Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos

Resumo

O desenvolvimento inicial depende de produtos herdados maternalmente, e o papel de muitos desses produtos é atualmente desconhecido. Neste trabalho, descrevemos um protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenótipos de efeito materno em uma única geração.

Resumo

O desenvolvimento precoce depende de um conjunto de fatores maternos incorporados ao ovócito maduro durante a oogênese que desempenham todas as funções celulares necessárias para o desenvolvimento até a ativação do genoma zigótico. Normalmente, o direcionamento genético desses fatores maternos requer uma geração adicional para identificar fenótipos de efeito materno, dificultando a capacidade de determinar o papel dos genes expressos maternalmente durante o desenvolvimento. A descoberta das capacidades de edição bialélica da CRISPR-Cas9 permitiu a triagem de fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados ou "crispants", aumentando a compreensão do papel que os genes zigoticamente expressos desempenham nos programas de desenvolvimento. Este artigo descreve um protocolo que é uma extensão do método crispant. Neste método, a edição bialélica de células germinativas permite o isolamento de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, ou "crispants maternos". A multiplexação de RNAs guia para um único alvo promove a produção eficiente de crispants maternos, enquanto a análise de sequência de haploides crispantes maternos fornece um método simples para corroborar lesões genéticas que produzem um fenótipo de efeito materno. O uso de crispants maternos suporta a rápida identificação de genes maternos essenciais expressos, facilitando assim a compreensão do desenvolvimento precoce.

Introdução

Um conjunto de produtos depositados maternalmente (por exemplo, RNAs, proteínas e outras biomoléculas) é necessário para todos os processos celulares iniciais até que o genoma zigótico do embrião seja ativado¹. O esgotamento prematuro desses produtos do ovócito é tipicamente letal embrionário. Apesar da importância desses genes no desenvolvimento, o papel de muitos genes expressos maternalmente é atualmente desconhecido. O avanço da tecnologia de edição de genes em peixes-zebra, como o CRISPR-Cas9, possibilita o direcionamento de genes expressos maternalmente ^2,3,4. No entanto, a identificação de um fenótipo de efeito materno requer uma geração extra quando comparada a um fenótipo zigótico, necessitando, portanto, de mais recursos. Recentemente, a capacidade de edição bialélica da CRISPR-Cas9 tem sido utilizada para rastrear fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados (F0), conhecidos como "crispants"5,6,7,8,9,10. A técnica crispante permite a triagem eficiente em termos de recursos de genes candidatos em células somáticas, facilitando a compreensão de aspectos específicos no desenvolvimento. O protocolo descrito neste trabalho permite a identificação de fenótipos de efeito materno, ou "crispants maternos", em uma única geração¹¹. Este esquema é alcançável pela multiplexação de RNAs guia para um único gene e promovendo eventos de edição bialélica na linha germinativa. Esses embriões crispantes maternos podem ser identificados por fenótipos morfológicos macroscópicas e submetidos à caracterização primária, como marcação para limites celulares e padronização do DNA¹¹. A análise combinada do fenótipo observável e a caracterização molecular básica dos INDELs induzidos permitem a previsão do papel do gene alvo no desenvolvimento inicial.

No peixe-zebra, durante as primeiras 24 h pós-fertilização (hpf), um pequeno grupo de células se desenvolve nas células germinativas primordiais, precursoras da linha germinativa^12,13,14,15. Nas garras colocadas por fêmeas F0, a proporção de embriões crispantes maternos recuperados depende de quantas células germinativas contêm um evento de edição bialélico no gene alvo. Em geral, quanto mais cedo o evento de edição ocorrer no embrião, maior a probabilidade de mutações CRISPR-Cas9 serem observadas na linha germinativa. Na maioria dos casos, os fenótipos de embriões crispantes maternos vêm da perda de função nos dois alelos maternos presentes no ovócito em desenvolvimento. À medida que o ovócito termina a meiose, um dos alelos maternos é extrudado do embrião através do corpo polar, enquanto o outro alelo é incorporado ao pronúcleo materno. O sequenciamento de múltiplos haploides crispantes maternos representará uma mistura das mutações (inserções e/ou deleções (INDELs)) presentes na linha germinativa que contribuem para o fenótipo¹¹.

O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para criar mutações CRISPR-Cas9 em genes de efeito materno e identificar o fenótipo correspondente usando uma abordagem materna crispante (Figura 1). A seção um explicará como efetivamente projetar e criar RNAs guia, enquanto as seções dois e três contêm etapas críticas para a criação de crispants maternos por microinjeção. Após a injeção da mistura CRISPR-Cas9, os embriões injetados são rastreados para edições somáticas via PCR (secção quatro). Uma vez que os embriões F0 injetados se desenvolvem e atingem a maturidade sexual, as fêmeas F0 são cruzadas para machos selvagens e seus descendentes são rastreados para fenótipos de efeito materno (seção cinco). A seção seis inclui instruções sobre como fazer haploides crispantes maternos que podem ser combinados com o sequenciamento de Sanger para identificar os INDELs induzidos por CRISPR-Cas9. Além disso, a Discussão contém modificações que podem ser feitas no protocolo para aumentar a sensibilidade e o poder desse método.

Protocolo

Nos estudos que levaram ao desenvolvimento deste protocolo, todos os alojamentos e experimentos de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).

1. Síntese de RNAs Guia

NOTA: Os crispants zigóticos foram criados usando um único RNA guia ou multiplexando múltiplos RNAs guia para um único alvo 5,6,7,8,9,10. A multiplexação de RNAs-guia aumenta a porcentagem de embriões que apresentam fenótipo crispante zigótico¹⁰. Devido a esse aumento da frequência de embriões que exibem um fenótipo, os crispants maternos são criados pela multiplexação de quatro RNAs guia para um único gene. Um protocolo mais detalhado sobre o uso do CHOPCHOP para o projeto de RNAs guia e um método de recozimento para sintetizar RNAs guia para peixe-zebra podem ser encontrados em outros lugares 16,17,18,19,20.

1. Para identificar um gene expresso maternalmente para o alvo, verifique os níveis de transcrito de mRNA durante o desenvolvimento através de um banco de dados de sequência de RNA que fornece informações de transcriptoma do zigoto a 5 dias²¹. Em geral, os genes materno-específicos são altamente expressos no embrião inicial e são degradados após a ativação do genoma zigótico²².
2. Uma vez que um gene alvo expresso maternalmente tenha sido identificado, determine o primeiro domínio proteico previsto usando a seção "domínios e características" disponível no navegador do genoma Ensembl²³. Use este domínio como a região de destino para os quatro RNAs guia.
3. Use o programa de seleção de RNA guia CHOPCHOP para identificar quatro locais-alvo de RNA guia no primeiro domínio ativo. Projetar oligonucleotídeos específicos de genes, conforme mostrado abaixo para cada local de destino. No oligonucleotídeo específico do gene, a seção N²⁰ corresponde à sequência alvo menos o sítio PAM (NGG) do CHOPCHOP. Ordene estes oligonucleotídeos específicos de genes e o oligonucleótido constante usando purificação de dessal padrão (ver Tabela de Materiais).
   Oligonucleotídeo gene-específico:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Para criar um modelo de RNA guia para cada oligonucleotídeo específico do gene, recozê-lo ao oligonucleotídeo constante e preencher as saliências com T4-DNA polimerase conforme descrito anteriormente¹⁶. Depois que os quatro modelos de RNA guia forem montados, purifice-os e concentre-os juntos usando um kit de limpeza e concentrador de DNA de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
5. Sintetize a mistura de sgRNA a partir do modelo de RNA guia agrupado usando um kit de transcrição T7 in vitro (consulte Tabela de Materiais). Realizar a transcrição in vitro de acordo com as instruções do fabricante. O uso de meias-reações do kit de transcrição T7 pode diminuir o custo por reação.
6. Após a síntese de RNA, purificar o pool resultante de sgRNAs utilizando um protocolo de etanol/acetato de amônio, conforme descrito anteriormente 16,20,24. Após o RNA ter sido isolado, ressuscite-o em 20 μL de água livre de nuclease. Se meias-reações do kit de transcrição T7 foram usadas para transcrever o pool de sgRNAs, ressuspense o RNA purificado em 10-15 μL de água livre de nuclease.
7. Quantifique a quantidade de sgRNAs agrupados que foram criados usando um espectrofotômetro. Diluir o pool de sgRNAs em água livre de nuclease para uma diluição de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Normalmente, o volume final da diluição de trabalho varia de 30-50 μL.
8. Depois de determinar a concentração do pool de sgRNAs, verifique a integridade dos sgRNAs em um gel de agarose a 1%.
   1. Lançar um gel de brometo de etídio/TBE a 1% de agarose/0,5 μg/mL. Uma vez que o gel tenha se solidificado, coloque-o no buffer de execução TBE.
   2. Misture 1 μL da mistura de sgRNA e 1 μL de tampão de carregamento de gel de RNA (ver Tabela de Materiais). Carregue esta amostra no gel e passe o gel a 100 V por 5 min.
9. Visualize as bandas usando luz ultravioleta (UV). O pool de sgRNAs deve aparecer como uma única banda. Se um esfregaço for observado, a degradação do RNA provavelmente ocorreu.
10. Armazenar o conjunto de sgRNAs em alíquotas de 1 μL de uso único em tubos de tira de PCR sem nuclease no congelador de -80 °C. Para grandes volumes de mistura de sgRNAs (30 μL ou mais), alíquota metade do volume nos tubos de tira de PCR livres de nuclease e armazene a outra metade como um volume maior em um tubo de microcentrífuga livre de nuclease. Descongelar e alíquota quando necessário.
11. Para evitar a degradação do ARN, certifique-se de que as amostras no tubo de microcentrífuga não sofram mais do que dois ciclos de congelamento-descongelamento.

2. Preparação de reagentes e materiais para microinjeção

NOTA: No peixe-zebra, a injeção de mRNA Cas9 pode criar crispants zigóticos. No entanto, estudos têm demonstrado que a proteína Cas9 é mais eficiente na criação de INDELs em embriões injetados^16,25. Este protocolo usa a proteína Cas9 para gerar crispants maternos porque esta proteína não experimenta o mesmo atraso na atividade que o mRNA Cas9 injetado. Em teoria, isso deve aumentar a probabilidade de uma mutação bialélica no início do desenvolvimento, resultando em uma maior chance de uma seção mais extensa da linha germinativa ser afetada. Outros protocolos e recursos detalhando como se preparar para microinjeções podem ser encontrados em outros lugares^24,26.

1. Compre ou gere proteína Cas9 (consulte Tabela de Materiais). Ressuscite a proteína Cas9 em água isenta de nuclease para produzir uma solução de 2 mg/mL e uma alíquota de 1 μL em tubos de microcentrífuga de polipropileno livres de RNase. Armazene-os como tubos de uso único a -80 °C.
2. Na tarde anterior à injeção, use um extrator de micropipeta para puxar um capilar de vidro e criar uma agulha de injeção. Armazene a agulha ininterrupta em um suporte de agulha fechado até a manhã das microinjeções.
3. Para criar uma placa de injeção, despeje 20 mL de agarose/H₂O estéril a 1,5% para encher metade de uma placa de Petri de 100 mm X 15 mm e aguarde que ela se solidifique. Uma vez ajustada a solução de agarose, adicione 20 ml de agarose/H₂O estéril a 1,5% à placa de Petri e coloque o molde de plástico (ver Tabela de Materiais) na agarose líquida e deixe-a endurecer.
4. Depois que a agarose endurecer, remova o molde de plástico e armazene a placa de injeção de cabeça para baixo em uma geladeira até a manhã das injeções. Uma única placa pode ser usada para múltiplas injeções, desde que os poços mantenham sua integridade.

3. Microinjeção de coquetel CRISPR-Cas9 em um embrião de peixe-zebra de uma célula para gerar crispants maternos

NOTA: Mais recursos para microinjeção em embriões de peixe-zebra podem ser encontrados em outros lugares^24,26,27. Injetar a mistura CRISPR-Cas9 no blastodisco em desenvolvimento de embriões unicelulares pode aumentar a probabilidade de criar crispants maternos. A mistura também pode ser injetada no saco vitelino até o estágio de 2 células. No entanto, as misturas injetadas na gema dependem do fluxo ooplasmático para atingir o blastodisco, de modo que o CRISPR-Cas9 injetado na gema poderia diminuir a eficiência de corte do CRISPR-Cas9²⁸.

1. Na tarde anterior às microinjeções, configure cruzamentos do tipo selvagem em caixas de acasalamento de peixe-zebra. Mantenha os peixes machos e fêmeas no mesmo aquário, mas separe-os com um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos.
2. Na manhã do experimento, retirar uma alíquota de 2 mg/mL de proteína Cas9 e uma alíquota do pool de sgRNAs. No tubo de microcentrífuga de polipropileno livre de RNase que contém a proteína Cas9, monte uma mistura de injeção de 5 μL que inclua o pool de sgRNAs, 1 μL de solução vermelha de fenol a 0,5% e água livre de nuclease. Apontar para uma concentração final de 400 ng/μL de proteína Cas9 e 200 ng/μL dos sgRNAs agrupados em água livre de RNase ou uma proporção de 2:1 de proteína Cas9 para sgRNAs no embrião injetado. Esta mistura de injeção pode ser armazenada em gelo durante a manhã da injeção.
3. Retire uma placa de injeção do frigorífico e deixe-a aquecer até à temperatura ambiente (RT) durante, pelo menos, 20 minutos.
4. Após a montagem do coquetel de injeção, permita que o macho e a fêmea acasalem, por exemplo, removendo o divisor da caixa de acasalamento ou colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea, conforme apropriado.
5. Depois que o peixe tiver colocado, mas antes que os embriões tenham sido coletados, corte a ponta de uma agulha ininterrupta usando uma nova lâmina de barbear ou pinça fina para criar uma agulha que tenha um furo pequeno o suficiente para evitar danos ao embrião, mas seja larga o suficiente para que não fique entupida com a mistura de injeção. Depois de a agulha ter sido cortada, carregue a agulha com a mistura de injeção utilizando uma ponta de pipeta microcarregadeira inserida na extremidade traseira do capilar (ver Tabelas de Materiais).
6. Depois que a agulha estiver cheia, incube a agulha por 5 minutos no RT para montar os complexos de Cas9-sgRNA.
7. Ligue o microinjetor e insira a agulha no micromanipulador. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de micrômetro e calibre a agulha ajustando a pressão de injeção até que a agulha ejete um bolo de 1 nL no óleo mineral.
   NOTA: Ao injetar no óleo mineral, um bolus de 1 nL terá um diâmetro de aproximadamente 0,125 mm (ou raio de 0,062 mm), conforme medido com a lâmina do micrômetro.
8. Para sincronizar os embriões, colete-os após 10 min usando um filtro de plástico e enxágue-os em uma placa de Petri usando 1x meio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ e adicione 20 μL de 0,03 M de Azul de Metileno por 1 L de 1x E3). Remova 10-15 embriões e coloque-os em uma placa de Petri separada para serem mantidos como controles não injetados.
9. Transfira o resto dos embriões em desenvolvimento para os poços da placa de injeção.
10. Injetar 1 nL de solução (um total de 400 pg de proteína Cas9 e 200 pg de sgRNAs) no blastodisco em desenvolvimento de um embrião de uma célula. Se a ponta da agulha ficar entupida, use fórceps para quebrar a ponta para trás e recalibre a agulha para ejetar um bolo de 1 nL. Certifique-se de injetar todos os embriões durante os primeiros 40 minutos de desenvolvimento após a fertilização.
11. Após a conclusão da injeção, devolva os embriões injetados em uma placa de Petri marcada que contenha 1x meio E3 e permita que eles se desenvolvam ao longo do dia. Remova quaisquer embriões que não estejam fertilizados ou que não estejam se desenvolvendo normalmente de acordo com a série de estadiamento do peixe-zebra²⁹.

4. Rastreio de INDELs somáticos em embriões injetados F0

NOTA: Outros métodos para identificar INDELs, como o ensaio de endonuclease I T7 ou a análise de fusão de alta resolução, podem ser usados para determinar se os embriões contêm INDELs somáticos ³⁰.

1. No dia seguinte após as injeções, remova embriões defeituosos e lisados da placa de Petri e substitua o meio 1x E3 para manter a saúde do embrião.
2. Depois de limpar o prato, colete seis embriões saudáveis injetados e dois embriões de controle da placa não injetada. Coloque cada embrião individualmente em um único poço de um tubo de tira de PCR e rotule a parte superior dos tubos.
3. Para extrair o DNA genômico de embriões individuais, remova o excesso de meios E3 dos poços do tubo de tira e adicione 100 μL de 50 mM de NaOH por poço.
4. Incubar os embriões a 95 °C durante 20 min. Em seguida, arrefecer as amostras até 4 °C, adicionar 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vórtice durante 5 a 10 s. Este ADN extraído pode ser armazenado a -20 °C durante, pelo menos, 6 meses sem degradação significativa do ADN.
5. Projete iniciadores de triagem exclusivos para cada local de guia para amplificar um fragmento de DNA de 100-110 pb que inclui o local alvo CRISPR-Cas9. Se possível, coloque o local de destino no meio do fragmento amplificado, permitindo a identificação de deleções maiores.
6. Para cada um dos quatro locais-alvo de guia, configurar oito reações de PCR de 25 μL usando 5 μL do DNA genômico de embrião único preparado, mistura de PCR e os primers de triagem específicos do guia para identificar mutações somáticas no local alvo (Tabela 1).
7. Lançar um gel de brometo de etídio/TBE de 2,5% de agarose/0,5 μg/mL usando pentes que criem poços de aproximadamente 0,625 cm de largura. Este pente largo permite uma melhor resolução ao detectar alterações de tamanho na sequência genômica. Depois que o gel se solidificar, coloque-o em uma câmara de eletroforese que contenha tampão de execução TBE.
8. Adicione 5 μL de corante de carga 6x ao produto de PCR e carregue 25 μL desta mistura no gel. Certifique-se de que as amostras injetadas e de controle sejam executadas na mesma linha do gel. Depois de todas as amostras terem sido carregadas, adicionar 5 μL de brometo de etídio por 1 L de tampão de corrida TBE à extremidade positiva da caixa de gel.
9. Execute o gel a 120 V até que as bandas de DNA se resolvam ou o DNA se aproxime do final da pista. Se o Cas9 criou INDELs no local de destino, um esfregaço é tipicamente observado em amostras injetadas, mas não nos controles.
10. Se os esfregaços forem observados em um mínimo de três dos quatro locais de guia em embriões injetados com quatro RNAs guia, cresça os embriões irmãos injetados.
11. Sempre que as amostras injetadas não contiverem esfregaços no número necessário de locais de guia, projete novos RNAs guia para substituir aqueles que não funcionaram e crie um novo pool de RNAs guia que inclua os que funcionaram e os recém-projetados. Injete e teste o novo pool para INDELs somáticos, conforme descrito acima.

5. Identificação de fenótipos de efeito materno em embriões maternos crispantados

NOTA: Uma vez que as fêmeas F0 injetadas tenham atingido a maturidade sexual, suas células germinativas têm o potencial de gerar uma mistura de embriões maternos crispantes e do tipo selvagem. Mesmo que essa mistura permita controles internos para fertilização e tempo de desenvolvimento, ainda é benéfico configurar um cruzamento do tipo selvagem como um controle externo no caso de uma embreagem da fêmea F0 conter apenas embriões maternos crocantes.

1. Na tarde anterior ao experimento, configure as fêmeas injetadas F0 contra machos do tipo selvagem e controle cruzamentos do tipo selvagem em caixas de acasalamento padrão de peixe-zebra. Coloque os peixes machos e fêmeas no mesmo aquário, mas separe-os com um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos.
2. Na manhã do experimento, permita que o macho e a fêmea comecem a acasalar, por exemplo, removendo o divisor da caixa de acasalamento ou colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea.
3. Colete os embriões a cada 10 minutos, movendo a inserção de postura de ovos para um novo fundo de tanque de acasalamento que contenha água fresca do sistema e rotule o tanque com uma etiqueta identificando a fêmea F0 individual. Pegue o velho tanque de acasalamento e despeje a água através de um coador de chá para coletar os embriões de uma embreagem individual de 10 minutos.
4. Uma vez que os embriões de uma única embreagem de 10 minutos tenham sido coletados no filtro, transfira-os para uma placa de Petri contendo 1x meio E3. Rotule a placa de Petri com o tempo de coleta e as informações do peixe.
5. Sob um microscópio de dissecação com uma fonte de luz transmitida, observe os embriões em desenvolvimento a cada hora durante as primeiras 6-8 h e diariamente durante os próximos 5 dias.
6. Identificar potenciais embriões crispantes maternos por alterações morfológicas grosseiras em seu desenvolvimento em comparação com controles do tipo selvagem pareados pelo tempo²⁹.
7. Mova os embriões potencialmente crispantados maternos para uma placa de Petri que contenha 1x meio E3 e ensaio para fenótipo morfológico a 24 hpf e viabilidade (por exemplo, inflação da bexiga natatória) em 5 dias após a fertilização.

6. Sequenciamento de alelos em haploides crispantes maternos

NOTA: Os haploides crispantes maternos contêm um único alelo no locus alvo, permitindo a identificação de INDELs no gene alvo através do sequenciamento de Sanger. Embriões de haploides crispantes maternos também podem ser analisados usando ensaios de sequenciamento de próxima geração. Espera-se que embriões que apresentem um fenótipo crispante materno carreguem uma lesão em pelo menos um dos quatro locais-alvo (Ver Discussão).

1. Na tarde anterior ao experimento, montou pares de fêmeas F0 conhecidas por produzir embriões maternos entrelaçados cruzados para machos do tipo selvagem. Mantenha os machos do tipo selvagem fisicamente separados das fêmeas usando um divisor de caixa de acasalamento ou coloque a fêmea na inserção de postura de ovos.
2. Na manhã do experimento, remova a partição física ou coloque os machos e as fêmeas dentro da inserção de postura de ovos para iniciar o acasalamento. Ao primeiro sinal de postura de ovos, interrompa a reprodução separando os machos e as fêmeas F0. Mantenha cada fêmea F0 separada em caixas de acasalamento individuais.
3. Preparar solução espermática tratada com UV utilizando testículos de um macho selvagem para cada 100 μL de solução de Hank (Tabela 2), suficiente para fertilizar óvulos extrudados de uma fêmea, conforme descrito anteriormente³¹.
4. Extrudar manualmente óvulos maduros das fêmeas F0 pré-selecionadas e realizar fertilização in vitro (FIV ) utilizando o espermatozoide tratado com UV³¹.
5. Após a fertilização in vitro , permita que os embriões haploides se desenvolvam até que o fenótipo crispante materno seja observado e coloque esses embriões em uma placa de Petri diferente.
6. Uma vez que os embriões haploides crispantes maternos tenham sido identificados, permita que eles se desenvolvam por pelo menos 6 h após a fertilização.
7. Para extrair o DNA genômico de pelo menos dez embriões haploides crispantes maternos, coloque um único embrião haploide em um poço individual de um tubo de tira de PCR, remova o excesso de meios E3 do poço e adicione 50 μL de 50 mM de NaOH.
8. Incubar os embriões a 95 °C durante 20 min. Em seguida, arrefecer as amostras até 4 °C, adicionar 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vórtice durante 5-10 s. O DNA extraído pode ser armazenado a -20 °C por até 6 meses.
9. Para identificar quais locais de guia contêm INDELs, projete iniciadores de sequenciamento para amplificar um fragmento de DNA que inclua todos os quatro locais-alvo CRISPR-Cas9. Esses primers de sequenciamento permitem a identificação de INDELs que abrangem vários locais de guia.
10. Configure duas reações de PCR de 25 μL por embrião usando 5 μL do DNA genômico preparado e os primers de sequenciamento.
11. Após o término da PCR, purifice e concentre as duas amostras usando um kit de limpeza e concentrador de DNA (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, submeta o fragmento de DNA ao sequenciamento de Sanger usando os primers de sequenciamento para frente e para trás.
12. Após o fragmento crispante materno haploide ter sido sequenciado, alinhe-o à sequência do tipo selvagem e identifique INDELs nos locais-alvo usando um programa de alinhamento de sequência.

Resultados

A abordagem experimental descrita neste protocolo permite a identificação de fenótipos de efeito materno de forma rápida e eficiente em termos de recursos (Figura 1).

Gerando crispants maternos:
Ao projetar os quatro RNAs guia para atingir um único gene de efeito materno candidato, deve-se considerar especialmente onde os RNAs guia se ligarão ao DNA. Em geral, todos eles devem ser agrupados com regiões mínimas ou nenhuma sobreposição ...

Discussão

O protocolo apresentado neste manuscrito permite a identificação e caracterização molecular primária de um fenótipo de efeito materno em uma única geração, em vez das múltiplas gerações necessárias para técnicas genéticas avançadas e reversas. Atualmente, o papel de muitos genes expressos maternalmente é desconhecido. Essa falta de conhecimento se deve, em parte, à geração extra necessária para visualizar um fenótipo ao identificar genes de efeito materno. No passado, a rápida identificação de ge...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes