Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Resumen

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Resumen

Las retinopatías son un grupo heterogéneo de enfermedades que afectan al tejido neurosensorial del ojo. Se caracterizan por neurodegeneración, gliosis y un cambio progresivo en la función y estructura vascular. Aunque el inicio de las retinopatías se caracteriza por alteraciones sutiles en la percepción visual, las modificaciones en el plexo vascular son los primeros signos detectados por los médicos. La ausencia o presencia de neovascularización determina si la retinopatía se clasifica como no proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). En este sentido, varios modelos animales intentaron imitar características vasculares específicas de cada etapa para determinar los mecanismos subyacentes involucrados en las alteraciones del endotelio, la muerte neuronal y otros eventos que tienen lugar en la retina. En este artículo, proporcionaremos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de los parámetros vasculares de la retina en adultos y ratones de nacimiento prematuro en el día postnatal (P)17. Detallaremos los protocolos para llevar a cabo la tinción vascular retiniana con Isolectina GSA-IB4 en monturas enteras para su posterior visualización microscópica. También se proporcionan pasos clave para el procesamiento de imágenes con el software Image J Fiji, por lo tanto, los lectores podrán medir la densidad de los vasos, el diámetro y la tortuosidad, la ramificación vascular, así como las áreas avasculares y neovasculares. Estas herramientas son de gran ayuda para evaluar y cuantificar las alteraciones vasculares tanto en las retinopatías no proliferativas como en las proliferativas.

Introducción

Los ojos se nutren de dos sistemas arterio-venosos: la vasculatura coroidea, una red vascular externa que riega el epitelio pigmentado de la retina y los fotorreceptores; y la vasculatura neurorretiniana que irriga la capa de células ganglionares y la capa nuclear interna de la ^retina1. La vasculatura retiniana es una red organizada de vasos que suministran nutrientes y oxígeno a las células de la retina y cosechan productos de desecho para garantizar la transducción adecuada de la señalización visual. Esta vasculatura tiene algunas características distintivas, entre ellas: la falta de inervación autónoma, la regulación del tono vascular por mecanismos retinianos intrínsecos y la posesión de una compleja barrera retiniano-sanguínea2. Por ello, la vasculatura retiniana ha sido el foco de muchos investigadores que han estudiado ampliamente no solo la vasculogénesis durante el desarrollo, sino también las alteraciones y la angiogénesis patológica que sufren estos vasos en las ^{enfermedades3}. Los cambios vasculares más frecuentes observados en las retinopatías son la dilatación de los vasos, la neovascularización, la pérdida de arborización vascular y la deformación de los vasos principales de la retina, lo que los hace más ziggaggy4,5,6. Una o más de las alteraciones descritas son los primeros signos detectados por los médicos. La visualización vascular proporciona un método de detección rápido, no invasivo y ^económico7. El estudio exhaustivo de las alteraciones observadas en el árbol vascular determinará si la retinopatía es no proliferativa o proliferativa y el tratamiento posterior. Las retinopatías no proliferativas pueden manifestarse con morfología vascular aberrante, disminución de la densidad vascular, capilares acelulares, muerte de pericitos, edema macular, entre otros. Además, las retinopatías proliferativas también desarrollan una mayor permeabilidad vascular, remodelación extracelular y la formación de mechones vasculares hacia la cavidad vítrea que se descomponen o inducen fácilmente el desprendimiento de ^retina8.

Una vez detectada, la retinopatía puede ser monitorizada a través de sus cambios ^{vasculares9,10}. La progresión de la patología se puede seguir a través de los cambios estructurales de los vasos, que definen claramente las etapas de la ^enfermedad11. La cuantificación de las alteraciones vasculares en estos modelos permitió correlacionar los cambios de vasos y la muerte neuronal y probar terapias farmacológicas para pacientes en diferentes fases de la enfermedad.

A la luz de las afirmaciones anteriores, consideramos que el reconocimiento y cuantificación de las alteraciones vasculares son fundamentales en los estudios de retinopatías. En este trabajo, mostraremos cómo medir diferentes parámetros vasculares. Para ello, emplearemos dos modelos animales. Uno de ellos es el modelo de ratón de retinopatía inducida por ^oxígeno12, que imita la retinopatía del prematuro y algunos aspectos de la retinopatía diabética ^{proliferativa13,14}. En este modelo, mediremos las áreas avasculares, las áreas neovasculares y la dilatación y tortuosidad de los vasos principales. En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo de ratón con Síndrome Metabólico (SM), que induce una retinopatía no ^{proliferativa15}. Aquí, evaluaremos la densidad vascular y la ramificación.

Protocolo

Los ratones C57BL / 6J se manejaron de acuerdo con las pautas de la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los procedimientos experimentales fueron diseñados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).

1. Preparación de soluciones tampón y reactivos

1. Preparación de 1x solución salina tampón de fosfato (PBS): Agregue 8 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2 g de cloruro de potasio (KCl), 14.4 g de dihidrato de hidrógeno-fosfato disódico (_{Na2HPO4 2H2O}) y 0.24 g de fosfato de potasio-dihidrógeno (_KH2PO4) a 800 ml de agua destilada. Revuelva la solución hasta la disolución completa de las sales. Ajuste el pH a 7.4 con ácido cloruro (HCl) y ajuste el volumen a 1 L con agua destilada adicional. Filtre la solución y guárdela a 4 °C.
2. Preparación de paraformaldehído al 4% (PFA): Añadir 40 g de PFA sólido a 800 ml de PBS recién preparado. Revuelva la solución en una placa calefactora a una temperatura constante de 60 °C. Agregue 1 M de hidróxido de sodio (NaOH) hasta que el PFA se disuelva por completo, verificando que el pH se mantenga en un rango de 7.2-7.4. Recarga el volumen a 1.000 mL con PBS y mezcla. Apague la placa calefactora y filtre la solución cuando su temperatura sea inferior a 35 °C. Guarde la solución a 4 °C durante un máximo de 3 días.
   PRECAUCIÓN: El PFA es dañino si se ingiere o si se inhala y es probablemente un compuesto mutagénico. Use guantes y mascarilla durante todo el proceso y trabaje en una cabina de seguridad.
3. Preparación de 1 solución salina tamponada con Tris (TBS): Agregue 6.1 g de Tris y 9 g de NaCl a 800 ml de agua destilada. Revuelva la solución hasta la disolución completa de las sales. Ajuste el pH a 7.4 con HCl y ajuste el volumen a 1 L con agua destilada adicional. Filtre la solución y guárdela a 4 °C.
4. Preparación de TBS- 0.1% Triton X-100: Agregue 0.1 mL de TritonX-100 a 100 mL de TBS. Mezcle suavemente y guárdelo a 4 ° C durante un máximo de 1 semana.
   NOTA: Como Tritón es un detergente muy denso, corte ligeramente el terminal de la punta para un mejor pipeteo.
5. Preparación de TBS-5%-Albúmina Sérica Bovina (BSA) -0.1% Tritón-X-100: Pesar 5 g de BSA y agregar TBS- 0.1% tritón X-100 solución hasta un volumen final de 100 mL. Revuelva suavemente. Alícuota y conservar a -20 °C durante un máximo de 2 meses.
6. Isolectina GSA-IB4 Alexa fluor-488 conjugada (Isolectina GSA-IB4): Peso 36,75 mg de cloruro de calcio dihidratado (_CaCl2·_2H2O) y añadirlo a 500 mL de PBS recién preparado. Revuelva la solución con una barra de agitación. Pipetear 500 μL de la solución de _CaCl2/PBS y añadirlo al vial que contiene 500 μg de polvo de isolectina GSA-IB4 liofilizada. Mezclar suavemente y alícuota la solución en tubos de 0,5 ml. Guárdelos a -20 °C protegidos de la luz.
7. Poli(alcohol vinílico) en glicerol/Tris: Pesar 2,4 g de Poli(alcohol vinílico), añadir 6 g de glicerol y remover suavemente. Luego, agregue 6 ml de agua y continúe revolviendo durante varias horas a temperatura ambiente. Añadir 12 ml de solución Tris de 0,2 M precalentada (pH: 8,5) y calentar a una temperatura constante de 50 °C durante 10 min y mezclar ocasionalmente. Finalmente, centrifugar la solución a 5.000 x g durante 15 min para su clarificación.
   NOTA: Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente, alícuota y guárdela a -20 °C.

2. Tinción fluorescente de lectina

1. Tras el sacrificio de ratones por inhalación de dióxido de carbono (_CO2), enucle los ojos con ^tijeras16. Fije los ojos enucleados con PFA al 4% recién preparado durante 1 h a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: La fijación también se puede realizar incubando los ojos en PFA al 4% durante la noche (ON) a 4 ° C. Los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los lineamientos de la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).
2. Bajo el microscopio de disección, retire las córneas con tijeras cortando a lo largo del limbo y diseccione todas las retinas. Deseche el segmento anterior del ojo y luego separe la retina de la RPE-Coroides.
   NOTA: Asegúrese de eliminar los restos y los vasos hialoides de la retina con fórceps.
3. Coloque las retinas en tubos de 200 μL. Luego, bloquee y permeabilice las retinas en 100 μL de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene albúmina sérica bovina al 5% (BSA) y Triton-X-100 al 0,1% durante 6 h a 4 °C con agitación suave en el agitador.
   NOTA: Este paso se puede realizar durante 2 h en RT.
4. Luego, invierta el tubo para colocar la retina en la tapa y retire la solución de bloqueo con una pipeta.
5. Añadir 100 μL de la solución que contiene 0,01 μg/μL de isolectina GSA-IB4 (GSA-IB4). Envuelva los tubos con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz. Incubar las retinas con la solución de lectina ON a 4 °C o durante 2 h a RT con agitación suave en el agitador.
6. Lavar la retina con 100 μL de TBS que contenga 0,1% de Triton-X-100 durante 20 min con una agitación suave en el agitador. Para un lavado adecuado, coloque la retina en la tapa del tubo invirtiéndola. Vuelva el tubo a su posición de pie y retire el medio que queda en el recipiente. Repita este paso tres veces.
7. Coloque la retina en un portaobjetos y agregue una gota de PBS. Bajo el microscopio de disección, realice cuatro cortes igualmente distantes desde los bordes de la retina hacia el nervio óptico.
8. Para desplegar los pétalos de la retina, use fórceps o pequeños trozos de papel de filtro. Asegúrese de que el lado del fotorreceptor esté hacia abajo.
9. Retire el PBS restante de la diapositiva con papel de filtro. Luego, agregue un medio de montaje (Poly(alcohol vinílico) en glicerol / Tris) y un estuche. Déjalo secar durante 1 h en RT.
10. Guarde los portaobjetos a 4 °C protegidos de la luz.
    NOTA: Las retinas también se pueden almacenar en PBS a 4 °C hasta la visualización de la microscopía confocal.

3. Visualización de microscopía confocal y adquisición de microfotografías

1. Antes de la visualización, incube las diapositivas durante 10 minutos en RT cubiertas de luz.
2. En el microscopio confocal, coloque el portaobjetos en la placa boca abajo.
3. Enfoque el plexo superior de la vasculatura retiniana y seleccione un área para iniciar la adquisición de la imagen.
4. Establezca parámetros generales del láser en el software: Longitud de onda: 488 nm; Intensidad del láser; HV; Compensación; Ganar.
   NOTA: La intensidad del láser, PMT, Offset y ganancia pueden variar según las condiciones y el uso de la lámpara. Los ajustes óptimos proporcionan una imagen clara de los vasos evitando la saturación en la sensibilidad del tubo fotomultiplicador para tener una relación lineal con la señal de fluorescencia.
5. Establecer otros parámetros de adquisición: Modo; Tamaño; Objetivo, sin zoom; No Kalman; Tamaño del paso.
   NOTA: Se deben utilizar condiciones de adquisición idénticas para obtener imágenes de las muestras de control y experimentales.
6. Establecer las coordenadas en los ejes x e y: Escanear la retina en foco 2x. Si el área muestra vasos, selecciónelo haciendo clic dos veces en el área para marcarla para su posterior adquisición de imágenes.
   NOTA: Es muy recomendable seleccionar el área de la retina siguiendo el plexo vascular superior ya que la fluorescencia de los vasos más grandes es mayor.
7. Mueva la cuadrícula a un cuadrado vecino, enfoque la retina y seleccione el área si corresponde. Repita este paso hasta que el área seleccionada comprenda toda la retina.
8. Seleccione un área y establezca las coordenadas en el eje z para definir la extensión de espesor que se va a escanear. Para hacer esto, visualice la retina en foco 2x; con el micrómetro, vaya a la parte superior de la retina y haga clic en Establecer en la posición Inicio. Luego, vaya a la parte inferior de la retina y haga clic en Establecer en la posición Final.
9. Repita el paso 3.8 en cada área seleccionada en la cuadrícula.
   NOTA: Para verificar el área escaneada en profundidad, presione Ir en la posición Inicio. Si los vasos aún se visualizan, reajuste la posición moviendo el micrómetro y luego haga clic en Establecer. Repita el proceso en la posición Fin.
10. Inicialice el escaneo automatizado.
11. Una vez finalizado el proceso de escaneo, abra la imagen.
12. Seleccione el formato Serie para grabar la imagen como mosaico y guárdela con la extensión preferida. Finalmente, la imagen cosida se mostrará en la pantalla.

4. Procesamiento de imágenes

1. En el software ImageJ FIJI, vaya a la barra de menús y haga clic en Archivo > Abrir. Seleccione la imagen que desea procesar. En la ventana Opciones de importación de bioformatos , seleccione los metadatos Mostrar OME-XML y haga clic en Aceptar.
   NOTA: Las imágenes con un nombre similar deben guardarse en carpetas separadas.
2. En la ventana Metadatos de OME , busque la información de tamaño de píxel, denominada PhysicalSizeX, PhysicalSizeY y PhysicalSizeZ. Copie estos datos.
3. Para la calibración de la imagen, vaya a la barra de menús y seleccione Propiedades de > de imagen. Copie la información de la imagen en el paso 4.2 y haga clic en Aceptar. La imagen se abre como una ventana con varias fotos, donde cada una representa las microfotografías adquiridas en un eje z.
4. Asigne una lut preferida a la imagen para consignar un color a la etiqueta fluorescente. Para hacer eso, vaya a la barra de menú y haga clic en el icono LUT .
5. Para visualizar todas las pilas en una sola imagen, vaya a la barra de menús y seleccione > pilas > proyecto Z.
6. En la ventana Proyección Z que se muestra, seleccione todas las pilas donde se visualizan los buques. En Tipo de proyección, elija Intensidad promedio y haga clic en Aceptar.
   NOTA: El resultado de la suma de las pilas se mostrará en una nueva imagen denominada AVG (nombre de la imagen).
7. Ajuste el brillo y el contraste en la imagen resultante para reducir el fondo y resaltar los vasos. Vaya a la barra de menú y haga clic en Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste. En las ventanas B y C se mueven las barras hasta que se observe una mejor intensidad. Haga clic en Aplicar y guarde los cambios.
8. Copie los parámetros seleccionados para Brillo/Contraste; estos deben ser idénticos para todas las imágenes.
9. Antes de la cuantificación de la imagen, defina los parámetros que se van a medir. En la barra de menús, vaya a Analizar > establecer medidas. En los procedimientos aquí descritos, será necesario obtener Área y Perímetro (esto en última instancia también es necesario para medir distancias). Haga clic en Aceptar.
10. Descargue el complemento necesario para la cuantificación de la densidad de ^{recipientes17} y siga las instrucciones de instalación proporcionadas por el complemento.
11. Continuar con la cuantificación de un parámetro vascular específico.

5. Cuantificación de áreas avasculares

1. En la barra de menús, elija la herramienta Varita. Seleccione el área de la retina que carece de vasos.
   NOTA: Se pueden seleccionar áreas más grandes o más pequeñas dependiendo de la tolerancia. Para ajustar la tolerancia, haga clic en el icono de la herramienta varita dos veces. Modo empleado: Legado.
2. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Repita los pasos 5.1 y 5.2 con todas las áreas avasculares de la retina.
3. Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener la información del área avascular. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
   NOTA: En algunas imágenes, uno puede preferir seleccionar las áreas avasculares manualmente. En este caso, elija la herramienta Selección de polígonos, dibuje distancias cortas alrededor del área avascular y haga clic en la imagen cuando una nueva distancia esté a punto de comenzar. Cierre el área seleccionada haciendo clic en el primer punto.
4. Repita los pasos 5.1, 5.2 y 5.3 para medir el área total de la retina.
5. Calcule el área avascular de la retina como la suma de todas las áreas avasculares medidas divididas por el área total de la retina.

6. Cuantificación de áreas neovasculares

1. En la barra de menús, elija la herramienta Varita.
2. Amplíe la imagen para visualizar mejor los neovasos. Seleccione los neovasos uno por uno con la herramienta de varita.
   NOTA: Ajuste la tolerancia no superior a 20 para garantizar la selección de un solo neovaso. Este nivel de tolerancia debe permanecer constante durante todas las cuantificaciones de imágenes.
3. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Repita los pasos 6.1 y 6.2 con todas las áreas neovasculares de la retina.
4. Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener los datos del área. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
5. Repita los pasos 6.1, 6.2 y 6.3 para cuantificar el área total de la retina.
6. Calcule el área neovascular de la retina como la suma de todas las áreas de neovasos medidas divididas por el área total de la retina.

7. Cuantificación del diámetro del vaso

1. En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta.
2. Amplíe la imagen para visualizar mejor la pared del recipiente. Realizar tres líneas transversales al buque principal antes del primer ramal. Esto debe hacerse dibujando una línea desde el límite de una pared del recipiente hasta el opuesto.
   NOTA: La línea debe ser perfectamente perpendicular al recipiente de pared para evitar errores de cuantificación.
3. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Repita los pasos 7.1 y 7.2 en todos los recipientes que necesiten ser cuantificados.
4. Haga clic en Medir en el gestor de ROI para obtener los datos de distancia. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.

8. Cuantificación de la tortuosidad del vaso

1. En la barra de menús, haga clic en el icono de la herramienta de línea recta con el botón derecho del ratón y seleccione Línea segmentada o Línea a mano alzada. Dibuje una línea dentro del vaso desde el nervio óptico hasta la primera ramificación del vaso después de la forma vascular.
   NOTA: La línea debe seguir la forma vascular para evitar errores de cuantificación.
2. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.
3. En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta. Dibuje una línea desde el nervio óptico hasta la ramificación del primer vaso.
4. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.
5. Haga clic en Medir en el Roi Manager para obtener los datos de distancias. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
6. Calcule el índice de tortuosidad de la siguiente manera: distancia obtenida con línea segmentada dividida por la distancia obtenida con línea recta.

9. Cuantificación de la ramificación vascular

1. Con la herramienta Oval de la barra de menús, defina un área aplicada por igual a todas las condiciones experimentales. El área seleccionada debe ser un círculo concéntrico dibujado alrededor del nervio óptico.
2. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.
   NOTA: En este caso, es recomendable guardar el ROI ya que la cuantificación es lenta y se debe utilizar el ROI idéntico en todas las imágenes. Para ello, en el ROI Manager haz clic en MÁS > Guardar.
3. Manualmente, cuente el número de ramas primarias que surgen de los vasos principales dentro del área de selección.
4. Repetir los pasos 9.2 y 9.3 en las zonas vecinas, manteniendo los criterios nervio-periferia óptica.

10. Cuantificación de la densidad vascular

1. Transforme la imagen en modo de 8 bits.
2. Vaya a Plugins en la barra de menús, seleccione Análisis de vasos > densidad vascular.
3. Defina un área con la herramienta Cuadrado de la barra de menús, donde se debe medir la densidad del recipiente. Haga clic en Aceptar.
4. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. Copie los datos en otro programa o guarde el archivo.
5. Repita los pasos 10.2, 10.3 y 10.4 en las áreas vecinas, manteniendo el ROI pero colocándolo nueve veces abarcando la periferia y el centro de toda la retina.

Resultados

Como se describe en el apartado de protocolo, a partir de un único ensayo de tinción fluorescente se puede obtener la morfología vascular y evaluar cuantitativamente varios parámetros de interés. La búsqueda de una alteración específica dependerá del tipo de retinopatía estudiada. En este artículo, las áreas avasculares y neovasculares, la tortuosidad y la dilatación se evaluaron en un modelo de ratón de retinopatía proliferativa, mientras que la ramificación vascular y la densidad se analizaron en un mod...

Discusión

Los modelos animales de retinopatías son herramientas poderosas para estudiar el desarrollo vascular, la remodelación o la angiogénesis patológica. El éxito de estos estudios en el campo se basa en el fácil acceso al tejido que permite realizar una amplia variedad de técnicas, aportando datos de ratones in vivo y postmortem26,27. Además, se ha encontrado una gran correlación entre los estudios in vivo y los análisis clínicos,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis