Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Resumo

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Resumo

Retinopatias são um grupo heterogêneo de doenças que afetam o tecido neurossensorial do olho. Caracterizam-se pela neurodegeneração, gliose e uma mudança progressiva na função e estrutura vascular. Embora o início das retinopatias seja caracterizado por distúrbios sutis na percepção visual, as modificações no plexo vascular são os primeiros sinais detectados pelos médicos. A ausência ou presença de neovascularização determina se a retinopatia é classificada como não proliferativa (NPDR) ou proliferativa (PDR). Nesse sentido, vários modelos animais tentaram imitar características vasculares específicas de cada estágio para determinar os mecanismos subjacentes envolvidos em alterações de endotélio, morte neuronal e outros eventos que ocorrem na retina. Neste artigo, forneceremos uma descrição completa dos procedimentos necessários para a medição dos parâmetros vasculares da retina em adultos e camundongos de nascimento precoce no dia do pós-natal (P)17. Detalharemos os protocolos para a realização de coloração vascular de retina com Isolectina GSA-IB4 em montagens inteiras para visualização microscópica posterior. As principais etapas para o processamento de imagens com o software Image J Fiji também são fornecidas, portanto, os leitores poderão medir a densidade, diâmetro e tortuosidade do vaso, ramificações vasculares, bem como áreas avasculares e neovasculares. Essas ferramentas são altamente úteis para avaliar e quantificar alterações vasculares em retinopatias não proliferativas e proliferativas.

Introdução

Os olhos são nutridos por dois sistemas arterio-venosos: a vasculatura choroidal, uma rede vascular externa que irriga epitélio pigmentado da retina e fotorreceptores; e a vasculatura neuro-retina que irrigam a camada de células gânglios e a camada nuclear interna da ^retina1. A vasculatura da retina é uma rede organizada de vasos que fornecem nutrientes e oxigênio para as células da retina e colhem resíduos para garantir a transdução adequada da sinalização visual. Esta vasculatura tem algumas características distintas, incluindo: a falta de inervação autônoma, a regulação do tom vascular por mecanismos intrínsecos de retina e a posse de uma complexa barreira retina-sangue2. Portanto, a vasculatura da retina tem sido o foco de muitos pesquisadores que estudaram extensivamente não só a vasculogênese durante o desenvolvimento, mas também as alterações e a angiogênese patológica que esses vasos sofrem em ^doenças3. As alterações vasculares mais comuns observadas nas retinopatias são dilatação de vasos, neovascularização, perda de arborização vascular e deformação dos vasos principais da retina, o que os torna mais ziggaggy4,5,6. Uma ou mais das alterações descritas são os primeiros sinais a serem detectados pelos médicos. A visualização vascular fornece um método de triagem rápido, não invasivo e ^barato7. O extenso estudo das alterações observadas na árvore vascular determinará se a retinopatia não é proliferativa ou proliferativa e o tratamento posterior. As retinopatias não proliferativas podem manifestar-se com morfologia vascular aberrante, diminuição da densidade vascular, capilares acelulares, pericítes de morte, edema macular, entre outros. Além disso, as retinopatias proliferativas também desenvolvem maior permeabilidade vascular, remodelagem extracelular e formação de tufos vasculares em direção à cavidade vítrea que facilmente quebra ou induz o descolamento da ^retina8.

Uma vez detectada, a retinopatia pode ser monitorada através de suas alterações ^{vasculares9,10}. A progressão da patologia pode ser acompanhada pelas mudanças estruturais dos vasos, que definem claramente os estágios da ^doença11. A quantificação de alterações vasculares nesses modelos permitiu correlacionar alterações de vasos e morte neuronal e testar terapias farmacológicas para pacientes em diferentes fases da doença.

À luz das afirmações acima, consideramos que o reconhecimento e quantificação das alterações vasculares são fundamentais nos estudos de retinopatias. Neste trabalho, mostraremos como medir diferentes parâmetros vasculares. Para isso, empregaremos dois modelos animais. Um deles é o modelo de retinopatia induzido pelo ^oxigênio12, que imita a Retinopatia da Prematuridade e alguns aspectos da Retinopatia Diabética ^{Proliferativa13,14}. Neste modelo, mediremos áreas avasculares, áreas neovasculares e a dilatação e tortuosidade dos principais vasos. Em nosso laboratório, foi desenvolvido um modelo de camundongos da Síndrome Metabólica (MetS), que induz uma retinopatia não ^{proliferativa15}. Aqui, vamos avaliar a densidade vascular e ramificações.

Protocolo

Os camundongos C57BL/6J foram manuseados de acordo com as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão. Os procedimentos experimentais foram desenhados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (CICUAL) da Faculdade de Ciências Químicas da Universidade Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).

1. Preparação de soluções tampão e reagentes

1. Preparação de 1x salina tampão fosfato (PBS): Adicionar 8 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 14,4 g de dissódio-hidrogênio-1 dihidrato fosfato (_{Na2HPO4 2H2O}) e 0,24 g de fosfato de potássio-dihidrogênio (_KH2PO4) a 800 mL de água destilada. Mexa a solução até a dissolução completa dos sais. Ajuste o pH para 7,4 com ácido cloreto (HCl) e ajuste o volume para 1 L com água destilada adicional. Filtre a solução e armazene-a a 4 °C.
2. Preparação de 4% paraformaldeído (PFA): Adicionar 40 g de PFA sólido a 800 mL de PBS recém-preparado. Mexa a solução em uma placa de aquecimento a uma temperatura constante de 60 °C. Adicione 1 M de hidróxido de sódio (NaOH) até que o PFA esteja completamente dissolvido, verificando se o pH é mantido em uma faixa de 7,2-7,4. Cubra o volume para 1.000 mL com PBS e misture. Desligue a placa de aquecimento e filtre a solução quando sua temperatura estiver abaixo de 35 °C. Armazene a solução a 4 °C por até 3 dias.
   ATENÇÃO: O PFA é prejudicial se engolido ou se inalado e é provavelmente um composto mutagênico. Use luvas e máscara facial durante todo o processo e trabalhe em uma cabine de segurança.
3. Preparação de 1x Soro fisiológico tris-tampão (TBS): Adicionar 6,1 g de Tris e 9 g de NaCl a 800 mL de água destilada. Mexa a solução até a dissolução completa dos sais. Ajuste o pH para 7,4 com HCl e ajuste o volume para 1 L com água destilada adicional. Filtre a solução e armazene-a a 4 °C.
4. Preparação de TBS- 0,1% Triton X-100: Adicione 0,1 mL de TritonX-100 a 100 mL de TBS. Misture suavemente e armazene-o a 4 °C por até 1 semana.
   NOTA: Como Triton é um detergente muito denso, corte ligeiramente o terminal da ponta para melhor pipetação.
5. Preparação de TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Pese 5 g de BSA e adicione TBS- solução triton X-100 de 0,1% até um volume final de 100 mL. Mexa delicadamente. Alíquota e loja a -20 °C por até 2 meses.
6. Isolectina GSA-IB4 Alexa fluor-488 conjugado (Isolectina GSA-IB4): Peso 36,75 mg de dihidrato de cloreto de cálcio (_CaCl2·_2H2O) e adicioná-lo a 500 mL de PBS recém-preparado. Mexa a solução com uma barra de mexida. Pipeta 500 μL da solução de _CaCl2/PBS e adicioná-lo ao frasco contendo 500 μg de isolectina liofilizada GSA-IB4 em pó. Misture suavemente e aliquot a solução em tubos de 0,5 mL. Armazene-os a -20 °C protegidos contra a luz.
7. Poli (álcool vinil) em glicerol/Tris: Pesar 2,4 g de Poly (álcool vinil), adicionar 6 g de glicerol e mexer suavemente. Em seguida, adicione 6 mL de água e continue mexendo por várias horas em temperatura ambiente. Adicione 12 mL de solução pré-aquecida de 0,2 M Tris (pH: 8,5) e aqueça a uma temperatura constante de 50 °C por 10 minutos e misture ocasionalmente. Por fim, centrifufique a solução a 5.000 x g por 15 min para esclarecimentos.
   NOTA: Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente, aliquot-la e armazená-la a -20 °C.

2. Mancha de lectina fluorescente

1. Após o sacrifício de camundongos por inalação de dióxido de carbono (_CO2), enuclear os olhos com ^tesoura16. Fixar os olhos enucleados com PFA de 4% recém-preparado para 1 h em temperatura ambiente (RT).
   NOTA: A fixação também pode ser realizada incubando os olhos em 4% PFA durante a noite (ON) a 4 °C. Os camundongos foram sacrificados de acordo com as diretrizes da Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (CICUAL) da Faculdade de Ciências Químicas da Universidade Nacional de Córdoba (Res. HCD 1216/18).
2. Sob o microscópio dissecando, remova as córneas com tesouras cortando ao longo do limbus e dissecando toda a retina. Descarte o segmento anterior do olho e, em seguida, separe a retina do RPE-Choroid.
   NOTA: Certifique-se de remover os detritos restantes e os vasos hialoides da retina com fórceps.
3. Coloque as retinas em tubos de 200 μL. Em seguida, bloqueie e permeabilize as retinas em 100 μL de solução salina tamponada tris (TBS) contendo 5% de Albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% Triton-X-100 durante 6h a 4 °C com agitação suave no agitador.
   NOTA: Esta etapa pode ser realizada por 2 h na RT.
4. Em seguida, inverta o tubo para colocar a retina na tampa e remova a solução de bloqueio com uma pipeta.
5. Adicione 100 μL da solução contendo 0,01 μg/μL de Isolectina GSA-IB4 (GSA-IB4). Enrole os tubos com papel alumínio para proteger as amostras da luz. Incubar as retinas com a solução de lectina ON a 4 °C ou por 2 h no RT com agitação suave no agitador.
6. Lave a retina com 100 μL de TBS contendo 0,1% Triton-X-100 por 20 min com agitação suave no agitador. Para uma lavagem adequada, coloque a retina na tampa do tubo invertendo-a. Volte o tubo para sua posição de pé e remova o meio restante no recipiente. Repita este passo três vezes.
7. Coloque a retina em um slide e adicione uma gota de PBS. Sob o microscópio dissecando, realize quatro cortes igualmente distantes das bordas da retina em direção ao nervo óptico.
8. Para desdobrar as pétalas da retina, use fórceps ou pequenos pedaços de papel filtro. Certifique-se de que o lado fotorreceptor está virado para baixo.
9. Remova o PBS restante do slide com papel filtro. Em seguida, adicione um meio de montagem (poly(álcool vinil) em glicerol/tris) e cubralip. Deixe secar por 1h no RT.
10. Armazene slides a 4 °C protegidos contra a luz.
    NOTA: As retinas também podem ser armazenadas em PBS a 4 °C até a visualização da microscopia confocal.

3. Visualização de microscopia confocal e aquisição de microfotografia

1. Antes da visualização, incubar os slides por 10 minutos em RT cobertos de luz.
2. No microscópio confocal, coloque o slide na placa de frente para baixo.
3. Concentre o plexo superior da vasculatura da retina e selecione uma área para iniciar a aquisição da imagem.
4. Definir parâmetros gerais de laser no software: Comprimento de onda: 488 nm; Intensidade laser; HV; Deslocamento; Ganhar.
   NOTA: A intensidade do laser, PMT, Offset e ganho podem variar dependendo das condições e do uso da lâmpada. As configurações ideais fornecem uma imagem clara dos vasos evitando a saturação na sensibilidade do tubo fotomultiplier para ter uma relação linear com o sinal de fluorescência.
5. Definir outros parâmetros de aquisição: Modo; Tamanho; Objetivo, sem zoom; Nada de Kalman. Tamanho do passo.
   NOTA: Condições idênticas de aquisição devem ser utilizadas para a imagem do controle e amostras experimentais.
6. Coloque as coordenadas no eixo x e y: Escaneie a retina em foco 2x. Se a área mostrar vasos, selecione-o clicando duas vezes na área, a fim de marcá-la para posterior aquisição de imagens.
   NOTA: É altamente recomendável selecionar a área da retina seguindo o plexo vascular superior, pois a fluorescência de vasos maiores é maior.
7. Mova-se na grade para uma praça vizinha, concentre a retina e selecione a área se ela corresponder. Repita esta etapa até que a área selecionada compor toda a retina.
8. Selecione uma área e defina as coordenadas no eixo z para definir a extensão da espessura para digitalizar. Para isso, visualize a retina em foco 2x; com o micrômetro, vá até a parte superior da retina e clique em Definir na posição Iniciar. Em seguida, mova-se para a parte inferior da retina e clique em Definir na posição Final.
9. Repita o passo 3.8 em cada área selecionada na grade.
   NOTA: Para verificar a área digitalizada em profundidade, pressione Ir na posição Iniciar. Se os vasos ainda estiverem visualizados, reajuste a posição movendo o micrômetro e clique em Definir. Repita o processo na posição Final.
10. Inicialize a digitalização automatizada.
11. Uma vez que o processo de digitalização termine, abra a imagem.
12. Selecione o formato Série para gravar a imagem como um Mosaico e salve-a com a extensão preferida. Finalmente, a imagem costurada será mostrada na tela.

4. Processamento de imagens

1. No software ImageJ FIJI, vá para a Barra de Menu e clique em Arquivo > Aberto. Selecione a imagem para processar. Na janela Opções de Importação de Formatos Biológicos , selecione os metadados de Exibição OME-XML e clique em OK.
   NOTA: Imagens com nome semelhante devem ser salvas em pastas separadas.
2. Na janela OME Metadata , procure as informações do tamanho do pixel, nomeadas como PhysicalSizeX, PhysicalSizeY e PhysicalSizeZ. Copie esses dados.
3. Para calibração de imagem, vá até a Barra de Menu e selecione Propriedades > de imagem. Copie as informações da imagem na etapa 4.2 e clique em OK. A imagem abre como uma janela com várias fotos, onde cada uma representa as microfotografias adquiridas em um eixo z.
4. Atribua uma lut preferencial à imagem, a fim de enviar uma cor para o rótulo fluorescente. Para fazer isso, vá até a Barra de Menu e clique no ícone LUT .
5. Para visualizar todas as pilhas em uma única imagem, vá até a Barra de Menu e selecione Image > Stacks > Z Project.
6. Na janela Projeção Z exibida, selecione todas as pilhas onde os vasos são visualizados. No Tipo de Projeção, escolha intensidade média e clique em OK.
   NOTA: O resultado da soma das pilhas será mostrado em uma nova imagem chamada AVG (nome da imagem).
7. Ajuste o brilho e o contraste na imagem resultante para reduzir o fundo e destacar os vasos. Vá até a Barra de Menu e clique em Imagem> Ajuste> Brilho/Contraste. Nas janelas B e C mova as barras até que uma melhor intensidade seja observada. Clique em Aplicar e salvar as alterações.
8. Copiar os parâmetros selecionados para brilho/contraste; estes devem ser idênticos para todas as imagens.
9. Antes da quantificação da imagem, defina os parâmetros que serão medidos. Na barra de menu, vá para Analisar > definir medidas. Nos procedimentos aqui descritos, será necessário obter Área e Perímetro (isso também é necessário para medir distâncias). Clique em OK.
10. Baixe o plugin necessário para quantificação da densidade do ^vaso17 e siga as instruções de instalações fornecidas pelo plugin.
11. Continue com a quantificação de um parâmetro vascular específico.

5. Quantificação de áreas avasculares

1. Na Barra de Menu, escolha a Ferramenta varinha. Selecione a área de retina que não tem vasos.
   NOTA: Áreas maiores ou menores podem ser selecionadas dependendo da tolerância. Para ajustar a tolerância, clique duas vezes no ícone da ferramenta varinha. Modo empregado: Legacy.
2. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Repita as etapas 5.1 e 5.2 com todas as áreas avasculares da retina.
3. Clique em Measure no gerenciador de ROI para obter as informações da área avascular. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
   NOTA: Em algumas imagens, pode-se preferir selecionar as áreas avasculares manualmente. Neste caso, escolha a ferramenta Seleção de Polígono, desenhe distâncias curtas ao redor da área avascular e clique na imagem quando uma nova distância está prestes a começar. Feche a área selecionada clicando no primeiro ponto.
4. Repita as etapas 5.1, 5.2 e 5.3 para medir a área total da retina.
5. Calcule a área avascular da retina como a soma de todas as áreas avasculares medidas divididas pela área total da retina.

6. Quantificação de áreas neovasculares

1. Na Barra de Menu, escolha a ferramenta Varinha.
2. Amplie a imagem para visualizar melhor os neovexes. Selecione os neovessels um a um com a ferramenta varinha.
   NOTA: Ajuste a tolerância não superior a 20 para garantir a seleção de um único neovessel. Esse nível de tolerância deve permanecer constante durante todas as quantificações de imagem.
3. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Repita as etapas 6.1 e 6.2 com todas as áreas neovasculares da retina.
4. Clique em Medir no gerenciador de ROI para obter os dados da área. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
5. Repita as etapas 6.1, 6.2 e 6.3 para quantificar a área total da retina.
6. Calcule a área neovascular da retina como a soma de todas as áreas dos neovessels medidos divididas pela área total da retina.

7. Quantificação do diâmetro do vaso

1. Na barra de menu, selecione a ferramenta linha reta.
2. Amplie a imagem para visualizar melhor a parede do vaso. Realize três linhas transversais para o navio principal antes do primeiro ramo. Isso deve ser feito desenhando uma linha do limite de uma parede do vaso para o oposto.
   NOTA: A linha deve ser perfeitamente perpendicular ao vaso da parede para evitar erros de quantificação.
3. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Repita as etapas 7.1 e 7.2 em todos os vasos que precisam ser quantificados.
4. Clique em Medir no gerenciador de ROI para obter os dados de distância. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.

8. Quantificação da tortuosidade do vaso

1. Na barra de menu, clique no ícone de ferramenta de linha reta com o botão direito do mouse e selecione Linha Segmentada ou Linha à Mão Livre. Desenhe uma linha dentro do vaso do nervo óptico até a primeira ramificação do vaso após a forma vascular.
   NOTA: A linha deve seguir a forma vascular para evitar erros de quantificação.
2. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager.
3. Na barra de menu, selecione a ferramenta linha reta. Desenhe uma linha do nervo óptico até a primeira ramificação do vaso.
4. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager.
5. Clique em Medir no Gerenciador de ROI para obter os dados de distâncias. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
6. Calcular o índice de tortuosidade da seguinte forma: distância obtida com linha segmentada dividida pela distância obtida com linha reta.

9. Quantificação de ramificações vasculares

1. Com a Ferramenta Oval da Barra de Menus, defina uma área aplicada igualmente a todas as condições experimentais. A área selecionada deve ser um círculo concêntrico desenhado em torno do nervo óptico.
2. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager.
   NOTA: Neste caso, é recomendável salvar o ROI, pois a quantificação é lenta e o ROI idêntico deve ser usado em todas as imagens. Para fazer isso, no ROI Manager clique em MAIS > Salvar.
3. Manualmente, conte o número de ramos primários decorrentes de vasos principais dentro da área de seleção.
4. Repita as etapas 9.2 e 9.3 em áreas vizinhas, mantendo os critérios ópticos de nervos-periferia.

10. Quantificação da densidade vascular

1. Transforme a imagem no modo de 8 bits.
2. Vá para Plugins na Barra de Menu, selecione Análise de Vasos > Densidade Vascular.
3. Defina uma área com a ferramenta Quadrado da Barra de Menu, onde a densidade do vaso precisa ser medida. Clique em OK.
4. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. Copie os dados em outro programa ou salve o arquivo.
5. Repetir as etapas 10.2, 10.3 e 10.4 nas áreas vizinhas, mantendo o ROI, mas colocando-o nove vezes abrangendo a periferia e o centro de toda a retina.

Resultados

Como descrito na seção de protocolo, a partir de um único ensaio de coloração fluorescente você pode obter a morfologia vascular e avaliar vários parâmetros de interesse quantitativamente. A busca de uma alteração específica dependerá do tipo de retinopatia estudada. Neste artigo, áreas avasculares e neovasculares, tortuosidade e dilatação foram avaliadas em um modelo de rato de retinopatia proliferativa, enquanto o ramificação vascular e a densidade foram analisados em um modelo de camundongos MetS, o q...

Discussão

Modelos animais de retinopatias são ferramentas poderosas para estudar o desenvolvimento vascular, remodelação ou angiogênese patológica. O sucesso desses estudos no campo conta com o fácil acesso ao tecido que permite realizar uma ampla variedade de técnicas, fornecendo dados de camundongos in vivo e pós-morte26,27. Além disso, grande correlação tem sido encontrada entre estudos in vivo e análises clínicas, proporcionando ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis