Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Resumen

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

Resumen

Las retinopatías son un grupo heterogéneo de enfermedades que afectan al tejido neurosensorial del ojo. Se caracterizan por neurodegeneración, gliosis y un cambio progresivo en la función y estructura vascular. Aunque el inicio de las retinopatías se caracteriza por alteraciones sutiles en la percepción visual, las modificaciones en el plexo vascular son los primeros signos detectados por los médicos. La ausencia o presencia de neovascularización determina si la retinopatía se clasifica como no proliferativa (NPDR) o proliferativa (PDR). En este sentido, varios modelos animales intentaron imitar características vasculares específicas de cada etapa para determinar los mecanismos subyacentes involucrados en las alteraciones del endotelio, la muerte neuronal y otros eventos que tienen lugar en la retina. En este artículo, proporcionaremos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de los parámetros vasculares de la retina en adultos y ratones de nacimiento prematuro en el día postnatal (P)17. Detallaremos los protocolos para llevar a cabo la tinción vascular retiniana con Isolectina GSA-IB4 en monturas enteras para su posterior visualización microscópica. También se proporcionan pasos clave para el procesamiento de imágenes con el software Image J Fiji, por lo tanto, los lectores podrán medir la densidad de los vasos, el diámetro y la tortuosidad, la ramificación vascular, así como las áreas avasculares y neovasculares. Estas herramientas son de gran ayuda para evaluar y cuantificar las alteraciones vasculares tanto en las retinopatías no proliferativas como en las proliferativas.

Introducción

Los ojos se nutren de dos sistemas arterio-venosos: la vasculatura coroidea, una red vascular externa que riega el epitelio pigmentado de la retina y los fotorreceptores; y la vasculatura neurorretiniana que irriga la capa de células ganglionares y la capa nuclear interna de la ^retina1. La vasculatura retiniana es una red organizada de vasos que suministran nutrientes y oxígeno a las células de la retina y cosechan productos de desecho para garantizar la transducción adecuada de la señalización visual. Esta vasculatura tiene algunas características distintivas, entre ellas: la falta de inervación autónoma, la regulación del tono vascular por me....

Protocolo

Los ratones C57BL / 6J se manejaron de acuerdo con las pautas de la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los procedimientos experimentales fueron diseñados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).

1. Preparación de soluciones tampón y reactivos

1. Preparación de 1x solución salina tampón de fosfato (PBS): Agregue 8 g de cloruro de sodio (NaCl), 0.2 g de cloruro de potasio (KCl), 14.4 g de dihidrato de hidrógeno-fosfato disódico (_Na2HP....

Resultados

Como se describe en el apartado de protocolo, a partir de un único ensayo de tinción fluorescente se puede obtener la morfología vascular y evaluar cuantitativamente varios parámetros de interés. La búsqueda de una alteración específica dependerá del tipo de retinopatía estudiada. En este artículo, las áreas avasculares y neovasculares, la tortuosidad y la dilatación se evaluaron en un modelo de ratón de retinopatía proliferativa, mientras que la ramificación vascular y la densidad se analizaron en un mod.......

Discusión

Los modelos animales de retinopatías son herramientas poderosas para estudiar el desarrollo vascular, la remodelación o la angiogénesis patológica. El éxito de estos estudios en el campo se basa en el fácil acceso al tejido que permite realizar una amplia variedad de técnicas, aportando datos de ratones in vivo y postmortem26,27. Además, se ha encontrado una gran correlación entre los estudios in vivo y los análisis clínicos,.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis