Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

Riepilogo

Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l'intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.

Abstract

Le retinopatie sono un gruppo eterogeneo di malattie che colpiscono il tessuto neurosensoriale dell'occhio. Sono caratterizzati da neurodegenerazione, gliosi e un progressivo cambiamento della funzione e della struttura vascolare. Sebbene l'insorgenza delle retinopatie sia caratterizzata da sottili disturbi nella percezione visiva, le modifiche nel plesso vascolare sono i primi segni rilevati dai medici. L'assenza o la presenza di neovascolarizzazione determina se la retinopatia è classificata come non proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). In questo senso, diversi modelli animali hanno cercato di imitare specifiche caratteristiche vascolari di ogni stadio per determinare i meccanismi sottostanti coinvolti nelle alterazioni dell'endotelio, nella morte neuronale e in altri eventi che si verificano nella retina. In questo articolo, forniremo una descrizione completa delle procedure necessarie per la misurazione dei parametri vascolari retinici negli adulti e nei topi di parto precoce al giorno postnatale (P)17. Descriveremo in dettaglio i protocolli per eseguire la colorazione vascolare retinica con Isolectina GSA-IB4 in supporti interi per una successiva visualizzazione microscopica. Vengono inoltre forniti passaggi chiave per l'elaborazione delle immagini con il software Image J Fiji, pertanto i lettori saranno in grado di misurare la densità del vaso, il diametro e la tortuosità, la ramificazione vascolare e le aree avascolari e neovascolari. Questi strumenti sono molto utili per valutare e quantificare le alterazioni vascolari sia nelle retinopatie non proliferative che in quelle proliferative.

Introduzione

Gli occhi sono nutriti da due sistemi arterio-venosi: la vascolarizzazione coroidale, una rete vascolare esterna che irriga l'epitelio pigmentato retinico e i fotorecettori; e la vascolarizzazione neuro-retinica che irriga lo strato di cellule gangliari e lo strato nucleare interno della ^retina1. La vascolarizzazione retinica è una rete organizzata di vasi che forniscono nutrienti e ossigeno alle cellule retiniche e raccolgono prodotti di scarto per garantire una corretta trasduzione della segnalazione visiva. Questa vascolarizzazione ha alcune caratteristiche distinte, tra cui: la mancanza di innervazione autonoma, la regolazione del tono vascolare da meccanismi retinici intrinseci e il possesso di una complessa barriera retinico-ematica2. Pertanto, la vascolarizzazione retinica è stata al centro di molti ricercatori che hanno ampiamente studiato non solo la vasculogenesi durante lo sviluppo, ma anche le alterazioni e l'angiogenesi patologica che questi vasi subiscono nelle ^malattie3. I cambiamenti vascolari più comuni osservati nelle retinopatie sono la dilatazione dei vasi, la neovascolarizzazione, la perdita di arborizzazione vascolare e la deformazione dei vasi principali della retina, che li rende più ziggaggy4,5,6. Una o più delle alterazioni descritte sono i primi segni che devono essere rilevati dai medici. La visualizzazione vascolare fornisce un metodo di screening rapido, non invasivo ed ^economico7. Lo studio approfondito delle alterazioni osservate nell'albero vascolare determinerà se la retinopatia non è proliferativa o proliferativa e l'ulteriore trattamento. Le retinopatie non proliferative possono manifestarsi con morfologia vascolare aberrante, diminuzione della densità vascolare, capillari acellulari, morte dei periciti, edema maculare, tra gli altri. Inoltre, le retinopatie proliferative sviluppano anche una maggiore permeabilità vascolare, rimodellamento extracellulare e formazione di ciuffi vascolari verso la cavità vitrea che facilmente si rompono o inducono il distacco della ^retina8.

Una volta rilevata, la retinopatia può essere monitorata attraverso i suoi cambiamenti ^{vascolari9,10}. La progressione della patologia può essere seguita attraverso i cambiamenti strutturali dei vasi, che definiscono chiaramente le fasi della ^malattia11. La quantificazione delle alterazioni vascolari in questi modelli ha permesso di correlare i cambiamenti vascolari e la morte neuronale e di testare terapie farmacologiche per pazienti in diverse fasi della malattia.

Alla luce delle affermazioni di cui sopra, riteniamo che il riconoscimento e la quantificazione delle alterazioni vascolari siano fondamentali negli studi sulle retinopatie. In questo lavoro, mostreremo come misurare diversi parametri vascolari. Per fare ciò, impiegheremo due modelli animali. Uno di questi è il modello murino di retinopatia indotta da ^ossigeno12, che imita la retinopatia della prematurità e alcuni aspetti della retinopatia diabetica proliferativa13,14. In questo modello, misureremo le aree avascolare, le aree neovascolari e la dilatazione e la tortuosità dei vasi principali. Nel nostro laboratorio è stato sviluppato un modello murino di Sindrome Metabolica (MetS), che induce una retinopatia non ^{proliferativa15}. Qui, valuteremo la densità vascolare e la ramificazione.

Protocollo

I topi C57BL / 6J sono stati gestiti secondo le linee guida della dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. Le procedure sperimentali sono state progettate e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (CICUAL) della Facoltà di Scienze Chimiche, Università Nazionale di Córdoba (Res. HCD 1216/18).

1. Preparazione di soluzioni tampone e reagenti

1. Preparazione di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS): Aggiungere 8 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,2 g di cloruro di potassio (KCl), 14,4 g di disodio-idrogeno-fosfato diidrato (_{Na2HPO4 2H2O}) e 0,24 g di potassio-diidrogeno fosfato (_KH2PO4) a 800 ml di acqua distillata. Mescolare la soluzione fino alla completa dissoluzione dei sali. Regolare il pH a 7,4 con acido clorurato (HCl) e regolare il volume a 1 L con acqua distillata aggiuntiva. Filtrare la soluzione e conservarla a 4 °C.
2. Preparazione di paraformaldeide al 4% (PFA): aggiungere 40 g di PFA solido a 800 ml di PBS appena preparato. Mescolare la soluzione in una piastra riscaldante ad una temperatura costante di 60 °C. Aggiungere 1 M di idrossido di sodio (NaOH) fino a completa dissoluzione del PFA, controllando che il pH sia mantenuto in un intervallo di 7,2-7,4. Ricaricare il volume a 1.000 ml con PBS e mixare. Spegnere la piastra riscaldante e filtrare la soluzione quando la sua temperatura è inferiore a 35 °C. Conservare la soluzione a 4 °C per un massimo di 3 giorni.
   ATTENZIONE: Il PFA è dannoso se ingerito o se inalato ed è probabilmente un composto mutageno. Utilizzare guanti e mascherina durante l'intero processo e lavorare in una cabina di sicurezza.
3. Preparazione di 1x soluzione salina tamponata con Tris (TBS): aggiungere 6,1 g di Tris e 9 g di NaCl a 800 ml di acqua distillata. Mescolare la soluzione fino alla completa dissoluzione dei sali. Regolare il pH a 7,4 con HCl e regolare il volume a 1 L con acqua distillata aggiuntiva. Filtrare la soluzione e conservarla a 4 °C.
4. Preparazione di TBS- 0,1% Triton X-100: Aggiungere 0,1 mL di TritonX-100 a 100 mL di TBS. Mescolare delicatamente e conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
   NOTA: Poiché Triton è un detergente molto denso, tagliare leggermente il terminale della punta per un migliore pipettaggio.
5. Preparazione di TBS-5%-Albumina sierica bovina (BSA) -0,1% Triton-X-100: Pesare 5 g di BSA e aggiungere la soluzione tbs-0,1% di tritone X-100 fino a un volume finale di 100 ml. Mescolare delicatamente. Aliquota e conservare a -20 °C per un massimo di 2 mesi.
6. Isolectina GSA-IB4 Alexa fluor-488 coniugato (Isolectina GSA-IB4): Peso 36,75 mg di cloruro di calcio diidrato (_CaCl2·_2H2O) e aggiungerlo a 500 ml di PBS appena preparato. Mescolare la soluzione con una barra di agitazione. Pipettare 500 μL della soluzione di _CaCl2/PBS e aggiungerlo al flaconcino contenente 500 μg di Isolectina GSA-IB4 liofilizzata in polvere. Mescolare delicatamente e aliquotare la soluzione in tubi da 0,5 ml. Conservarli a -20 °C al riparo dalla luce.
7. Poli(alcool vinilico) in glicerolo/Tris: Pesare 2,4 g di Poly(alcool vinilico), aggiungere 6 g di glicerolo e mescolare delicatamente. Quindi, aggiungere 6 ml di acqua e continuare a mescolare per diverse ore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di soluzione Tris preriscaldata da 0,2 M (pH: 8,5) e riscaldare a una temperatura costante di 50 °C per 10 minuti e mescolare di tanto in tanto. Infine, centrifugare la soluzione a 5.000 x g per 15 minuti per la chiarificazione.
   NOTA: Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, aliquotarla e conservarla a -20 °C.

2. Colorazione fluorescente della lectina

1. Dopo il sacrificio dei topi per inalazione di anidride carbonica (_CO2), enucleare gli occhi con le ^forbici16. Fissare gli occhi enucleati con PFA al 4% appena preparato per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: La fissazione può essere eseguita anche incubando gli occhi in PFA al 4% durante la notte (ON) a 4 °C. I topi sono stati sacrificati secondo le linee guida della Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (CICUAL) della Facoltà di Scienze Chimiche, Università Nazionale di Córdoba (Res. HCD 1216/18).
2. Sotto il microscopio sezionante, rimuovere le cornee con le forbici tagliando lungo il limbus e sezionare l'intera retina. Scartare il segmento anteriore dell'occhio e quindi separare la retina dalla coroide RPE.
   NOTA: Assicurarsi di rimuovere i detriti rimanenti e i vasi ialoidi dalla retina con una pinza.
3. Posizionare le retine in tubi da 200 μL. Quindi, bloccare e permeabilizzare le retine in 100 μL di soluzione salina tamponata con Tris (TBS) contenente il 5% di albumina sierica bovina (BSA) e lo 0,1% di Triton-X-100 durante 6 ore a 4 °C con una leggera agitazione nello shaker.
   NOTA: questo passaggio può essere eseguito per 2 ore a RT.
4. Quindi, invertire il tubo per posizionare la retina nel cappuccio e rimuovere la soluzione di blocco con una pipetta.
5. Aggiungere 100 μL della soluzione contenente 0,01 μg/μL di Isolectina GSA-IB4 (GSA-IB4). Avvolgere i tubi con un foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce. Incubare le retine con la soluzione di lectina ON a 4 °C o per 2 ore a RT con una delicata agitazione nello shaker.
6. Lavare la retina con 100 μL di TBS contenente lo 0,1% di Triton-X-100 per 20 minuti con una leggera agitazione nello shaker. Per un corretto lavaggio, posizionare la retina nel cappuccio del tubo invertendolo. Riportare il tubo nella sua posizione eretta e rimuovere il mezzo rimasto nel contenitore. Ripetere questo passaggio tre volte.
7. Posizionare la retina in un vetrino e aggiungere una goccia di PBS. Sotto il microscopio di dissezione, eseguire quattro tagli ugualmente distanti dai bordi della retina verso il nervo ottico.
8. Per aprire i petali della retina, utilizzare una pinza o piccoli pezzi di carta da filtro. Assicurarsi che il lato del fotorecettore sia rivolto verso il basso.
9. Rimuovere il PBS rimanente della diapositiva con carta da filtro. Quindi, aggiungere un mezzo di montaggio (Poly (alcool vinilico) in glicerolo / Tris) e coverslip. Lasciare asciugare per 1 ora a RT.
10. Conservare i vetrini a 4 °C al riparo dalla luce.
    NOTA: le retine possono anche essere conservate in PBS a 4 °C fino alla visualizzazione al microscopio confocale.

3. Visualizzazione al microscopio confocale e acquisizione microfotografica

1. Prima della visualizzazione, incubare le diapositive per 10 minuti a RT coperto dalla luce.
2. Al microscopio confocale, posizionare il vetrino nella piastra a faccia in giù.
3. Focalizzare il plesso superiore della vascolarizzazione retinica e selezionare un'area per avviare l'acquisizione dell'immagine.
4. Impostare i parametri laser generali nel software: Lunghezza d'onda: 488 nm; Intensità laser; HV; Offset; Guadagnare.
   NOTA: l'intensità del laser, il PMT, l'offset e il guadagno possono variare a seconda delle condizioni e dell'utilizzo della lampada. Le impostazioni ottimali forniscono un'immagine chiara dei vasi evitando la saturazione nella sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per avere una relazione lineare con il segnale di fluorescenza.
5. Impostare altri parametri di acquisizione: Modalità; Dimensioni; Obiettivo, senza zoom; No Kalman; Dimensione del passo.
   NOTA: per l'imaging dei campioni di controllo e sperimentali devono essere utilizzate condizioni di acquisizione identiche.
6. Imposta le coordinate sull'asse x e y: scansiona la retina a fuoco 2x. Se l'area mostra vasi, selezionarla facendo clic due volte sull'area per contrassegnarla per l'acquisizione successiva dell'immagine.
   NOTA: Si consiglia vivamente di selezionare l'area retinica seguendo il plesso vascolare superiore poiché la fluorescenza dei vasi più grandi è più alta.
7. Spostati nella griglia in un quadrato vicino, focalizza la retina e seleziona l'area se corrisponde. Ripetere questo passaggio fino a quando l'area selezionata comprende l'intera retina.
8. Selezionate un'area e impostate le coordinate nell'asse z per definire l'estensione dello spessore da scansionare. Per fare questo, visualizzare la retina a fuoco 2x; con il micrometro, vai nella parte superiore della retina e fai clic su Imposta in posizione Start. Quindi, spostati nella parte inferiore della retina e fai clic su Imposta in posizione finale.
9. Ripetere il passaggio 3.8 in ogni area selezionata nella griglia.
   NOTA: per verificare in profondità l'area scansionata, premere Vai nella posizione Iniziale. Se le navi sono ancora visualizzate, regola nuovamente la posizione spostando il micrometro, quindi fai clic su Imposta. Ripetete il processo nella posizione Fine.
10. Inizializzare la scansione automatica.
11. Una volta terminato il processo di scansione, apri l'immagine.
12. Seleziona il formato Serie per registrare l'immagine come Mosaico e salvarla con l'estensione preferita. Infine, l'immagine cucita verrà mostrata sullo schermo.

4. Elaborazione delle immagini

1. Nel software ImageJ FIJI, vai alla barra dei menu e fai clic su File > Apri. Selezionare l'immagine da elaborare. Nella finestra Opzioni di importazione bioformati , selezionare Visualizza metadati OME-XML e fare clic su OK.
   NOTA: le immagini con nome simile devono essere salvate in cartelle separate.
2. Nella finestra Metadati OME , cercare le informazioni sulla dimensione dei pixel, denominate PhysicalSizeX, PhysicalSizeY e PhysicalSizeZ. Copiare questi dati.
3. Per la calibrazione dell'immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Proprietà > immagine. Copiare le informazioni dell'immagine nel passaggio 4.2 e fare clic su OK. L'immagine si apre come una finestra con diverse foto, dove ognuna rappresenta le microfotografie acquisite su un asse z.
4. Assegna una lut preferita all'immagine per consegnare un colore all'etichetta fluorescente. Per fare ciò, vai alla barra dei menu e fai clic sull'icona LUT .
5. Per visualizzare tutte le pile in una singola immagine, vai alla barra dei menu e seleziona Immagine > Stack > progetto Z.
6. Nella finestra Proiezione Z visualizzata, selezionare tutte le pile in cui vengono visualizzate le navi. In Tipo di proiezione, selezionate Intensità media (Average Intensity ) e fate clic su OK.
   NOTA: il risultato della somma degli stack verrà visualizzato in una nuova immagine denominata AVG (nome immagine).
7. Regola la luminosità e il contrasto nell'immagine risultante per ridurre lo sfondo e mettere in evidenza i vasi. Vai alla barra dei menu e fai clic su Immagine> Regola> Luminosità / Contrasto. Nelle finestre B e C spostare le barre fino a quando non si osserva una migliore intensità. Fare clic su Applica e salvare le modifiche.
8. Copiare i parametri selezionati per Luminosità/Contrasto; questi devono essere identici per tutte le immagini.
9. Prima della quantificazione dell'immagine, definire i parametri che verranno misurati. Nella barra dei menu, vai ad Analizza > imposta misurazioni. Nelle procedure qui descritte, sarà necessario ottenere Area e Perimetro (questo è in definitiva necessario anche per misurare le distanze). Fare clic su OK.
10. Scarica il plugin necessario per la quantificazione della densità del ^vaso17 e segui le istruzioni di installazione fornite dal plugin.
11. Continuare con la quantificazione di uno specifico parametro vascolare.

5. Quantificazione delle aree avascolare

1. Nella barra dei menu, scegliere lo strumento bacchetta. Seleziona l'area retinica che manca di vasi.
   NOTA: è possibile selezionare aree più grandi o più piccole a seconda della tolleranza. Per regolare la tolleranza, fate clic due volte sull'icona dello strumento bacchetta. Modalità impiegata: Legacy.
2. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Ripetere i passaggi 5.1 e 5.2 con tutte le aree avascolari della retina.
3. Fare clic su Misura nel ROI manager per ottenere le informazioni sull'area avascolare. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
   NOTA: In alcune immagini, si potrebbe preferire selezionare manualmente le aree avascolare. In questo caso, scegliete lo strumento Selezione poligono, disegnate brevi distanze attorno all'area avascolare e fate clic sull'immagine quando sta per iniziare una nuova distanza. Chiudete l'area selezionata facendo clic sul primo punto.
4. Ripetere i passaggi 5.1, 5.2 e 5.3 per misurare l'area totale della retina.
5. Calcola l'area avascolare della retina come somma di tutte le aree avascolari misurate divise per l'area totale della retina.

6. Quantificazione delle aree neovascolari

1. Nella barra dei menu scegliere lo strumento bacchetta.
2. Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio i neovasi. Seleziona i neovasi uno per uno con lo strumento bacchetta.
   NOTA: Regolare la tolleranza non superiore a 20 per garantire la selezione di un singolo neovaso. Questo livello di tolleranza deve rimanere costante durante tutte le quantificazioni dell'immagine.
3. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Ripetere i passaggi 6.1 e 6.2 con tutte le aree neovascolari della retina.
4. Fare clic su Misura nel ROI manager per ottenere i dati dell'area. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
5. Ripetere i passaggi 6.1, 6.2 e 6.3 per quantificare l'area totale della retina.
6. Calcola l'area neovascolare della retina come somma di tutte le aree dei neovasi misurate divise per l'area totale della retina.

7. Quantificazione del diametro del recipiente

1. Nella barra dei menu, selezionate lo strumento linea retta.
2. Ingrandisci l'immagine per visualizzare meglio la parete della nave. Eseguire tre linee trasversali alla nave principale prima del primo ramo. Questo deve essere fatto disegnando una linea dal confine di una parete della nave al contrario.
   NOTA: La linea deve essere perfettamente perpendicolare al recipiente a parete per evitare errori di quantificazione.
3. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager. Ripetere i passaggi 7.1 e 7.2 in tutti i recipienti che devono essere quantificati.
4. Fare clic su Misura nel roi manager per ottenere i dati sulla distanza. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.

8. Quantificazione della tortuosità della nave

1. Nella barra dei menu, fare clic sull'icona Strumento linea diritta con il tasto destro del mouse e selezionare Linea segmentata o Linea a mano libera. Tracciare una linea all'interno del vaso dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso che segue la forma vascolare.
   NOTA: La linea deve seguire la forma vascolare per evitare errori di quantificazione.
2. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.
3. Nella barra dei menu, selezionate lo strumento linea retta. Disegna una linea dal nervo ottico fino alla prima ramificazione del vaso.
4. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.
5. Clicca su Misura nel ROI Manager per ottenere i dati sulle distanze. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
6. Calcola l'indice di tortuosità come segue: distanza ottenuta con linea segmentata divisa per la distanza ottenuta con linea retta.

9. Quantificazione delle ramificazioni vascolari

1. Con lo strumento ovale della barra dei menu, definire un'area applicata equamente a tutte le condizioni sperimentali. L'area selezionata deve essere un cerchio concentrico disegnato attorno al nervo ottico.
2. Premere la lettera T sulla tastiera per registrare l'area selezionata in ROI Manager.
   NOTA: in questo caso, si consiglia di salvare il ROI poiché la quantificazione è lenta e il ROI identico deve essere utilizzato in tutte le immagini. Per fare ciò, nel ROI Manager clicca su ALTRO > Salva.
3. Contare manualmente il numero di rami primari derivanti dalle navi principali all'interno dell'area di selezione.
4. Ripetere i passaggi 9.2 e 9.3 nelle aree vicine, mantenendo i criteri nervo ottico-periferia.

10. Quantificazione della densità vascolare

1. Trasforma l'immagine in modalità a 8 bit.
2. Vai a Plugin nella barra dei menu, seleziona Analisi dei vasi > densità vascolare.
3. Definite un'area con lo strumento quadrato della barra dei menu, in cui è necessario misurare la densità del recipiente. Fare clic su OK.
4. Il programma visualizzerà una nuova finestra con le informazioni richieste. Copiare i dati in un altro programma o salvare il file.
5. Ripeti i passaggi 10.2, 10.3 e 10.4 nelle aree vicine, mantenendo il ROI ma posizionandolo nove volte comprendendo la periferia e il centro dell'intera retina.

Risultati

Come descritto nella sezione protocollo, da un singolo test di colorazione fluorescente è possibile ottenere la morfologia vascolare e valutare quantitativamente diversi parametri di interesse. La ricerca di un'alterazione specifica dipenderà dal tipo di retinopatia studiata. In questo articolo, le aree avascolare e neovascolare, la tortuosità e la dilatazione sono state valutate in un modello murino di retinopatia proliferativa, mentre la ramificazione e la densità vascolare sono state analizzate in un modello murin...

Discussione

I modelli animali di retinopatie sono potenti strumenti per studiare lo sviluppo vascolare, il rimodellamento o l'angiogenesi patologica. Il successo di questi studi sul campo si basa sul facile accesso al tessuto che consente di eseguire un'ampia varietà di tecniche, fornendo dati da topi in vivo e post mortem26,27. Inoltre, è stata trovata una grande correlazione tra studi in vivo e analisi cliniche, fornendo una solida tracciabilit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis