Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt einen gut etablierten und reproduzierbaren Lektin-Färbungsassay für die gesamten Netzhautpräparate und die Protokolle, die für die quantitative Messung von Gefäßparametern erforderlich sind, die bei proliferativen und nicht-proliferativen Retinopathien häufig verändert sind.

Zusammenfassung

Retinopathien sind eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die das neurosensorische Gewebe des Auges betreffen. Sie sind gekennzeichnet durch Neurodegeneration, Gliose und eine fortschreitende Veränderung der Gefäßfunktion und -struktur. Obwohl der Beginn der Retinopathien durch subtile Störungen der visuellen Wahrnehmung gekennzeichnet ist, sind die Veränderungen im Gefäßplexus die ersten Anzeichen, die von Klinikern festgestellt werden. Das Fehlen oder Vorhandensein einer Neovaskularisation bestimmt, ob die Retinopathie entweder als nicht-proliferativ (NPDR) oder proliferativ (PDR) klassifiziert wird. In diesem Sinne versuchten mehrere Tiermodelle, spezifische vaskuläre Merkmale jedes Stadiums nachzuahmen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu bestimmen, die an Endothelveränderungen, neuronalem Tod und anderen Ereignissen in der Netzhaut beteiligt sind. In diesem Artikel werden wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren bereitstellen, die für die Messung der retinalen vaskulären Parameter bei Erwachsenen und Frühgeburtsmäusen am postnatalen Tag (P) 17 erforderlich sind. Wir werden die Protokolle zur Durchführung der retinalen Gefäßfärbung mit Isolectin GSA-IB4 in ganzen Halterungen für die spätere mikroskopische Visualisierung detailliert beschreiben. Wichtige Schritte für die Bildverarbeitung mit der Software Image J Fiji werden ebenfalls bereitgestellt, daher können die Leser Gefäßdichte, Durchmesser und Tortuosität, vaskuläre Verzweigung sowie avaskuläre und neovaskuläre Bereiche messen. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um vaskuläre Veränderungen sowohl bei nicht-proliferativen als auch bei proliferativen Retinopathien zu bewerten und zu quantifizieren.

Einleitung

Die Augen werden von zwei arterio-venösen Systemen genährt: dem choroidalen Gefäßsystem, einem externen vaskulären Netzwerk, das retinales pigmentiertes Epithel und Photorezeptoren bewässert; und das neuroretinale Gefäßsystem, das die Ganglienzellschicht und die innere Kernschicht der Netzhaut ^bewässert1. Das retinale Gefäßsystem ist ein organisiertes Netzwerk von Gefäßen, die Nährstoffe und Sauerstoff an die Netzhautzellen liefern und Abfallprodukte ernten, um eine ordnungsgemäße visuelle Signalübertragung zu gewährleisten. Dieses Gefäßsystem weist einige Besonderheiten auf, darunter: das Fehlen einer autonomen Innervation, die Regulierung des Gefäßtonus durch intrinsische Netzhautmechanismen und den Besitz einer komplexen Netzhaut-Blut-Schranke2. Daher stand das retinale Gefäßsystem im Mittelpunkt vieler Forscher, die nicht nur die Vaskulogenese während der Entwicklung, sondern auch die Veränderungen und die pathologische Angiogenese, die diese Gefäße bei Krankheiten durchlaufen, umfassend untersucht ^haben3. Die häufigsten vaskulären Veränderungen, die bei Retinopathien beobachtet werden, sind Gefäßdilatation, Neovaskularisation, Verlust der vaskulären Arborisierung und Deformation der netzhautlichen Hauptgefäße, was sie zickzaggiger ^macht4,5,6. Eine oder mehrere der beschriebenen Veränderungen sind die frühesten Anzeichen, die von Ärzten erkannt werden können. Die vaskuläre Visualisierung bietet eine schnelle, nicht-invasive und kostengünstige Screening-Methode7. Die umfangreiche Untersuchung der im Gefäßbaum beobachteten Veränderungen wird bestimmen, ob die Retinopathie nicht proliferativ oder proliferativ ist und die weitere Behandlung. Die nicht-proliferativen Retinopathien können sich unter anderem mit abweichender vaskulärer Morphologie, verminderter Gefäßdichte, azellulären Kapillaren, Perizytentod, Makulaödemen manifestieren. Darüber hinaus entwickeln proliferative Retinopathien auch eine erhöhte vaskuläre Permeabilität, extrazelluläres Remodeling und die Bildung von vaskulären Büscheln in Richtung der Glaskörperhöhle, die leicht abbauen oder eine Netzhautablösung induzieren8.

