного нерва-периферии.

10. Количественная оценка плотности сосудов

  1. Преобразуйте изображение в 8-битный режим.
  2. Перейдите в плагины в строке меню, выберите Анализ сосудов > плотность сосудов.
  3. Определите область с помощью инструмента «Квадрат» строки меню, где необходимо измерить плотность сосуда. Нажмите OK.
  4. Программа отобразит новое окно с необходимой информацией. Скопируйте данные в другую программу или сохраните файл.
  5. Повторите шаги 10.2, 10.3 и 10.4 в соседних областях, сохраняя рентабельность инвестиций, но размещая ее девять раз, охватывая периферию и центр всей сетчатки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Как описано в разделе протокола, из одного флуоресцентного окрашивания можно получить морфологию сосудов и количественно оценить несколько интересующих параметров. Поиск конкретного изменения будет зависеть от типа изучаемой ретинопатии. В этой статье аваскулярные и неоваскулярные...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Животные модели ретинопатий являются мощными инструментами для изучения развития сосудов, ремоделирования или патологического ангиогенеза. Успех этих исследований в этой области зависит от легкого доступа к тканям, что позволяет выполнять широкий спектр методов, предоставляя данны?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Карлоса Маса, Марию Пилар Креспо и Сесилию Сампедро из CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Кордова, Аргентина) за помощь в конфокальной микроскопии, Соледад Миро и Викторию Бланко за специализированный уход за животными и Лауру Гатику за гистологическую помощь. Мы также благодарим Виктора Диаса (просекретаря по институциональной коммуникации FCQ) за производство и издание видео и Пола Хобсона за его критическое чтение и языковой пересмотр рукописи.

Эта статья финансировалась за счет грантов Секретариата по вопросам науки и технологии, Национального университета Кордовы (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Фонда научных исследований и технологий (FONCyT), Проекта исследований в области науки и технологии (PICT) 2015 N° 1314 (все до M.C.S.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aluminuim foil
Bovine Serum AlbuminMerckA4503quality
Calcium chloride dihydrateMerckC3306
Hydrochloric acidBiopack9632.08
Confocal Microscope FV1200OlympusFV1200with motorized plate
CoversPaul Marienfeld GmnH & Co.111520
Dissecting MicroscopeNIKONSMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrateMerck119753
200 µL  tubeMerckZ316121
Filter paperMerckWHA5201090
Incubator shaker GyroMiniLabNet InternationalS0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 ConjugateInvitrogenI21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)Merck475904
ParaformaldehydeMerck158127
pHmeterSANXINPHS-3D-03
Potassium chlorideMerckP9541
Potassium-dihydrogen phosphateMerck1,04,873
SlidesFisher Scientific12-550-15
Sodium chlorideMerckS3014
Sodium hydroxideMerckS5881
TrisMerckGE17-1321-01
Triton X-100MerckX100-1GA
Vessel Analysis Fiji softwareMai Elfarnawanyhttps://imagej.net/Vessel_Analysis

Ссылки

  1. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  2. McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
  3. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  4. Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
  5. Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164(2019).
  6. Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369(2021).
  7. Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
  8. Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
  9. Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
  10. Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
  11. Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
  12. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  13. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  14. Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
  15. Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987(2020).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
  18. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  19. Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279(2019).
  20. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  21. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  22. Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
  23. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  24. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  25. Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362(2016).
  26. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  27. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  28. Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
  29. Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
  30. Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
  31. Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916(2018).
  32. Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
  33. Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835(2021).
  34. Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
  35. Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены