تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

Summary

يعتمد التطور المبكر على المنتجات الموروثة من الأم ، ودور العديد من هذه المنتجات غير معروف حاليا. في هذا الصدد، وصفنا بروتوكولا يستخدم تقنية كريسبر-كاس9 لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في جيل واحد.

Abstract

يعتمد التطور المبكر على مجموعة من العوامل الأمومية المدمجة في البويضة الناضجة أثناء تكوين البويضات والتي تؤدي جميع الوظائف الخلوية اللازمة للتنمية حتى تنشيط الجينوم الوجنتي. وعادة ما يتطلب الاستهداف الجيني لهذه العوامل الأمومية جيلا إضافيا لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي، مما يعوق القدرة على تحديد دور الجينات المعبر عنها من قبل الأم أثناء النمو. وقد سمح اكتشاف قدرات التحرير ثنائي الأليليك ل CRISPR-Cas9 بفحص الأنماط الظاهرية الجنينية في الأنسجة الجسدية للأجنة المحقونة أو "المقرمشة"، مما زاد من فهم الدور الذي تلعبه الجينات المعبر عنها وzygotic في البرامج التنموية. توضح هذه المقالة بروتوكولا يعد امتدادا للطريقة المقرمشة. في هذه الطريقة ، يسمح التحرير الثنائي للخلايا الجرثومية بعزل النمط الظاهري للأمهات في جيل واحد ، أو "المقرمشات الأمومية ". يعزز الحمض النووي الريبي الموجه متعدد الإرسال إلى هدف واحد الإنتاج الفعال للهشطات النفاسية للأمهات ، في حين يوفر تحليل تسلسل الحوافر المقرمشة للأمهات طريقة بسيطة لتأكيد الآفات الوراثية التي تنتج نمطا ظاهريا للأمهات. ويدعم استخدام المقرمشات النفاسية للأمهات التحديد السريع للجينات الأساسية المعبر عنها من قبل الأم، مما يسهل فهم التطور المبكر.

Introduction

مجموعة من المنتجات المودعة من الأم (على سبيل المثال ، الحمض النووي الريبي والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى) ضرورية لجميع العمليات الخلوية المبكرة حتى يتم تنشيط الجينوم الوجني للجنين¹. عادة ما يكون النضوب المبكر لهذه المنتجات من البويضة قاتلا جنينيا. على الرغم من أهمية هذه الجينات في التطور ، فإن دور العديد من الجينات المعبر عنها من قبل الأم غير معروف حاليا. يتيح التقدم في تكنولوجيا تحرير الجينات في أسماك الزرد ، مثل CRISPR-Cas9 ، استهداف الجينات المعبر عنها من الأم²،^3،4. ومع ذلك ، فإن تحديد النمط الظاهري للتأثير الأمومي يتطلب جيلا إضافيا عند مقارنته بالنمط الظاهري الوجني ، مما يتطلب المزيد من الموارد. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام قدرة التحرير ثنائي الأليليك ل CRISPR-Cas9 لفحص الأنماط الظاهرية الجنينية في الأنسجة الجسدية للأجنة المحقونة (F0) ، والمعروفة باسم "المقرمشات"⁵،⁶،^7،8،^9،10. تسمح تقنية الهش بإجراء فحص فعال للموارد للجينات المرشحة في الخلايا الجسدية ، مما يسهل فهم جوانب محددة في التنمية. يسمح البروتوكول الموصوف في هذه الورقة بتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي ، أو "المقرمشات الأمومية "، في جيل واحد¹¹. يمكن تحقيق هذا المخطط عن طريق توجيه الحمض النووي الريبي المتعدد إلى جين واحد وتعزيز أحداث التحرير ثنائي الأليل في الخط الجرثومي. يمكن تحديد هذه الأجنة المقرمشة للأمهات بواسطة الأنماط الظاهرية المورفولوجية الإجمالية وتخضع للتوصيف الأولي ، مثل وضع العلامات على حدود الخلايا ونمط الحمض النووي¹¹. يسمح التحليل المشترك للنمط الظاهري الذي يمكن ملاحظته والتوصيف الجزيئي الأساسي ل INDELs المستحثة بالتنبؤ بدور الجين المستهدف في التطور المبكر.

في أسماك الزرد ، خلال أول 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ، تتطور مجموعة صغيرة من الخلايا إلى الخلايا الجرثومية البدائية ، وهي مقدمة للخط الجرثومي¹²،^13،14،15. في البراثن التي وضعتها إناث F0 ، تعتمد نسبة الأجنة المقرمشة للأمهات التي تم استردادها على عدد الخلايا الجرثومية التي تحتوي على حدث تحرير ثنائي الأليليك في الجين المستهدف. بشكل عام ، كلما حدث التحرير في وقت مبكر في الجنين ، زاد احتمال ملاحظة طفرات CRISPR-Cas9 في الخط الجرثومي. في معظم الحالات ، تأتي الأنماط الظاهرية للأجنة المقرمشة للأمهات من فقدان الوظيفة في أليلين أموميين موجودين في البويضة النامية. عندما تنتهي البويضة من الانقسام الاختزالي ، يتم بثق أحد أليلات الأم من الجنين عبر الجسم القطبي ، بينما يتم دمج الأليل الآخر في نواة الأم. سيمثل تسلسل العديد من الفرديات المقرمشة للأمهات خليطا من الطفرات (عمليات الإدراج و / أو الحذف (INDELs)) الموجودة في الخط الجرثومي التي تساهم في النمط الظاهري¹¹.

يصف البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لإنشاء طفرات CRISPR-Cas9 في جينات تأثير الأم وتحديد النمط الظاهري المقابل باستخدام نهج هش للأمهات (الشكل 1). سيشرح القسم الأول كيفية تصميم وإنشاء الحمض النووي الريبي الإرشادي بشكل فعال ، في حين يحتوي القسمان الثاني والثالث على خطوات حاسمة لإنشاء مقرمشات الأمهات عن طريق الحقن المجهري. بعد حقن خليط CRISPR-Cas9 ، يتم فحص الأجنة المحقونة للتعديلات الجسدية عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (القسم الرابع). بمجرد أن تتطور أجنة F0 المحقونة وتصل إلى مرحلة النضج الجنسي ، يتم عبور إناث F0 إلى ذكور من النوع البري ، ويتم فحص ذريتهم بحثا عن الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي (القسم الخامس). يتضمن القسم السادس تعليمات حول صنع المفردات المقرمشة للأمهات التي يمكن دمجها مع تسلسل Sanger لتحديد INDELs التي يسببها CRISPR-Cas9. وبالإضافة إلى ذلك، تتضمن المناقشة تعديلات يمكن إدخالها على البروتوكول لزيادة حساسية هذه الطريقة وقوتها.

Protocol

في الدراسات التي أدت إلى تطوير هذا البروتوكول ، تمت الموافقة على جميع مساكن أسماك الزرد والتجارب من قبل لجنة جامعة ويسكونسن ماديسون المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC-M005268-R2).

1. توليف الحمض النووي الريبي الإرشادي

ملاحظة: تم إنشاء مقرمشات zygotic باستخدام الحمض النووي الريبي دليل واحد أو تعدد إرسال الحمض النووي الريبي دليل متعدد إلى هدف واحد⁵،^6،7،⁸،^9،10. يزيد تعدد إرسال الحمض النووي الريبي الإرشادي من النسبة المئوية للأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا مقرمشا وموجوتا¹⁰. بسبب هذا التردد المتزايد للأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا ، يتم إنشاء المقرمشات الأمومية عن طريق تعدد الإرسال أربعة RNAs موجهة إلى جين واحد. يمكن العثور على بروتوكول أكثر تفصيلا حول استخدام CHOPCHOP لتصميم الحمض النووي الريبي الموجه وطريقة التلدين لتوليف الحمض النووي الريبي الإرشادي لأسماك الزرد في مكان آخر¹⁶،¹⁷،¹⁸،^19،20.

1. لتحديد جين معبر عنه من الأم لاستهدافه ، تأكد من مستويات نسخ mRNA أثناء التطوير عبر قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي التي توفر معلومات النسخ من الزيجوت إلى 5 أيام²¹. بشكل عام ، يتم التعبير عن الجينات الخاصة بالأم بشكل كبير في الجنين المبكر وتتحلل بعد تنشيط الجينوم الوجني²².
2. بمجرد تحديد الجين المستهدف الذي تم التعبير عنه من قبل الأم ، حدد أول مجال بروتين متوقع باستخدام قسم "المجالات والميزات" المتاح على متصفح جينوم Ensembl²³. استخدم هذا المجال كمنطقة مستهدفة للحمض النووي الريبي الإرشادي الأربعة.
3. استخدم برنامج اختيار الحمض النووي الريبي CHOPCHOP لتحديد أربعة مواقع مستهدفة للحمض النووي الريبي في أول مجال نشط. تصميم أوليغونوكليوتيدات خاصة بالجينات، كما هو موضح أدناه لكل موقع مستهدف. في oligonucleotide الخاص بالجين ، يتوافق قسم N²⁰ مع التسلسل المستهدف مطروحا منه موقع PAM (NGG) من CHOPCHOP. رتب هذه الأوليغنوكليوتيدات الخاصة بالجينات وقلة النوكليوتيد الثابتة باستخدام تنقية الملح القياسية (انظر جدول المواد).
   قلة النوكليوتيد الخاصة بالجينات:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. لإنشاء قالب RNA إرشادي لكل أوليغونوكليوتيد خاص بالجين ، قم بصلبه إلى oligonucleotide الثابت واملأ المعلقات ببوليميراز T4-DNA كما هو موضح سابقا¹⁶. بعد تجميع قوالب الحمض النووي الريبي الإرشادية الأربعة، قم بتنقيتها وتركيزها معا باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي ومجموعة المكثفات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
5. قم بتوليف خليط sgRNA من قالب الحمض النووي الريبي الإرشادي المجمع باستخدام مجموعة نسخ T7 في المختبر (انظر جدول المواد). قم بإجراء النسخ في المختبر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن أن يؤدي استخدام نصف تفاعلات مجموعة T7 Transcription إلى تقليل التكلفة لكل تفاعل.
6. بعد تخليق الحمض النووي الريبي ، قم بتنقية المجموعة الناتجة من sgRNAs باستخدام بروتوكول خلات الإيثانول / الأمونيوم كما هو موضح سابقا¹⁶،^20،24. بعد عزل الحمض النووي الريبي، أعد تعليقه في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. إذا تم استخدام نصف تفاعلات مجموعة النسخ T7 لنسخ مجموعة sgRNAs ، فأعد تعليق الحمض النووي الريبي النقي إلى 10-15 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
7. حدد كمية sgRNAs المجمعة التي تم إنشاؤها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتخفيف تجمع sgRNAs في المياه الخالية من النوكليز إلى تخفيف 1500 نانوغرام / ميكرولتر ± 500 نانوغرام / ميكرولتر.
8. بعد تحديد تركيز تجمع sgRNAs ، تحقق من سلامة sgRNAs على هلام الأغاروز بنسبة 1٪.
   1. يلقي 1٪ من الأغاروز / 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم / جل TBE. بمجرد أن يتصلب الجل ، ضعه في مخزن TBE قيد التشغيل.
   2. امزج 1 ميكرولتر من خليط sgRNA و 1 ميكرولتر من مخزن مؤقت لتحميل هلام الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد). قم بتحميل هذه العينة في الجل وقم بتشغيل الجل على 100 فولت لمدة 5 دقائق.
9. تصور الأشرطة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV). يجب أن تظهر مجموعة sgRNAs كنطاق واحد. إذا لوحظت مسحة ، فمن المحتمل أن يحدث تحلل الحمض النووي الريبي.
10. قم بتخزين مجموعة sgRNAs في أليكوتس 1 ميكرولتر للاستخدام الواحد في أنابيب شريط PCR خالية من النوكليز في الفريزر -80 درجة مئوية. بالنسبة للكميات الكبيرة من خليط sgRNAs (30 ميكرولتر أو أكثر) ، قم بإدخال نصف الحجم في أنابيب شريط PCR الخالية من النوكليز وتخزين النصف الآخر كحجم أكبر في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النوكلياز. تذوب و aliquot عند الحاجة.
11. لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، تأكد من أن العينات الموجودة في أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق لا تخضع لأكثر من دورتين للتجميد والذوبان.