Einmal erkannt, kann die Retinopathie durch ihre Gefäßveränderungen überwacht ^werden9,10. Das Fortschreiten der Pathologie kann durch die strukturellen Veränderungen der Gefäße verfolgt werden, die die Stadien der Krankheit klar ^definieren11. Die Quantifizierung von Gefäßveränderungen in diesen Modellen ermöglichte es, Gefäßveränderungen und neuronalen Tod zu korrelieren und pharmakologische Therapien für Patienten in verschiedenen Phasen der Krankheit zu testen.

Im Lichte der obigen Aussagen sind wir der Ansicht, dass die Erkennung und Quantifizierung von Gefäßveränderungen in Retinopathiestudien von grundlegender Bedeutung ist. In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie man verschiedene vaskuläre Parameter misst. Dazu werden wir zwei Tiermodelle einsetzen. Eines davon ist das Sauerstoff-induzierte Retinopathie-Mausmodell12, das die Retinopathie der Frühgeburtlichkeit und einige Aspekte der proliferativen diabetischen Retinopathie nachahmt13,14. In diesem Modell werden wir avaskuläre Bereiche, neovaskuläre Bereiche und die Dilatation und Tortuosität der Hauptgefäße messen. In unserem Labor wurde ein Mausmodell für das Metabolische Syndrom (MetS) entwickelt, das eine nicht-proliferative Retinopathie ^induziert15. Hier werden wir die Gefäßdichte und Verzweigung bewerten.

Protokoll

C57BL/6J-Mäuse wurden gemäß den Richtlinien des ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research behandelt. Die experimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) der Fakultät für Chemische Wissenschaften der Nationalen Universität Córdoba entworfen und genehmigt (Res. HCD 1216/18).

1. Herstellung von Pufferlösungen und Reagenzien

1. Herstellung von 1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS): 8 g Natriumchlorid (NaCl), 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 14,4 g Dinatrium-Wasserstoffphosphat-Dihydrat (_{Na2HPO4 2H2O}) und 0,24 g Kalium-Dihydrogenphosphat (_KH2PO4) zu 800 mL destilliertem Wasser geben. Rühren Sie die Lösung bis zur vollständigen Auflösung der Salze um. Stellen Sie den pH-Wert mit Chloridsäure (HCl) auf 7,4 ein und stellen Sie das Volumen mit zusätzlichem destilliertem Wasser auf 1 L ein. Die Lösung wird filtriert und bei 4 °C gelagert.
2. Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA): 40 g festes PFA zu 800 ml frisch zubereitetem PBS geben. Rühren Sie die Lösung in einer Heizplatte bei einer konstanten Temperatur von 60 °C. Fügen Sie 1 M Natriumhydroxid (NaOH) hinzu, bis PFA vollständig gelöst ist, und überprüfen Sie, ob der pH-Wert in einem Bereich von 7,2-7,4 gehalten wird. Füllen Sie das Volumen mit PBS auf 1.000 ml auf und mischen Sie es. Schalten Sie die Heizplatte aus und filtern Sie die Lösung, wenn ihre Temperatur unter 35 °C liegt. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C für bis zu 3 Tage.
   VORSICHT: PFA ist schädlich, wenn es geschluckt oder eingeatmet wird und ist wahrscheinlich eine mutagene Verbindung. Verwenden Sie während des gesamten Prozesses Handschuhe und Gesichtsmaske und arbeiten Sie in einer Sicherheitskabine.
3. Herstellung von 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS): 6,1 g Tris und 9 g NaCl zu 800 mL destilliertem Wasser geben. Rühren Sie die Lösung bis zur vollständigen Auflösung der Salze um. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein und stellen Sie das Volumen mit zusätzlichem destilliertem Wasser auf 1 L ein. Die Lösung wird filtriert und bei 4 °C gelagert.
4. Herstellung von TBS- 0,1% Triton X-100: 0,1 ml TritonX-100 bis 100 ml TBS zugeben. Vorsichtig mischen und bei 4 °C bis zu 1 Woche aufbewahren.
   HINWEIS: Da Triton ein sehr dichtes Reinigungsmittel ist, schneiden Sie den Anschluss der Spitze für ein besseres Pipettieren leicht ab.
5. Herstellung von TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: 5 g BSA wiegen und TBS- 0,1% Triton X-100 Lösung bis zu einem Endvolumen von 100 ml hinzufügen. Vorsichtig umrühren. Aliquot und bei -20 °C bis zu 2 Monate lagern.
6. Isolectin GSA-IB4 Alexa Fluor-488 Konjugat (Isolectin GSA-IB4): Gewicht 36,75 mg Calciumchloriddihydrat (_CaCl2·_2H2O) und zu 500 ml frisch zubereitetem PBS geben. Rühren Sie die Lösung mit einem Rührstab um. 500 μL der _CaCl2/PBS-Lösung pipettieren und in die Durchstechflasche geben, die 500 μg lyophilisiertes Isolectin GSA-IB4-Pulver enthält. Mischen Sie die Lösung vorsichtig und aliquotieren Sie sie in 0,5 ml Röhrchen. Lagern Sie sie bei -20 °C lichtgeschützt.
7. Poly(vinylalkohol) in Glycerin/Tris: 2,4 g Poly(vinylalkohol) wiegen, 6 g Glycerin zugeben und vorsichtig umrühren. Dann fügen Sie 6 ml Wasser hinzu und rühren Sie mehrere Stunden bei Raumtemperatur weiter. 12 mL vorgewärmte 0,2 M Tris-Lösung (pH: 8,5) zugeben und bei einer konstanten Temperatur von 50 °C für 10 min erhitzen und gelegentlich mischen. Zum Schluss wird die Lösung zur Klärung 15 min bei 5.000 x g zentrifugiert.
   HINWEIS: Die Lösung bei Raumtemperatur abkühlen lassen, aliquotieren und bei -20 °C lagern.

2. Fluoreszierende Lektinfärbung

1. Wenn Mäuse durch Einatmen von Kohlendioxid (_CO2) opfern, enukleieren Sie die Augen mit einer ^Schere16. Fixieren Sie die enukleierten Augen mit frisch zubereiteten 4% PFA für 1 h bei Raumtemperatur (RT).
   HINWEIS: Die Fixierung kann auch durch Inkubation der Augen in 4% PFA über Nacht (ON) bei 4 °C erfolgen. Mäuse wurden gemäß den Richtlinien der ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung und des Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) der Fakultät für Chemische Wissenschaften der Nationalen Universität Córdoba (Res. HCD 1216/18) geopfert.
2. Entfernen Sie unter dem Seziermikroskop die Hornhaut mit einer Schere, indem Sie entlang des Limbus schneiden und die gesamte Netzhaut sezieren. Verwerfen Sie das vordere Segment des Auges und trennen Sie dann die Netzhaut von der RPE-Aderhaut.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die verbleibenden Ablagerungen und Hyaloidgefäße mit einer Pinzette aus der Netzhaut entfernen.
3. Legen Sie die Netzhaut in 200 μL Röhrchen. Anschließend wird die Netzhaut in 100 μL Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), die 5% Bovine Serum Albumin (BSA) und 0,1% Triton-X-100 enthält, während 6 h bei 4 °C mit sanfter Bewegung im Shaker blockiert und permeabilisiert.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann für 2 h bei RT durchgeführt werden.
4. Dann drehen Sie den Schlauch um, um die Netzhaut in die Kappe zu legen und die Blocklösung mit einer Pipette zu entfernen.
5. Fügen Sie 100 μL der Lösung hinzu, die 0,01 μg/μL Isolectin GSA-IB4 (GSA-IB4) enthält. Wickeln Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ein, um die Proben vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie die Netzhaut mit der Lektinlösung ON bei 4 °C oder für 2 h bei RT mit sanfter Bewegung im Shaker.
6. Waschen Sie die Netzhaut mit 100 μL TBS mit 0,1% Triton-X-100 für 20 min unter sanfter Bewegung im Shaker. Zum richtigen Waschen legen Sie die Netzhaut in die Kappe der Röhre, indem Sie sie umkehren. Bringen Sie das Rohr in seine stehende Position zurück und entfernen Sie das im Behälter verbleibende Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
7. Legen Sie die Netzhaut in einen Objektträger und fügen Sie einen Tropfen PBS hinzu. Führen Sie unter dem Seziermikroskop vier gleich weit entfernte Schnitte von den Rändern der Netzhaut in Richtung Sehnerv durch.
8. Um die Blütenblätter der Netzhaut zu entfalten, verwenden Sie eine Pinzette oder kleine Stücke Filterpapier. Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorseite nach unten zeigt.
9. Entfernen Sie die restliche PBS des Objektträgers mit Filterpapier. Fügen Sie dann ein Montagemedium (Poly (Vinylalkohol) in Glycerin / Tris) und einen Deckglas hinzu. Lassen Sie es 1 h bei RT trocknen.
10. Objektträger bei 4 °C lichtgeschützt aufbewahren.
    HINWEIS: Netzhaut kann auch in PBS bei 4 °C bis zur konfokalen Mikroskopievisualisierung gelagert werden.

3. Konfokale Mikroskopie-Visualisierung und Mikrofotografie-Erfassung

1. Vor der Visualisierung inkubieren Sie die Dias für 10 minuten bei RT, die von Licht bedeckt sind.
2. Legen Sie am konfokalen Mikroskop den Objektträger mit der Vorderseite nach unten in die Platte.
3. Fokussieren Sie den oberen Plexus des retinalen Gefäßsystems und wählen Sie einen Bereich aus, um die Bildaufnahme zu starten.
4. Stellen Sie allgemeine Laserparameter in der Software ein: Wellenlänge: 488 nm; Laserintensität; HV; Offset; Gewinnen.
   HINWEIS: Laserintensität, PMT, Offset und Verstärkung können je nach den Bedingungen und der Verwendung der Lampe variieren. Die optimalen Einstellungen liefern ein klares Bild der Gefäße, wobei die Sättigung der Empfindlichkeit der Photomultiplierröhre vermieden wird, um eine lineare Beziehung zum Fluoreszenzsignal zu haben.
5. Stellen Sie andere Erfassungsparameter ein: Modus; Größe; Objektiv, ohne Zoom; Kein Kalman; Schrittweite.
   HINWEIS: Für die Abbildung der Kontroll- und Versuchsproben müssen identische Erfassungsbedingungen verwendet werden.
6. Stellen Sie die Koordinaten in x- und y-Achse ein: Scannen Sie die Netzhaut 2x scharf. Wenn der Bereich Gefäße zeigt, wählen Sie ihn aus, indem Sie zweimal auf den Bereich klicken, um ihn für die spätere Bildaufnahme zu markieren.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, den Netzhautbereich auszuwählen, indem Sie dem oberen Gefäßplexus folgen, da die Fluoreszenz größerer Gefäße höher ist.
7. Bewegen Sie sich im Raster zu einem benachbarten Quadrat, fokussieren Sie die Netzhaut und wählen Sie den Bereich aus, wenn er entspricht. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis der ausgewählte Bereich die gesamte Netzhaut umfasst.
8. Wählen Sie einen Bereich aus und legen Sie die Koordinaten in der z-Achse fest, um die zu scannende Dickenausdehnung zu definieren. Visualisieren Sie dazu die Netzhaut 2x im Fokus; Gehen Sie mit dem Mikrometer an die Spitze der Netzhaut und klicken Sie in der Startposition auf Set . Bewegen Sie sich dann zur Unterseite der Netzhaut und klicken Sie auf Set in der Endposition.
9. Wiederholen Sie Schritt 3.8 in jedem im Raster ausgewählten Bereich.
   HINWEIS: Um den gescannten Bereich in der Tiefe zu überprüfen, drücken Sie an der Startposition Auf Gehe zu. Wenn Gefäße noch sichtbar sind, passen Sie die Position durch Bewegen des Mikrometers neu an und klicken Sie dann auf Festlegen. Wiederholen Sie den Vorgang an der Endposition.
10. Initialisieren Sie das automatisierte Scannen.
11. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie das Bild.
12. Wählen Sie das Serienformat aus, um das Bild als Mosaik aufzunehmen und mit der bevorzugten Erweiterung zu speichern. Schließlich wird das zusammengefügte Bild auf dem Bildschirm angezeigt.

4. Bildverarbeitung

1. Gehen Sie in der ImageJ FIJI-Software zur Menüleiste und klicken Sie auf Datei > Öffnen. Wählen Sie das zu bearbeitende Bild aus. Wählen Sie im Fenster Importoptionen für Bioformate die Option OME-XML-Metadaten anzeigen aus und klicken Sie auf OK.
   HINWEIS: Bilder mit ähnlichem Namen sollten in separaten Ordnern gespeichert werden.
2. Suchen Sie im Fenster OME-Metadaten nach den Pixelgrößeninformationen mit den Namen PhysicalSizeX, PhysicalSizeY und PhysicalSizeZ. Kopieren Sie diese Daten.
3. Gehen Sie zur Bildkalibrierung zur Menüleiste und wählen Sie > Eigenschaften. Kopieren Sie die Informationen des Bildes in Schritt 4.2 und klicken Sie auf OK. Das Bild öffnet sich als Fenster mit mehreren Fotos, wobei jedes die mit einer z-Achse aufgenommenen Mikrofotografien darstellt.
4. Weisen Sie dem Bild eine bevorzugte Lut zu, um eine Farbe an die fluoreszierende Markierung zu senden. Gehen Sie dazu zur Menüleiste und klicken Sie auf das LUT-Symbol .
5. Um alle Stapel in einem einzelnen Bild zu visualisieren, gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie Bild > Stapel > Z-Projekt.
6. Wählen Sie im angezeigten Fenster Z-Projektion alle Stapel aus, in denen Gefäße visualisiert werden. Wählen Sie unter Projektionstyp die Option Durchschnittliche Intensität und klicken Sie auf OK.
   HINWEIS: Das Ergebnis der Summe der Stapel wird in einem neuen Bild mit dem Namen AVG (Bildname) angezeigt.
7. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast im resultierenden Bild an, um den Hintergrund zu reduzieren und Gefäße hervorzuheben. Gehen Sie in die Menüleiste und klicken Sie auf Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast. In den B- und C-Fenstern bewegen Sie die Balken, bis eine bessere Intensität beobachtet wird. Klicken Sie auf Übernehmen und speichern Sie die Änderungen.
8. Kopieren Sie die für Helligkeit/Kontrast ausgewählten Parameter. diese müssen für alle Bilder identisch sein.
9. Definieren Sie vor der Bildquantifizierung die Parameter, die gemessen werden sollen. Wechseln Sie in der Menüleiste zu Messungen analysieren > festlegen. In den hier beschriebenen Verfahren wird es notwendig sein, Fläche und Umfang zu erhalten (dies wird letztendlich auch benötigt, um Entfernungen zu messen). Klicken Sie auf OK.
10. Laden Sie das für die Gefäßdichtequantifizierung erforderliche Plugin ^herunter17 und folgen Sie den Installationsanweisungen des Plugins.
11. Fahren Sie mit der Quantifizierung eines bestimmten vaskulären Parameters fort.

5. Quantifizierung avaskulärer Flächen

1. Wählen Sie in der Menüleiste das Zauberstab-Tool aus. Wählen Sie den Netzhautbereich aus, dem Gefäße fehlen.
   HINWEIS: Je nach Toleranz können größere oder kleinere Bereiche ausgewählt werden. Um die Toleranz anzupassen, klicken Sie zweimal auf das Zauberstab-Werkzeugsymbol. Verwendeter Modus: Legacy.
2. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wiederholen Sie die Schritte 5.1 und 5.2 mit allen avaskulären Bereichen der Netzhaut.
3. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um die avaskulären Bereichsinformationen zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
   HINWEIS: In einigen Bildern kann man es vorziehen, die avaskulären Bereiche manuell auszuwählen. Wählen Sie in diesem Fall das Polygonauswahl-Werkzeug, zeichnen Sie kurze Entfernungen um den avaskulären Bereich und klicken Sie auf das Bild, wenn eine neue Entfernung beginnt. Schließen Sie den ausgewählten Bereich, indem Sie auf den ersten Punkt klicken.
4. Wiederholen Sie die Schritte 5.1, 5.2 und 5.3, um die Gesamtfläche der Netzhaut zu messen.
5. Berechnen Sie die avaskuläre Fläche der Netzhaut als Summe aller gemessenen avaskulären Bereiche geteilt durch die Gesamtfläche der Netzhaut.

6. Quantifizierung neovaskulärer Bereiche

1. Wählen Sie in der Menüleiste das Werkzeug Zauberstab aus.
2. Zoomen Sie in das Bild, um Neoschiffe besser zu visualisieren. Wählen Sie die Neoschiffe nacheinander mit dem Zauberstabwerkzeug aus.
   HINWEIS: Stellen Sie die Toleranz nicht höher als 20 ein, um die Auswahl eines einzelnen Neoschiffes sicherzustellen. Diese Toleranzstufe muss bei allen Bildquantifizierungen konstant bleiben.
3. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 und 6.2 mit allen neovaskulären Bereichen der Netzhaut.
4. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um die Flächendaten zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
5. Wiederholen Sie die Schritte 6.1, 6.2 und 6.3, um die Gesamtfläche der Netzhaut zu quantifizieren.
6. Berechnen Sie den neovaskulären Bereich der Netzhaut als Summe aller gemessenen Bereiche der Neoschiffe dividiert durch die Gesamtfläche der Netzhaut.

7. Quantifizierung des Gefäßdurchmessers

1. Wählen Sie in der Menüleiste das Geradeaus-Werkzeug aus.
2. Zoomen Sie in das Bild, um die Gefäßwand besser zu visualisieren. Führen Sie vor dem ersten Zweig drei Querlinien zum Hauptschiff durch. Dies muss geschehen, indem eine Linie von der Grenze einer Wand des Gefäßes zur gegenüberliegenden gezogen wird.
   HINWEIS: Die Linie muss perfekt senkrecht zum Wandgefäß stehen, um Quantifizierungsfehler zu vermeiden.
3. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 und 7.2 in allen behältern, die quantifiziert werden müssen.
4. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen , um die Entfernungsdaten zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.

8. Quantifizierung der Gefäßtortuosität

1. Klicken Sie in der Menüleiste mit der rechten Maustaste auf das Symbol Straight-Line Tool und wählen Sie Segmentierte Linie oder Freihandlinie. Zeichnen Sie eine Linie innerhalb des Gefäßes vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung, die der Gefäßform folgt.
   HINWEIS: Die Linie muss der Gefäßform folgen, um Quantifizierungsfehler zu vermeiden.
2. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.
3. Wählen Sie in der Menüleiste das Geradeaus-Werkzeug aus. Zeichnen Sie eine Linie vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung.
4. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.
5. Klicken Sie im ROI Manager auf Messen , um die Entfernungsdaten zu erhalten. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
6. Berechnen Sie den Tortuositätsindex wie folgt: Entfernung, die mit segmentierter Linie erhalten wird, dividiert durch den mit gerader Linie erhaltenen Abstand.

9. Quantifizierung der Gefäßverzweigung

1. Definieren Sie mit dem Ovalwerkzeug der Menüleiste einen Bereich, der auf alle experimentellen Bedingungen gleichermaßen angewendet wird. Der ausgewählte Bereich muss ein konzentrischer Kreis sein, der um den Sehnerv gezogen wird.
2. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.
   HINWEIS: In diesem Fall ist es empfehlenswert, den ROI zu speichern, da die Quantifizierung langsam ist und der identische ROI in allen Bildern verwendet werden muss. Klicken Sie dazu im ROI Manager auf MEHR > Speichern.
3. Zählen Sie manuell die Anzahl der primären Zweige, die aus hauptschiffen innerhalb des Auswahlbereichs entstehen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 9.2 und 9.3 in benachbarten Bereichen, wobei die Kriterien für die Sehnervenperipherie beibehalten werden.

10. Quantifizierung der Gefäßdichte

1. Transformieren Sie das Bild in den 8-Bit-Modus.
2. Gehen Sie in der Menüleiste zu Plugins und wählen Sie Gefäßanalyse > Gefäßdichte.
3. Definieren Sie mit dem Quadrat-Werkzeug der Menüleiste einen Bereich, in dem die Gefäßdichte gemessen werden muss. Klicken Sie auf OK.
4. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Kopieren Sie die Daten in ein anderes Programm oder speichern Sie die Datei.
5. Wiederholen Sie die Schritte 10.2, 10.3 und 10.4 in den benachbarten Bereichen, wobei Sie den ROI beibehalten, aber neunmal die Peripherie und das Zentrum der gesamten Netzhaut umfassen.

Ergebnisse

Wie im Protokollabschnitt beschrieben, können Sie aus einem einzigen Fluoreszenzfärbungsassay die vaskuläre Morphologie erhalten und mehrere Parameter von Interesse quantitativ bewerten. Die Suche nach einer spezifischen Veränderung hängt von der Art der untersuchten Retinopathie ab. In diesem Artikel wurden avaskuläre und neovaskuläre Bereiche, Tortuosität und Dilatation in einem Mausmodell der proliferativen Retinopathie bewertet, während die vaskuläre Verzweigung und Dichte in einem MetS-Mausmodell analysier...

Diskussion

Tiermodelle von Retinopathien sind leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der Gefäßentwicklung, des Remodelings oder der pathologischen Angiogenese. Der Erfolg dieser Studien auf diesem Gebiet beruht auf dem einfachen Zugang zum Gewebe, der es ermöglicht, eine Vielzahl von Techniken durchzuführen und Daten von In-vivo- und postmortalen Mäusen zu ^liefern26,27. Darüber hinaus wurde eine große Korrelation zwischen In-vivo-Studien

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis