不拡散性網膜症を有するマウスの全型網膜における血管パラメータの定量化

要約

この記事では、実装網膜製剤全体に対する確立された再現性のあるレクチン染色アッセイと、増殖性および不拡散性網膜症において頻繁に変化する血管パラメータの定量的測定に必要なプロトコルについて説明する。

要約

網膜症は、眼の神経感覚組織に影響を与える疾患の不均一なグループである。それらは神経変性、神経膠症および血管機能および構造の進行性の変化によって特徴付けられる。網膜症の発症は視覚の微妙な障害によって特徴付けられるが、血管叢の修飾は臨床医によって検出される最初の徴候である。新血管新生の不在または存在は、網膜症が不拡散(NPDR)または増殖(PDR)のいずれかに分類されるかどうかを決定する。この意味で、いくつかの動物モデルは、内皮変化、神経死および他の事象が、その他の事象に関与する根本的なメカニズムを決定するために、各段階の特定の血管特徴を模倣しようとした。本稿では、出生後(P)17日の成人および早期出産マウスにおけるレチナル血管パラメータの測定に必要な手順の完全な説明を行う。後の顕微鏡可視化のための全体の台紙のイソレチンGSA-IB4とのレチナル血管染色を行うためのプロトコルを詳述する。イメージJフィジーソフトウェアで画像処理のための重要なステップも提供されているので、読者は血管密度、直径およびトース性、血管分岐、ならびに血管および新血管領域を測定することができる。これらのツールは、不拡散性および増殖性網膜症の両方における血管変化を評価し、定量化するのに非常に有用である。

概要

目は2つの動脈静脈系によって栄養を与えられます:脈絡膜血管系、網膜色素上皮および光受容体を灌漑する外部血管ネットワーク。神経節細胞層とretina1の内部核層を灌漑する神経残性血管系。レチナル血管系は、栄養と酸素をレチナル細胞に供給し、廃棄物を収穫して適切な視覚シグナル伝達を確実にする血管の組織的ネットワークです。この血管系には、自律的な内インベーションの欠如、固有の筋機構による血管緊張の調節、複雑な筋血バリア^{の所持など}、いくつかの特徴的な特徴があります2。したがって、血管系の血管系の研究は、開発中の血管形成だけでなく、これらの血管が疾患で受ける変化や病的血管新生も広く研究してきた多くの研究者の焦点となっています³。網膜症で観察される最も一般的な血管変化は、血管拡張、新血管新生、血管の樹状化および網膜主血管の変形の喪失であり、これらはよりジガ^ギー4,5,6となる。記載された変更の1つ以上は、臨床医によって検出される最も初期の徴候である。血管の可視化は、迅速で、非侵襲的で、かつ安価なスクリーニング方法^{7を提供する}。血管樹で観察される変化の広範な研究は、網膜症が不拡散または増殖性であるかどうかを決定し、さらなる治療を行う。不増殖性網膜症は、異常な血管形態、血管密度の低下、無細胞毛細血管、骨膜死、黄斑浮腫などで現れる。さらに、増殖性網膜症はまた、血管透過性の増加、細胞外リモデリング、および網膜剥離を容易に破壊または誘導する虚膜腔に向かう血管房の形成^{を発症する8}。

一度検出されると、網膜症は、その血管変化を介して監視することができます^9,10。病理の進行は、疾患の段階を明確に定義する血管の構造変化を通して追跡することができる¹¹。これらのモデルにおける血管変化の定量化は、血管の変化と神経死を相関させ、疾患の異なる段階の患者に対する薬理学的療法を試験することを可能にした。

上記の記述に照らして、網膜症研究において血管変化の認識と定量化が基本であると考える。本研究では、異なる血管パラメータの測定方法を紹介する。そのために、2つの動物モデルを採用します。そのうちの一つは、未熟児網膜症および増殖性糖尿病網膜症^13,14のいくつかの側面を模倣する酸素誘発網膜症マウス^model12である。このモデルでは、血管領域、新血管領域、および主血管の拡張と拷問を測定します。当研究室では、メタボリックシンドローム(MetS)マウスモデルが開発されており、不拡散性網膜症¹⁵を誘導します。ここでは、血管密度と分岐を評価する。

プロトコル

C57BL/6Jマウスは、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明のガイドラインに従って取り扱われた。実験手順は、コルドバ国立大学化学科学部の施設動物のケアと使用委員会(CICUAL)によって設計され、承認されました(Res. HCD 1216/18)。

1. 緩衝液および試薬の調製

1. 1xリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)の調製:8gの塩化ナトリウム(NaCl)、0.2gの塩化カリウム(KCl)、14.4gの二ナトリウム-リン酸二水和物(_{Na2HPO4 2H2O})および0.24gのリン酸カリウム二水素(_KH2PO4)を800mLの蒸留水に加える。溶液を塩の完全溶解まで撹拌する。pHを塩化物酸(HCl)で7.4に調整し、追加の蒸留水で体積を1 Lに調整します。溶液をろ過し、4°Cで保存してください。
2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA):固形PFAを40g加えて、800mLの新たに調製したPBSを添加します。加熱プレートで溶液を60°Cの一定温度で攪拌します。 PFAが完全に溶解するまで1M水酸化ナトリウム(NaOH)を加え、pHが7.2-7.4の範囲で維持されていることを確認します。PBSで音量を1,000 mLに上げて混ぜます。加熱プレートをオフにし、温度が35°C未満のときに溶液をろ過します。 溶液を4°Cで3日間保存します。
   注意:PFAは、飲み込まれた場合、または吸入した場合に有害であり、おそらく変異原性化合物である。全体のプロセスの間に手袋とフェイスマスクを使用し、安全キャビンで動作します。
3. 1xトリスバッファー済み生理液(TBS)の調製:蒸留水の800 mLにトリスの6.1 gとNaClの9 gを加える。溶液を塩の完全溶解まで撹拌する。HClでpHを7.4に調整し、追加の蒸留水で1 Lに音量を調整します。溶液をろ過し、4°Cで保存してください。
4. TBS- 0.1% トリトンX-100の調製:トリトンX-100〜100mLのTBSを0.1 mL加え、4°Cで1週間まで静かに混ぜます。
   注:トリトンは非常に密な洗剤であるため、チップの端子を少しカットしてピペットを良くします。
5. TBS-5%-牛血清アルブミン(BSA)の調製-0.1%トリトンX-100:BSAの5gを量り、TBS- 0.1%トリトンX-100溶液を100 mLの最終容積まで加える。やさしくかき混ぜます。アリコートと-20°Cで2ヶ月間保管してください。
6. イソレクチンGSA-IB4アレクサフルオール-488コンジュゲート(イソレクチンGSA-IB4):加えて、36.75mgの塩化カルシウム二水和物(_CaCl2·_2H2O)を500mLに加えて、新たに調製したPBSを添加した。攪拌バーで溶液をかき混ぜます。_CaCl2/PBSの溶液のピペット500 μLを、500 μgの凍結乾燥アイソレクチンGSA-IB4粉末を含むバイアルに加えます。0.5 mLチューブにそっと混ぜて溶液をアリクォートします。光から保護された-20°Cに保管してください。
7. グリセロール/トリスのポリ(ビニルアルコール):ポリ(ビニルアルコール)の2.4gを量り、グリセロールの6gを加え、穏やかにかき混ぜます。その後、6mLの水を加え、室温で数時間撹拌を続けます。12 mLのプリウォームド0.2 Mトリス溶液(pH:8.5)を加え、50°Cの一定温度で10分間加熱し、時折混ぜます。最後に、溶液を5,000 x g で15分間遠心して、明確化します。
   注:溶液を室温で冷却し、アリクォートし、-20°Cで保存してください。

2. 蛍光レクチン染色

1. マウスが二酸化炭素(_CO2)吸入によって犠牲にされると、はさみ¹⁶で目を引き出す。室温(RT)で1時間、作りたての4%PFAで、有核眼を固定します。
   注:固定は、4°Cで一晩(ON)の4%PFAで目をインキュベートすることによっても行うことができます。 マウスは、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明と、コルドバ国立大学化学科学部の施設動物ケアおよび使用委員会(CICUAL)のガイドラインに従って屠殺された(Res. HCD 1216/18)。
2. 解剖顕微鏡の下で、手足に沿って切断してはさみで角膜を取り除き、全体のレティナを解剖します。眼の前部を捨て、次に、RPE-チョロイドからレチナを分離します。
   注:残りの破片やヒヤロイド血管を鉗子でレチナから取り除くようにしてください。
3. 200 μL チューブにレティナを入れる。次に、5%の牛血清アルブミン(BSA)と0.1%トリトンX-100を含むトリス緩衝生理(TBS)溶液の100 μLのレチナを4°Cで4°Cで遮断し、揺れ動かして透過させます。
   注: このステップは RT で 2 時間実行できます。
4. 次いで、チューブを反転して、キャップにレチナを入れ、ピペットでブロッキング溶液を除去する。
5. イソレクチン GSA-IB4 (GSA-IB4) の 0.01 μg/μL を含む溶液を 100 μL加えます。サンプルを光から保護するために、チューブをアルミホイルで包みます。4 °Cでレクチン溶液をオンにして、または2時間のRTで、シェーカーで穏やかな攪拌でレチナをインキュベートします。
6. 0.1%トリトンX-100を含む100 μLのTBSで、シェイカーに穏やかな攪拌で20分間洗浄します。適切な洗浄のために、それを反転させることによってチューブのキャップにレティナを置きます。チューブを立った位置に戻し、容器に残っている媒体を取り外します。この手順を 3 回繰り返します。
7. スライドにレティナを配置し、PBSを追加します。解剖顕微鏡の下で、眼神経に向かって、眼の縁から4つの等しく離れた切り傷を行う。
8. 花びらを広げるには、鉗子や小さなフィルターペーパーを使用します。感光体側が下向きであることを確認します。
9. スライドの残りのPBSをフィルタペーパーで取り外します。次に、取り付け媒体(ポリ(ビニルアルコール)をグリセロール/トリスに入れ、カバースリップを加えます。RTで1時間乾燥させます。
10. 光から保護された4°Cでスライドを保管してください。
    注意:レチナスは、共焦点顕微鏡観察の可視化まで4°CでPBSに保存することもできます。

3. 共焦点顕微鏡可視化とマイクロフォト撮影

1. 可視化する前に、光から覆われたRTで10分間スライドをインキュベートします。
2. 共焦点顕微鏡で、スライドをプレートの下に置きます。
3. 家臣の優れた神経叢に焦点を当て、画像取得を開始する領域を選択します。
4. ソフトウェアの一般的なレーザーパラメータを設定します: 波長: 488 nm;レーザー強度;HV;オフセット。得。
   注: レーザー強度、PMT、オフセット、およびゲインは、ランプの条件と使用法によって異なる場合があります。最適な設定は、蛍光信号との線形関係を有する光増倍管の感度の飽和を回避する血管の鮮明な画像を提供する。
5. 他の取得パラメータを設定: モード;サイズ;目的、ズームなし。カルマンなし。ステップサイズ。
   注意: 同一の取得条件は、コントロールと実験サンプルをイメージングするために使用する必要があります。
6. x 軸と y 軸で座標を設定する:フォーカス 2x で、retina をスキャンします。エリアに血管が表示されている場合は、後で画像を取得するためにマークするために、領域を2回クリックして選択します。
   注:大きな血管の蛍光が高くなるほど、優れた血管叢に従うことで、レチン領域を選択することが強く推奨されます。
7. グリッド内を隣接する正方形に移動し、その領域にフォーカスを合わせ、対応する領域を選択します。選択した領域が全レティナを含むまで、この手順を繰り返します。
8. 1 つの領域を選択し、z 軸の座標を設定して、スキャンする厚さの範囲を定義します。これを行うには、フォーカス2xでretinaを視覚化します。マイクロメーターで、retinaの上部に移動し、開始位置で 設定 をクリックします。次に、レティナの一番下に移動し、終了位置で [設定 ]をクリックします。
9. グリッドで選択したすべての領域で、ステップ 3.8 を繰り返します。
   メモ:スキャンした領域の深さを確認するには、開始位置で [Go ]を押します。船舶がまだ視覚化されている場合は、マイクロメーターを移動して位置を再調整し、[ Set]をクリックします。終了位置でプロセスを繰り返します。
10. 自動スキャンを初期化します。
11. スキャンプロセスが完了したら、画像を開きます。
12. 画像をモザイクとして記録し、希望する拡張子で保存するには、 シリーズ 形式を選択します。最後に、ステッチされた画像が画面に表示されます。

4. 画像処理

1. ImageJ FIJI ソフトウェアで、 メニューバー に移動し、 ファイル>を開く]をクリックします。処理するイメージを選択します。[ バイオフォーマットのインポートオプション]ウィンドウで 、[ OME-XMLを表示]メタデータ を選択し、[OK]をクリック します。
   注: 類似した名前の画像は、別のフォルダに保存する必要があります。
2. OME メタデータ ウィンドウで、物理サイズ、物理サイズ、および物理サイズ Z という名前のピクセル サイズ情報を検索します。このデータをコピーします。
3. 画像キャリブレーションの場合は、 メニューバー に移動し、[ イメージ>プロパティ]を選択します。手順 4.2 でイメージの情報をコピーし、[OK] をクリック します。画像は、複数の写真を含むウィンドウとして開き、各写真はz軸で取得したマイクロフォトを表します。
4. 蛍光標識に色を付けるために、画像に好ましいlutを割り当てます。これを行うには、 メニューバー に移動し、 LUT アイコンをクリックします。
5. 1 つのイメージ内のすべてのスタックを視覚化するには、 メニュー バー に移動し、 Z プロジェクト>イメージ > スタックを選択します。
6. 表示された Z 投影ウィンドウで、船舶が視覚化されているすべてのスタックを選択します。[投影タイプ] で 、[ 平均強度 ] を選択し、[OK] をクリック します。
   注: スタックの合計の結果は、AVG(イメージ名)という名前の新しい画像に表示されます。
7. 結果の画像の明るさとコントラストを調整して、背景を減らし、血管をハイライトします。 メニューバー に移動し、 画像>調整>明るさ/コントラストをクリックします。BとCのウィンドウでは、より良い強度が観察されるまでバーを移動します。[ 適用 ]をクリックして、変更を保存します。
8. 明るさ/コントラストに選択したパラメータをコピーします。これらはすべての画像で同一である必要があります。
9. 画像の定量化の前に、測定するパラメータを定義します。 メニューバーで、「 計測値を分析>設定する」に進んでください。ここで説明する手順では、面積と周囲長を取得する必要があります(これは最終的には距離を測定するためにも必要です)。 [OK] をクリックします。
10. 容器密度定量化¹⁷に必要なプラグインをダウンロードし、プラグインが提供するインストール手順に従います。
11. 特定の血管パラメータの定量化を続行します。

5. 血管領域の定量化

1. メニュー バーで、[杖ツール] を選択します。船が足りない残りの領域を選択します。
   注: 許容値に応じて、大きい領域または小さい領域を選択できます。許容値を調整するには、杖ツールアイコンを 2 回クリックします。採用されているモード: レガシー。
2. キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。残りのすべての血管領域でステップ 5.1 と 5.2 を繰り返します。
3. ROI マネージャの [メジャー] をクリックして、血管領域情報を取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
   注:一部の画像では、血管領域を手動で選択することを好むかもしれません。この場合は、ポリゴン選択ツールを選択し、血管領域の周囲に短い距離を描画し、新しい距離が始まるときに画像をクリックします。最初の点をクリックして、選択した領域を閉じます。
4. ステップ 5.1、5.2、および 5.3 を繰り返して、レティナの総面積を測定します。
5. 測定されたすべての血管領域を、その全ての領域で除算した、その全ての血管領域の合計として、その残管領域を算出する。

新血管領域の定量化

1. メニューバーで、[ 杖] ツールを選択します。
2. 画像を拡大して、ネオ船をより良く視覚化します。杖ツールでネオ容器を1つずつ選択します。
   注: 1 つのネオ船の選択を確実にするために 20 より高く許容値を調整します。この許容値レベルは、すべての画像の定量中に一定の値を維持する必要があります。
3. キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。6.1と6.2を、すべての新血管領域で繰り返します。
4. ROI マネージャの [メジャー] をクリックして、エリア データを取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
5. ステップ 6.1、6.2、および 6.3 を繰り返して、残りの部分の総面積を数値化します。
6. すべての新血管領域を、その全領域で除算した全ての新船領域の合計として、その新血管領域を計算する。

7. 容器の直径の定量化

1. メニュー バーで、直線ツールを選択します。
2. 画像を拡大表示して、船舶の壁をよりよく視覚化します。最初の分岐の前に、主船に3本の横線を行います。これは、容器の壁の境界から反対側に線を引くことによって行う必要があります。
   注: ラインは、定量化エラーを避けるために壁面容器に完全に垂直でなければなりません。
3. キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。定量化が必要なすべての船舶でステップ7.1と7.2を繰り返します。
4. ROI マネージャで [測定] をクリックして距離データを取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。

8. 船舶の不法行為の定量化

1. メニューバーで、マウスの右ボタンで直線ツールアイコンをクリックし、セグメント線またはフリーハンドラインを選択します。血管の内側に、血管の形状に続く最初の血管の影響まで、視神経から線を引きます。
   注: 線は、定量化エラーを避けるために血管形状に従う必要があります。
2. キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。
3. メニュー バーで、直線ツールを選択します。視神経から最初の血管の影響まで線を引きます。
4. キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。
5. ROI マネージャで [測定] をクリックして距離データを取得します。プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
6. トルトオーティ指数を計算するには、線分を直線で得た距離で割った距離を分割します。

9. 血管枝の定量化

1. メニューバーの楕円ツールを使用して、すべての実験条件に均等に適用される領域を定義します。選択した領域は視神経の周りに描かれた同心円でなければなりません。
2. キーボードの T 文字を押して、選択した領域を ROI マネージャに記録します。
   注: この場合、定量が遅く、同一の ROI をすべての画像で使用する必要があるため、ROI を保存することをお勧めします。これを行うには、ROIマネージャで[保存] >[詳細]をクリックします。
3. 手動で、選択領域内の主な船舶から生じる一次分岐の数をカウントします。
4. 視神経周辺条件を維持したまま、隣接領域でステップ 9.2 と 9.3 を繰り返します。

10. 血管密度の定量化

1. イメージを 8 ビット モードに変換します。
2. メニューバーのプラグインに移動し、血管分析>血管密度を選択します。
3. メニューバーの正方形ツールで、容器の密度を測定する必要がある領域を定義します。[OK] をクリックします。
4. プログラムは、必要な情報を含む新しいウィンドウを表示します。データを別のプログラムにコピーするか、ファイルを保存します。
5. ステップ 10.2、10.3、および 10.4 を隣接する地域で繰り返し、ROI を維持しますが、周囲と全てのレティナの中心を 9 回配置します。

結果

プロトコルセクションに記載されているように、単一の蛍光染色アッセイから、血管形態を取得し、目的の複数のパラメータを定量的に評価することができる。特定の変化の探索は、研究された網膜症の種類によって異なります。この記事では、血管領域と新血管領域、トース性、および拡張を増殖性網膜症のマウスモデルで評価し、血管分岐および密度をMetSマウスモデルで分析し、不拡散...

ディスカッション

網膜症の動物モデルは、血管の発達、リモデリング、または病理学的血管新生を研究するための強力なツールです。この分野でのこれらの研究の成功は、生体内および死後マウス^26,27からのデータを提供し、多種多様な技術を実行することを可能にする組織への容易なアクセスに依存^している。さらに、インビボ研究と臨床分析...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminuim foil
Bovine Serum Albumin	Merck	A4503	quality
Calcium chloride dihydrate	Merck	C3306
Hydrochloric acid	Biopack	9632.08
Confocal Microscope FV1200	Olympus	FV1200	with motorized plate
Covers	Paul Marienfeld GmnH & Co.	111520
Dissecting Microscope	NIKON	SMZ645
Disodium-hydrogen-phosphate dihydrate	Merck	119753
200 µL  tube	Merck	Z316121
Filter paper	Merck	WHA5201090
Incubator shaker GyroMini	LabNet International	S0500
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	I21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)	Merck	475904
Paraformaldehyde	Merck	158127
pHmeter	SANXIN	PHS-3D-03
Potassium chloride	Merck	P9541
Potassium-dihydrogen phosphate	Merck	1,04,873
Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Sodium chloride	Merck	S3014
Sodium hydroxide	Merck	S5881
Tris	Merck	GE17-1321-01
Triton X-100	Merck	X100-1GA
Vessel Analysis Fiji software	Mai Elfarnawany		https://imagej.net/Vessel_Analysis