2. إعداد الكواشف والمواد اللازمة للحقن المجهري

ملاحظة: في أسماك الزرد ، يمكن أن يؤدي حقن Cas9 mRNA إلى إنشاء مقرمشات وجنتية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات أن بروتين Cas9 أكثر كفاءة في إنشاء INDELs في الأجنة المحقونة^16,25. يستخدم هذا البروتوكول بروتين Cas9 لتوليد المقرمشات النفاسية لأن هذا البروتين لا يعاني من نفس التأخر في النشاط مثل حقن Cas9 mRNA. من الناحية النظرية ، يجب أن يزيد هذا من احتمال حدوث طفرة ثنائية الأليل في وقت مبكر من التطور مما يؤدي إلى زيادة فرصة تأثر جزء أكثر شمولا من الخط الجرثومي. يمكن العثور على بروتوكولات وموارد أخرى توضح بالتفصيل كيفية التحضير للحقن المجهري في مكان آخر^24,26.

1. شراء أو توليد بروتين Cas9 (انظر جدول المواد). أعد تعليق بروتين Cas9 في الماء الخالي من النوكليز لصنع محلول 2 ملغم / مل و aliquot 1 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيق الخالية من البولي بروبيلين RNase. تخزينها كأنابيب تستخدم لمرة واحدة في -80 درجة مئوية.
2. في فترة ما بعد الظهر قبل الحقن ، استخدم مجتذب ماصة دقيقة لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية وإنشاء إبرة حقن. قم بتخزين الإبرة غير المنقطعة في حامل إبرة مغلق حتى صباح يوم الحقن المجهري.
3. لإنشاء طبق حقن ، صب 20 مل من 1.5٪ agarose / معقم H₂O لملء نصف طبق بتري 100 مم × 15 مم وانتظر حتى يتصلب. بمجرد ضبط محلول الأغاروز ، أضف 20 مل من 1.5٪ agarose / H₂O المعقم إلى طبق Petri وضع القالب البلاستيكي (انظر جدول المواد) في الأغاروز السائل واتركه يتصلب.
4. بعد تصلب الأغاروز ، قم بإزالة القالب البلاستيكي وتخزين لوحة الحقن رأسا على عقب في الثلاجة حتى صباح يوم الحقن. يمكن استخدام صفيحة واحدة للحقن المتعددة طالما أن الآبار تحافظ على سلامتها.

3. الحقن المجهري لكوكتيل CRISPR-Cas9 في جنين الزرد أحادي الخلية لتوليد المقرمشات الأمومية

ملاحظة: يمكن العثور على المزيد من الموارد للحقن المجهري في أجنة أسماك الزرد في أماكن أخرى²⁴،^26،27. إن حقن خليط كريسبر-كاس9 في القرص الأرومي النامي للأجنة ذات الخلية الواحدة قد يزيد من احتمال إنتاج المقرمشات الأمومية . يمكن أيضا حقن الخليط في كيس صفار البيض حتى مرحلة 2 خلية. ومع ذلك، تعتمد المخاليط التي يتم حقنها في صفار البيض على تدفق البوبلازم للوصول إلى القرص الأرومي، لذلك يمكن أن يقلل CRISPR-Cas9 الذي يتم حقنه في صفار البيض من كفاءة قطع CRISPR-Cas9²⁸.

1. في فترة ما بعد الظهر قبل الحقن المجهري ، قم بإعداد صلبان من النوع البري في صناديق تزاوج أسماك الزرد. احتفظ بكل من الأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ولكن افصلها بفاصل مربع التزاوج أو ضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض.
2. في صباح يوم التجربة، أخرج 2 ملغم/مل من بروتين كاس9 وأليكوت واحد من مجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الخالي من البولي بروبيلين الخالي من RNase والذي يحتوي على بروتين Cas9 ، قم بتجميع خليط حقن 5 ميكرولتر يتضمن مجموعة من sgRNAs ، و 1 ميكرولتر من محلول أحمر فينول بنسبة 0.5٪ ، ومياه خالية من النوكليز. استهدف تركيزا نهائيا من 400 نانوغرام / ميكرولتر من بروتين Cas9 و 200 نانوغرام / ميكرولتر من sgRNAs المجمعة في الماء الخالي من RNase أو نسبة 2: 1 من بروتين Cas9 إلى sgRNAs في الجنين المحقون. يمكن تخزين خليط الحقن هذا على الجليد لصباح يوم الحقن.
3. قم بإزالة لوحة الحقن من الثلاجة واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة على الأقل.
4. بعد تجميع كوكتيل الحقن ، اسمح للذكر والأنثى بالتزاوج ، على سبيل المثال ، عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج أو عن طريق وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى ، حسب الاقتضاء.
5. بعد وضع الأسماك ولكن قبل جمع الأجنة ، قم بقطع طرف إبرة غير مكسورة باستخدام شفرة حلاقة جديدة أو ملقط ناعم لإنشاء إبرة ذات تجويف صغير بما يكفي لتجنب تلف الجنين ولكنها واسعة بما يكفي بحيث لا تصبح مسدودة بخليط الحقن. بعد قطع الإبرة، قم بتحميل الإبرة بخليط الحقن باستخدام طرف ماصة محمل صغير يتم إدخاله في الطرف الخلفي من الشعيرات الدموية (انظر جداول المواد).
6. بعد ملء الإبرة ، احتضن الإبرة لمدة 5 دقائق في RT لتجميع مجمعات Cas9-sgRNA.
7. قم بتشغيل الحاقن الدقيق وأدخل الإبرة في المتلاعب الدقيق. ضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرومتر وقم بمعايرة الإبرة عن طريق ضبط ضغط الحقن حتى تخرج الإبرة بلعة 1 نانولتر في الزيت المعدني.
   ملاحظة: عند الحقن في الزيت المعدني ، سيكون قطر البلعة 1 نانولتر حوالي 0.125 مم (أو نصف قطرها 0.062 مم) كما تم قياسه باستخدام شريحة الميكرومتر.
8. لمزامنة الأجنة ، اجمعها بعد 10 دقائق باستخدام مصفاة بلاستيكية وشطفها في طبق بتري باستخدام وسائط E3 1x (5 mM NaCl ، 0.17 mM KCl ، 0.33 mM CaCl₂ ، 0.33 mM MgSO₄ ، وأضف 20 ميكرولتر من 0.03 M Methylene Blue لكل 1 لتر من 1x E3). قم بإزالة 10-15 جنينا ووضعها في طبق بتري منفصل ليتم الاحتفاظ بها كعناصر تحكم غير محقونة.
9. نقل بقية الأجنة النامية إلى آبار صفيحة الحقن.
10. حقن 1 نانولتر من المحلول (ما مجموعه 400 جزء من بروتين Cas9 و 200 جزء من الحمض النووي الريبوزي المرسال) في القرص الأرومي النامي لجنين أحادي الخلية. إذا أصبح طرف الإبرة مسدودا ، فاستخدم الملقط لكسر الطرف الخلفي وإعادة معايرة الإبرة لإخراج بلعة 1 nL. تأكد من حقن جميع الأجنة خلال أول 40 دقيقة من التطور بعد الإخصاب.
11. بعد اكتمال الحقن ، أعد الأجنة المحقونة إلى طبق بتري المسمى الذي يحتوي على وسائط 1x E3 والسماح لها بالتطور طوال اليوم. قم بإزالة أي أجنة غير مخصبة أو لا تتطور بشكل طبيعي وفقا لسلسلة مراحل الزرد²⁹.

4. فحص INDELs الجسدية في الأجنة المحقونة F0

ملاحظة: يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد INDELs ، مثل اختبار T7 endonuclease I أو تحليل الذوبان عالي الدقة ، عند تحديد ما إذا كانت الأجنة تحتوي على INDELs ³⁰ الجسدية.

1. في اليوم التالي بعد الحقن ، قم بإزالة الأجنة المعيبة والمحللة من طبق بتري واستبدل وسائط 1x E3 للحفاظ على صحة الجنين.
2. بعد تنظيف الطبق ، اجمع ستة أجنة محقونة صحية واثنين من أجنة التحكم من الطبق غير المحقون. ضع كل جنين على حدة في بئر واحد من أنبوب شريط PCR وقم بتسمية الجزء العلوي من الأنابيب.
3. لاستخراج الحمض النووي الجينومي للأجنة الفردية ، قم بإزالة وسائط E3 الزائدة من آبار أنبوب الشريط وإضافة 100 ميكرولتر من 50 mM NaOH لكل بئر.
4. احتضن الأجنة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتبريد العينات إلى 4 درجات مئوية ، وأضف 10 ميكرولتر من 1 M Tris HCL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، ودوامها لمدة 5 إلى 10 ثوان. يمكن تخزين هذا الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل دون تدهور كبير في الحمض النووي.
5. صمم اشعال فحص فريد لكل موقع دليل لتضخيم جزء الحمض النووي بقوة 100-110 نقطة أساس يتضمن الموقع المستهدف CRISPR-Cas9. إذا كان ذلك ممكنا ، ضع الموقع المستهدف في منتصف الجزء المضخم ، مما يسمح بتحديد عمليات الحذف الأكبر.
6. لكل موقع من المواقع الأربعة المستهدفة الإرشادية، قم بإعداد ثمانية تفاعلات PCR سعة 25 ميكرولتر باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي أحادي الجنين المحضر، ومزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل، وأوليات الفحص الخاصة بالدليل لتحديد الطفرات الجسدية في الموقع المستهدف (الجدول 1).
7. قم بصب 2.5٪ agarose / 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم / هلام TBE باستخدام أمشاط تخلق آبارا بعرض 0.625 سم تقريبا. يسمح هذا المشط العريض بدقة أفضل عند اكتشاف تغيرات الحجم في التسلسل الجينومي. بعد أن يتصلب الجل ، ضعه في غرفة الرحلان الكهربائي التي تحتوي على مخزن مؤقت يعمل ب TBE.
8. أضف 5 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x إلى منتج PCR وقم بتحميل 25 ميكرولتر من هذا الخليط في الجل. تأكد من تشغيل عينات الحقن والتحكم على نفس الصف من الجل. بعد تحميل جميع العينات ، أضف 5 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم لكل 1 لتر من المخزن المؤقت TBE إلى الطرف الإيجابي لصندوق الهلام.
9. قم بتشغيل الجل على 120 فولت حتى تزول نطاقات الحمض النووي أو يقترب الحمض النووي من نهاية الحارة. إذا أنشأ Cas9 INDELs في الموقع المستهدف ، فعادة ما يتم ملاحظة مسحة في العينات المحقونة ولكن ليس في عناصر التحكم.
10. إذا لوحظت مسحات في ما لا يقل عن ثلاثة من أصل أربعة مواقع إرشادية في الأجنة المحقونة بأربعة حمض نووي ريبي مرشد ، فتنمو الأجنة المحقونة الشقيقة.
11. عندما لا تحتوي العينات المحقونة على مسحات في العدد المطلوب من مواقع التوجيه ، قم بتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي الجديد ليحل محل تلك التي لم تعمل وإنشاء مجموعة جديدة من الحمض النووي الريبي الإرشادي الذي يتضمن تلك التي عملت وتلك المصممة حديثا. حقن واختبار تجمع جديد ل INDELs الجسدية كما هو موضح أعلاه.

5. تحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في أجنة الأمهات المقرمشة

ملاحظة: بمجرد أن تصل إناث F0 المحقونة إلى مرحلة النضج الجنسي، فإن خلاياها الجرثومية لديها القدرة على توليد خليط من الأجنة المقرمشة والبرية للأمهات. على الرغم من أن هذا الخليط يسمح بضوابط داخلية للإخصاب وتوقيت النمو ، إلا أنه لا يزال من المفيد إعداد incross من النوع البري كعنصر تحكم خارجي في حالة وجود قابض من أنثى F0 يحتوي فقط على أجنة هشة للأمهات.

1. في فترة ما بعد الظهر قبل التجربة ، قم بإعداد الإناث المحقونة F0 ضد الذكور من النوع البري والتحكم في الصلبان من النوع البري في صناديق تزاوج الزرد القياسية. ضع كلا من الأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ولكن افصلها بمقسم صندوق التزاوج أو ضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض.
2. في صباح يوم التجربة، اسمح للذكر والأنثى بالبدء في التزاوج، على سبيل المثال، عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج أو وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى.
3. اجمع الأجنة كل 10 دقائق عن طريق تحريك إدراج وضع البيض في قاع خزان تزاوج جديد يحتوي على مياه نظام عذبة وقم بتسمية الخزان بعلامة تحدد أنثى F0 الفردية. خذ خزان التزاوج القديم وصب الماء من خلال مصفاة الشاي لجمع الأجنة من قابض فردي واحد لمدة 10 دقائق.
4. بمجرد جمع الأجنة من قابض واحد مدته 10 دقائق في المصفاة ، انقلها إلى طبق بتري يحتوي على وسائط 1x E3. ضع علامة على طبق بتري مع وقت الجمع ومعلومات السمك.
5. تحت مجهر تشريحي مع مصدر ضوء منقول ، راقب الأجنة التي تمر بالتطور كل ساعة لأول 6-8 ساعات ويوميا لمدة 5 أيام القادمة.
6. تحديد الأجنة المقرمشة المحتملة للأمهات من خلال التغيرات المورفولوجية الإجمالية في نموها مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري المتطابقة زمنيا²⁹.
7. انقل الأجنة المقرمشة المحتملة للأمهات إلى طبق بتري يحتوي على وسائط 1x E3 وفحص النمط الظاهري المورفولوجي عند 24 hpf وقابلية البقاء (على سبيل المثال ، تضخم المثانة السباحة) في 5 أيام بعد الإخصاب.

6. تسلسل الأليلات في الهابلويدات الهشاشة للأمهات

ملاحظة: تحتوي المفردات المقرمشة للأمهات على أليل واحد في الموضع المستهدف ، مما يسمح بتحديد INDELs في الجين المستهدف عبر تسلسل Sanger. يمكن أيضا تحليل أجنة الهابلويدات المقرمشة للأمهات باستخدام اختبارات تسلسل الجيل التالي. من المتوقع أن تحمل الأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا هشا للأم آفة في واحد على الأقل من المواقع الأربعة المستهدفة (انظر المناقشة).

1. في فترة ما بعد الظهر قبل التجربة ، قم بإعداد أزواج تزاوج من إناث F0 المعروفة بإنتاج أجنة هشة للأمهات عبرت إلى ذكور من النوع البري. حافظ على فصل الذكور من النوع البري جسديا عن الإناث باستخدام مقسم مربع التزاوج أو ضع الأنثى في إدراج وضع البيض.
2. في صباح يوم التجربة ، قم بإزالة القسم المادي أو ضع كل من الذكور والإناث داخل إدراج وضع البيض لبدء التزاوج. في أول علامة على وضع البيض ، قاطع التكاثر عن طريق فصل الذكور والإناث F0. احتفظ بكل أنثى F0 منفصلة في صناديق تزاوج فردية.
3. قم بإعداد محلول الحيوانات المنوية المعالج بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام خصيتين من ذكر واحد من النوع البري لكل 100 ميكرولتر من محلول هانك (الجدول 2) ، وهو ما يكفي لتخصيب البويضات المبثوقة من أنثى واحدة ، كما هو موضح سابقا³¹.
4. بثق البويضات الناضجة يدويا من إناث F0 المختارة مسبقا وإجراء الإخصاب في المختبر (IVF) باستخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية³¹.
5. بعد الإخصاب في المختبر ، اسمح للأجنة الفردية بالتطور حتى يتم ملاحظة النمط الظاهري الهش للأم ووضع تلك الأجنة في طبق بتري مختلف.
6. بمجرد تحديد الأجنة الفردية المقرمشة للأمهات ، اسمح لها بالتطور لمدة 6 ساعات على الأقل بعد الإخصاب.
7. لاستخراج الحمض النووي الجيني من عشرة أجنة فردية هشة على الأقل للأمهات ، ضع جنينا فرديا واحدا في بئر فردي من أنبوب شريط PCR ، وقم بإزالة وسائط E3 الزائدة من البئر وإضافة 50 ميكرولتر من 50 mM NaOH.
8. احتضن الأجنة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتبريد العينات إلى 4 درجات مئوية ، وأضف 5 ميكرولتر من 1 M Tris HCL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، والدوامة لمدة 5-10 ثوان. يمكن تخزين الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
9. لتحديد مواقع الدليل التي تحتوي على INDELs، قم بتصميم الاشعال للتسلسل لتضخيم جزء من الحمض النووي يتضمن جميع المواقع الأربعة المستهدفة CRISPR-Cas9. تسمح هذه الاشعال التسلسلية بتحديد INDELs التي تمتد عبر مواقع إرشادية متعددة.
10. قم بإعداد تفاعلين PCR 25 ميكرولتر لكل جنين باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي المحضر والاشعال التسلسلي.
11. بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل، قم بتنقية العينتين وتركيزهما باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي والمكثفات (انظر جدول المواد). ثم أرسل جزء الحمض النووي إلى تسلسل Sanger باستخدام كل من الاشعال للتسلسل الأمامي والخلفي.
12. بعد تسلسل الجزء الهش الأمومي الفرداني ، قم بمحاذاته مع تسلسل النوع البري وحدد INDELs في المواقع المستهدفة باستخدام برنامج محاذاة التسلسل.

النتائج

يسمح النهج التجريبي الموصوف في هذا البروتوكول بتحديد الأنماط الظاهرية لتأثير الأم بطريقة سريعة وفعالة في استخدام الموارد (الشكل 1).

توليد المقرمشات الأمومية :
عند تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي الأربعة لاستهداف جين واحد مرشح للتأثير الأمومي?...

Discussion

يسمح البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة بتحديد وتوصيف جزيئي أولي للنمط الظاهري للتأثير الأمومي في جيل واحد بدلا من الأجيال المتعددة المطلوبة لكل من التقنيات الجينية الأمامية والعكسية. حاليا ، دور العديد من الجينات المعبر عنها من قبل الأم غير معروف. ويرجع هذا النقص في المعرفة جزئيا إلى الج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes