קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

Summary

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

Abstract

ההתפתחות המוקדמת תלויה במאגר של גורמים אימהיים המשולבים בביצית הבוגרת במהלך האוגנזה המבצעים את כל הפונקציות התאיות הדרושות להתפתחות עד להפעלת הגנום הזיגוטי. בדרך כלל, מיקוד גנטי של גורמים אימהיים אלה דורש דור נוסף כדי לזהות פנוטיפים של השפעה אימהית, המעכב את היכולת לקבוע את תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם במהלך ההתפתחות. גילוי יכולות העריכה הדו-אליליות של CRISPR-Cas9 איפשר הקרנה של פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים או "קריספונים", מה שהגביר את ההבנה של התפקיד שממלאים גנים בעלי ביטוי זיגוטי בתוכניות התפתחותיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול שהוא הרחבה של שיטת ה-crispant. בשיטה זו, העריכה הדו-אלילית של תאי הנבט מאפשרת בידוד של פנוטיפ בעל אפקט אימהי בדור אחד, או "קריספנטים אימהיים". ריבוי רנ"א מנחה למטרה אחת מקדם ייצור יעיל של קריספנטים אימהיים, בעוד שניתוח רצף של ההפלואידים הקריפנטים האימהיים מספק שיטה פשוטה לאימות נגעים גנטיים המייצרים פנוטיפ אפקט אימהי. השימוש בקריספנטים אימהיים תומך בזיהוי מהיר של גנים חיוניים המתבטאים באופן אימהי, ובכך מקל על ההבנה של התפתחות מוקדמת.

Introduction

מאגר של מוצרים שהופקדו על ידי האם (למשל, רנ"א, חלבונים וביו-מולקולות אחרות) נחוץ לכל התהליכים התאיים המוקדמים עד להפעלת הגנום הזיגוטי של העובר¹. הידלדלות מוקדמת של מוצרים אלה מהביצית היא בדרך כלל קטלנית עוברית. למרות חשיבותם של גנים אלה בהתפתחות, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע כיום. התקדמות בטכנולוגיית עריכת גנים בדגי זברה, כגון CRISPR-Cas9, מאפשרת מיקוד של גנים המתבטאים באופן אימהי ^2,3,4. עם זאת, זיהוי של פנוטיפ אפקט אימהי דורש דור נוסף בהשוואה לפנוטיפ זיגוטי, ולכן דורש יותר משאבים. לאחרונה, יכולת העריכה הדו-אלילית של CRISPR-Cas9 שימשה לסינון פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים (F0), המכונים "פרישנים"5,6,7,8,9,10. טכניקת ה-crispant מאפשרת סינון חסכוני במשאבים של גנים מועמדים בתאים סומטיים, מה שמקל על ההבנה של היבטים ספציפיים בהתפתחות. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי של פנוטיפים בעלי השפעה אימהית, או "פרישים אימהיים", בדור אחד¹¹. סכימה זו ניתנת להשגה על ידי ריבוי רנ"א מנחה לגן יחיד וקידום אירועי עריכה ביאליים בגרמלין. עוברים חדים אימהיים אלה ניתנים לזיהוי על ידי פנוטיפים מורפולוגיים גסים ועוברים אפיון ראשוני, כגון תיוג עבור גבולות התא ותבנית DNA¹¹. ניתוח משולב של הפנוטיפ הנצפה והאפיון המולקולרי הבסיסי של ה-INDELs המושרים מאפשר לחזות את תפקידו של הגן הממוקד בהתפתחות מוקדמת.

בדגי זברה, במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר ההפריה (hpf), קבוצה קטנה של תאים מתפתחת לתאי הנבט הקדמוניים, מבשר לנבט^12,13,14,15. במצמדים שהונחו על ידי נקבות F0, שיעור העוברים החדים האימהיים שהתאוששו תלוי בכמה תאי נבט מכילים אירוע עריכה ביאלי בגן הממוקד. באופן כללי, ככל שאירוע העריכה מתרחש מוקדם יותר בעובר, כך גדלה ההסתברות לצפייה במוטציות CRISPR-Cas9 בגרמן. ברוב המקרים, הפנוטיפים של עוברים פריכים אימהיים נובעים מאובדן תפקוד בשני האללים האימהיים הקיימים בביצית המתפתחת. כאשר הביצית מסיימת את המיוזה, אחד האללים האימהיים מובלט מהעובר דרך גוף הקוטב, ואילו האלל השני משתלב בפרונוקלאוס האימהי. הריצוף של מספר הפלואידים החד-קרניים האימהיים ייצג תערובת של המוטציות (החדרות ו/או מחיקות (INDELs)) הקיימות בגרמלין התורמות לפנוטיפ¹¹.

הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים ליצירת מוטציות CRISPR-Cas9 בגנים בעלי השפעה אימהית ולזיהוי הפנוטיפ המתאים באמצעות גישה של פרישנט אימהי (איור 1). החלק הראשון יסביר כיצד לתכנן וליצור באופן יעיל רנ"א מנחה, בעוד שסעיפים 2 ו-3 מכילים שלבים קריטיים ליצירת קריספנטים אימהיים על ידי מיקרו-הזרקה. לאחר הזרקת תערובת CRISPR-Cas9, עוברים מוזרקים נבדקים לעריכות סומטיות באמצעות PCR (סעיף 4). לאחר שעוברי F0 המוזרקים מתפתחים ומגיעים לבגרות מינית, נקבות ה-F0 עוברות לזכרים מסוג בר, וצאצאיהן נבדקים לפנוטיפים בעלי השפעה אימהית (סעיף 5). החלק השישי כולל הוראות להכנת הפלואידים קריספנטים אימהיים שניתן לשלב עם ריצוף סנגר כדי לזהות את ה-INDELs המושרים על ידי CRISPR-Cas9. בנוסף, הדיון מכיל שינויים שניתן לבצע בפרוטוקול כדי להגביר את הרגישות והעוצמה של שיטה זו.

Protocol

במחקרים שהובילו לפיתוח פרוטוקול זה, כל הדיור והניסויים של דגי זברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (IACUC-M005268-R2).

1. סינתזה של רנ"א מנחה

הערה: קריספנטים זיגוטיים נוצרו באמצעות RNA מנחה יחיד או ריבוי רנ"א מנחה מרובים למטרה אחת 5,6,7,8,9,10. ריבוי הרנ"א המנחה מגדיל את אחוז העוברים המציגים פנוטיפ פריך זיגוטי¹⁰. בשל התדירות המוגברת הזו של עוברים המציגים פנוטיפ, קריספנטים אימהיים נוצרים על ידי ריבוי ארבעה רנ"א מנחים לגן יחיד. פרוטוקול מפורט יותר על שימוש ב- CHOPCHOP לתכנון רנ"א מנחה ושיטת חישול לסינתזה של RNAs מנחים עבור דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים 16,17,18,19,20.

1. כדי לזהות גן בעל ביטוי אימהי שיש להתמקד בו, ודא את רמות השעתוק של mRNA במהלך הפיתוח באמצעות מסד נתונים של רצף RNA המספק מידע על תעתיק מזיגוטה עד 5 ימים²¹. באופן כללי, גנים ספציפיים לאמהות באים לידי ביטוי גבוה בעובר המוקדם ומתפרקים לאחר הפעלת הגנום הזיגוטי²².
2. לאחר זיהוי גן מטרה בעל ביטוי אימהי, קבע את תחום החלבון החזוי הראשון באמצעות סעיף "תחומים ותכונות" הזמין בדפדפן הגנום של Ensembl²³. השתמש בתחום זה כאזור היעד עבור ארבעת הרנ"א המנחים.
3. השתמש בתוכנית בחירת ה-RNA המנחה CHOPCHOP כדי לזהות ארבעה אתרי יעד של RNA מנחה בתחום הפעיל הראשון. תכנון אוליגונוקלאוטידים ספציפיים לגנים, כפי שמוצג להלן עבור כל אתר יעד. באוליגונוקלאוטיד הספציפי לגן, מקטע N²⁰ מתאים לרצף המטרה מינוס אתר PAM (NGG) מ-CHOPCHOP. סדרו את האוליגונוקלאוטידים הספציפיים לגנים האלה ואת האוליגונוקלאוטיד הקבוע באמצעות טיהור סטנדרטי של חומרים (ראו טבלת חומרים).
   אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGGATAGAAATAGCAAG 3'
4. כדי ליצור תבנית RNA מנחה עבור כל אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן, יש להצמיד אותה לאוליגונוקלאוטיד הקבוע ולמלא את השלוחות בפולימראז T4-DNA כפי שתואר קודם לכן¹⁶. לאחר הרכבת ארבע תבניות ה-RNA המנחות, יש לטהר ולרכז אותן יחד באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
5. סנתז את תערובת ה-sgRNA מתבנית ה-RNA של המדריך באמצעות ערכת שעתוק T7 במבחנה (ראו טבלת חומרים). בצע את התמלול במבחנה בהתאם להוראות היצרן. שימוש בחצאי תגובות של ערכת השעתוק T7 יכול להפחית את העלות לתגובה.
6. לאחר סינתזת RNA, טהרו את המאגר שנוצר של sgRNA באמצעות פרוטוקול אתנול/אמוניום אצטט כפי שתואר קודם לכן 16,20,24. לאחר שהרנ"א בודד, יש להשעות אותו ב-20 μL של מים נטולי נוקלאז. אם נעשה שימוש בחצי תגובות של ערכת השעתוק T7 כדי לתמלל את מאגר ה-sgRNA, יש להשהות את הרנ"א המטוהר ל-10-15 מיקרון מים נטולי נוקלאז.
7. לכמת את כמות ה-sgRNAs המאוגדים שנוצרו באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את מאגר ה-sgRNAs במים נטולי נוקלאז לדילול של 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. בדרך כלל, הנפח הסופי של דילול העבודה נע בין 30-50 μL.
8. לאחר קביעת הריכוז של מאגר ה- sgRNAs, ודא את שלמות ה- sgRNAs על ג'ל אגרוז של 1%.
   1. יצוק 1% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד/ג'ל TBE. לאחר שהג'ל התמצק, הניחו אותו במאגר TBE.
   2. יש לערבב 1 μL מתערובת sgRNA ו-1 μL של מאגר טעינת ג'ל RNA (ראו טבלת חומרים). טען דגימה זו בג'ל והפעל את הג'ל ב 100 V במשך 5 דקות.
9. דמיינו את הפסים באמצעות אור אולטרה סגול (UV). מאגר ה-sgRNAs אמור להופיע כלהקה אחת. אם נצפה מריחה, סביר להניח שהתרחשה השפלת RNA.
10. אחסנו את מאגר ה-sgRNAs באליקוטים חד-פעמיים של 1 μL בצינורות רצועת PCR נטולי נוקלאז במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. עבור כמויות גדולות של תערובת sgRNAs (30 μL או יותר), aliquot מחצית מהנפח לתוך צינורות רצועת PCR ללא נוקלאז ולאחסן את החצי השני כנפח גדול יותר בצינור microcentrifuge ללא נוקלאזה. להפשיר ולהציף בעת הצורך.
11. כדי למנוע התדרדרות RNA, ודא שהדגימות בצינור המיקרוצנטריפוגה עוברות לא יותר משני מחזורי הפשרה בהקפאה.

2. הכנת ריאגנטים וחומרים למיקרו הזרקה

הערה: בדגי זברה, הזרקת Cas9 mRNA יכולה ליצור פריכים זיגוטיים. עם זאת, מחקרים הראו כי חלבון Cas9 יעיל יותר ביצירת INDELs בעוברים מוזרקים^16,25. פרוטוקול זה משתמש בחלבון Cas9 כדי לייצר פריסנטים אימהיים מכיוון שחלבון זה אינו חווה את אותה פיגור בפעילות כמו ה-mRNA של Cas9 שהוזרק. בתיאוריה, זה אמור להגדיל את ההסתברות למוטציה ביאלית בשלב מוקדם בהתפתחות, וכתוצאה מכך גדל הסיכוי שמקטע נרחב יותר של הנבט יושפע. פרוטוקולים ומשאבים אחרים המפרטים כיצד להתכונן למיקרו-הזרקות ניתן למצוא במקומות אחרים^24,26.

1. רכשו או הפיקו חלבון Cas9 (ראו טבלת חומרים). יש למרוח את חלבון Cas9 במים נטולי נוקלאז כדי ליצור תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ו-aliquot 1 μL לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן ללא RNase. אחסן אותם כצינורות חד-פעמיים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. אחר הצהריים לפני ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית וליצור מחט הזרקה. אחסנו את המחט הלא שבורה במחזיק מחט סגור עד לבוקר המיקרו-הזרקות.
3. כדי ליצור צלחת הזרקה, יוצקים 20 מ"ל של 1.5% אגרוז / סטרילי H₂O כדי למלא מחצית צלחת פטרי 100 מ"מ X 15 מ"מ ולחכות שהיא תתמצק. לאחר הגדרת תמיסת האגרוז, הוסיפו 20 מ"ל של 1.5% אגרוז/סטרילי H₂O לצלחת הפטרי והכניסו את תבנית הפלסטיק (ראו טבלת חומרים) לתוך האגרוז הנוזלי ותנו לו להתקשות.
4. לאחר שהאגרוז התקשה, מוציאים את תבנית הפלסטיק ומאחסנים את צלחת ההזרקה במהופך במקרר עד לבוקר ההזרקות. ניתן להשתמש בצלחת אחת להזרקות מרובות כל עוד הבארות שומרות על שלמותן.

3. מיקרו-הזרקה של קוקטייל CRISPR-Cas9 לעובר של דג זברה חד-תאי ליצירת קריספנטים אימהיים

הערה: משאבים נוספים למיקרו-הזרקה לעוברים של דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים^24,26,27. הזרקת תערובת CRISPR-Cas9 לבלסטודיסק המתפתח של עוברים חד-תאיים עשויה להגדיל את ההסתברות ליצירת פריכים אימהיים. ניתן גם להזריק את התערובת לשק החלמון עד לשלב 2 התאים. עם זאת, תערובות המוזרקות לחלמון תלויות בזרימה אופלסמית כדי להגיע לבלסטודיסק, כך ש-CRISPR-Cas9 המוזרק לחלמון יכול להפחית את יעילות החיתוך של ה-CRISPR-Cas9²⁸.

1. אחר הצהריים לפני המיקרו-הזרקות, הציבו צלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות של דגי זברה. החזיקו את הדגים הזכריים והנקביים באותו מיכל אך הפרידו ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או הניחו את הנקבה בתוך מיכל הטלת ביצים.
2. בבוקר הניסוי, הוציאו אליקוט אחד של 2 מ"ג/מ"ל של חלבון Cas9 ואליקוט אחד של מאגר ה-sgRNA. בצינור המיקרו-צנטריפוגה נטול הפוליפרופילן נטול RNase המכיל את החלבון Cas9, הרכיבו תערובת הזרקה של 5 μL הכוללת את מאגר ה-sgRNAs, 1 μL של תמיסה אדומה פנול 0.5% ומים נטולי נוקלאז. יש לשאוף לריכוז סופי של 400 ng/μL חלבון Cas9 ו-200 ng/μL של ה-sgRNAs המאוגדים במים נטולי RNase או יחס של 2:1 של חלבון Cas9 ל-sgRNA בעובר המוזרק. תערובת הזרקה זו יכולה להיות מאוחסנת על קרח לבוקר ההזרקה.
3. הוציאו צלחת הזרקה מהמקרר ותנו לה להתחמם לטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות לפחות.
4. לאחר הרכבת קוקטייל ההזרקה, אפשרו לזכר ולנקבה להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או על ידי הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה, לפי הצורך.
5. לאחר שהדגים הניחו אך לפני שהעוברים נאספו, חתכו את קצה המחט הלא שבורה באמצעות סכין גילוח חדש או מלקחיים עדינים כדי ליצור מחט שיש לה בור קטן מספיק כדי למנוע נזק לעובר אך היא רחבה מספיק כדי שלא תיסתם בתערובת הזרקה. לאחר חיתוך המחט, יש לטעון את המחט עם תערובת ההזרקה באמצעות קצה פיפטה של microloader המוחדר לקצה האחורי של הנימי (ראו טבלאות חומרים).
6. לאחר מילוי המחט, דגירה של המחט למשך 5 דקות ב-RT כדי להרכיב קומפלקסים של Cas9-sgRNA.
7. הפעל את המיקרו-אינז'קטור והכנס את המחט למיקרומניפולטור. מניחים טיפת שמן מינרלי על מגלשה של מיקרומטר ומכיילים את המחט על ידי התאמת לחץ ההזרקה עד שהמחט פולטת בולוס של 1 ננומטר לתוך השמן המינרלי.
   הערה: בעת הזרקת השמן המינרלי, בולוס 1 nL יהיה בקוטר של כ-0.125 מ"מ (או רדיוס של 0.062 מ"מ) כפי שנמדד בשקופית המיקרומטר.
8. כדי לסנכרן את העוברים, אספו אותם לאחר 10 דקות באמצעות מסננת פלסטיק ושטפו אותם לצלחת פטרי באמצעות מדיה אחת E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, והוסיפו 20 μL של 0.03 M מתילן כחול לכל 1 ליטר של 1x E3). מוציאים 10-15 עוברים ומכניסים אותם לצלחת פטרי נפרדת כדי להישמר כבקרות לא מוזרקות.
9. העבירו את שאר העוברים המתפתחים לבארות של צלחת ההזרקה.
10. להזריק 1 nL של תמיסה (סך של 400 pg של חלבון Cas9 ו 200 pg של sgRNAs) לתוך blastodisc המתפתח של עובר חד-תאי. אם קצה המחט נסתם, השתמש במלקחיים כדי לשבור את הקצה בחזרה ולכייל מחדש את המחט כדי להוציא בולוס 1 nL. הקפידו להזריק את כל העוברים במהלך 40 הדקות הראשונות של ההתפתחות לאחר ההפריה.
11. לאחר השלמת ההזרקה, החזירו את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי מסומנת המכילה מדיה E3 אחת ואפשרו להם להתפתח לאורך כל היום. הסר את כל העוברים שאינם מופרים או שאינם מתפתחים באופן תקין על פי סדרת ההיערכות של דגי הזברה²⁹.

4. הקרנה ל-INDELs סומטיים בעוברים מוזרקים F0

הערה: ניתן להשתמש בשיטות אחרות לזיהוי INDELs, כגון בדיקת T7 endonuclease I או ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה, כאשר קובעים אם העוברים מכילים INDELs סומטיים ³⁰.

1. למחרת לאחר הזריקות, הסר עוברים פגומים ופגומים מצלחת פטרי והחלף את המדיה 1x E3 כדי לשמור על בריאות העובר.
2. לאחר ניקוי המנה, אספו שישה עוברים מוזרקים בריאים ושני עוברי בקרה מהצלחת הלא מוזרקת. הכניסו כל עובר בנפרד לתוך באר אחת של צינור רצועת PCR ותייגו את החלק העליון של הצינורות.
3. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי של עוברים בודדים, הסר את המדיה העודפת של E3 מהבארות של צינור הרצועה והוסף 100 μL של 50 mM NaOH לכל באר.
4. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 10 μL של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבבים אותן במשך 5 עד 10 שניות. ניתן לאחסן דנ"א מופק זה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות ללא פגיעה משמעותית בדנ"א.
5. תכנן פריימרים ייחודיים לסינון עבור כל אתר מדריך כדי להגביר מקטע DNA של 100-110 bp הכולל את אתר היעד CRISPR-Cas9. במידת האפשר, מקם את אתר היעד באמצע הקטע המוגבר, המאפשר זיהוי של מחיקות גדולות יותר.
6. עבור כל אחד מארבעת אתרי היעד המנחים, הגדר שמונה תגובות PCR של 25 μL באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן לעובר יחיד, תערובת PCR וראשוני הסינון הספציפיים למדריך כדי לזהות מוטציות סומטיות באתר היעד (טבלה 1).
7. יצוק ג'ל אתידיום ברומיד/TBE של 2.5% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות מסרקים היוצרים בארות ברוחב של כ-0.625 ס"מ. מסרק רחב זה מאפשר רזולוציה טובה יותר בעת זיהוי שינויי גודל ברצף הגנומי. לאחר שהג'ל התמצק, הכניסו אותו לתא אלקטרופורזה המכיל חיץ פועל של TUBE.
8. הוסיפו 5 μL של 6x צבע טעינה למוצר PCR וטענו 25 μL של תערובת זו לתוך הג'ל. ודא שדגימות ההזרקה והבקרה מופעלות באותה שורה של הג'ל. לאחר טעינת כל הדגימות, יש להוסיף 5 μL של אתידיום ברומיד לכל 1 ליטר של חיץ ריצה TBE לקצה החיובי של קופסת הג'ל.
9. הפעל את הג'ל ב-120 וולט עד שרצועות הדנ"א יתפתרו או שהדנ"א יתקרב לקצה הנתיב. אם ה-Cas9 יצר INDELs באתר היעד, בדרך כלל נצפה כתם בדגימות שהוזרקו, אך לא בפקדים.
10. אם נצפו מריחות במינימום של שלושה מתוך ארבעת אתרי ההדרכה בעוברים שהוזרקו להם ארבעה רנ"א מנחים, גדלו העוברים המוזרקים על ידי האחים.
11. בכל פעם שהדגימות המוזרקות אינן מכילות מריחות במספר הנדרש של אתרי מדריך, תכננו רנ"א מדריך חדש שיחליף את אלה שלא עבדו וצרו מאגר חדש של רנ"א מדריך הכולל את אלה שעבדו ואת אלה שעוצבו לאחרונה. להזריק ולבדוק את הבריכה החדשה עבור INDELs סומטיים כמתואר לעיל.

5. זיהוי פנוטיפים של אפקט אימהי בעוברים חדים אימהיים

הערה: ברגע שנקבות F0 המוזרקות הגיעו לבגרות מינית, לתאי הנבט שלהן יש פוטנציאל ליצור תערובת של עוברים אימהיים פריכים ועוברי בר. אף על פי שתערובת זו מאפשרת בקרות פנימיות להפריה ולתזמון התפתחותי, עדיין מועיל להגדיר צלב מסוג בר כבקרה חיצונית למקרה שמצמד מנקבת F0 מכיל רק עוברים פריכים אימהיים.

1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הציבו את הנקבות המוזרקות F0 נגד זכרים מסוג בר ושלטו בצלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות סטנדרטיות של דגי זברה. מניחים גם את הדגים הזכריים וגם את הדגים הנקביים באותו מיכל אך מפרידים ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או מניחים את הנקבה בתוך מיכל מטיל ביצים.
2. בבוקר הניסוי, אפשרו לזכר ולנקבה להתחיל להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה.
3. אספו את העוברים כל 10 דקות על ידי הזזת התוסף המטיל את הביצים לתחתית מיכל הזדווגות חדשה המכילה מי מערכת מתוקים ותייגו את המיכל עם תג המזהה את נקבת ה-F0 הבודדת. לוקחים את מיכל ההזדווגות הישן ויוצקים את המים דרך מסננת תה כדי לאסוף את העוברים ממצמד בודד אחד של 10 דקות.
4. לאחר שנאספו העוברים ממצמד יחיד של 10 דקות במסננת, העבירו אותם לצלחת פטרי המכילה מדיה E3 אחת. תייג את צלחת הפטרי עם זמן האיסוף ופרטי הדגים.
5. תחת מיקרוסקופ מנתח עם מקור אור המועבר, צפו בעוברים העוברים העוברים התפתחות כל שעה במשך 6-8 השעות הראשונות ומדי יום במשך 5 הימים הבאים.
6. זהה עוברים חדים אימהיים פוטנציאליים על ידי שינויים מורפולוגיים גולמיים בהתפתחותם בהשוואה לבקרות מסוג בר תואמות זמן²⁹.
7. העבירו את העוברים הפריכים האימהיים הפוטנציאליים לצלחת פטרי המכילה 1x E3 ובדיקה לפנוטיפ מורפולוגי ב-24 כ"ס וכדאיות (למשל, ניפוח שלפוחית השתן בשחייה) 5 ימים לאחר ההפריה.

6. ריצוף אללים בהפלואידים פריכים אימהיים

הערה: ההפלואידים החד-קרניים האימהיים מכילים אלל יחיד במוקד הממוקד, מה שמאפשר זיהוי של INDELs בגן המטרה באמצעות ריצוף סנגר. ניתן גם לנתח עוברי ההפלואידים הפריכים של האם באמצעות מבחני ריצוף מהדור הבא. עוברים המראים פנוטיפ פריך אימהי צפויים לשאת נגע לפחות באחד מארבעת אתרי היעד (ראו דיון).

1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הקימו זוגות הזדווגות של נקבות F0 הידועות כמייצרות עוברים חדים אימהיים שעברו לזכרים מסוג בר. יש להפריד פיזית את הזכרים מסוג בר מהנקבות באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או להניח את הנקבה בתא הטלת הביצים.
2. בבוקר הניסוי, הסירו את המחיצה הפיזית או הניחו גם את הזכרים וגם את הנקבות בתוך התוסף המטיל ביצים כדי ליזום הזדווגות. בסימן הראשון של הטלת ביצים, להפסיק את הרבייה על ידי הפרדת הזכר ואת נקבות F0. יש לשמור כל נקבת F0 מופרדת בתיבות הזדווגות נפרדות.
3. הכינו תמיסת זרע שטופלה ב-UV באמצעות אשכים של זכר אחד מסוג פרא עבור כל 100 μL של התמיסה של האנק (טבלה 2), מספיק כדי להפרות ביציות שהוברחו מנקבה אחת, כפי שתואר קודם^{לכן 31}.
4. חילוץ ידני של ביציות בוגרות מנקבות F0 שנבחרו מראש וביצוע הפריה חוץ גופית (IVF) באמצעות זרע³¹ שטופל ב-UV.
5. לאחר הפריה חוץ גופית , אפשרו לעוברים ההפלואידים להתפתח עד לתצפית על הפנוטיפ הפריך האימהי והכניסו את העוברים הללו לצלחת פטרי אחרת.
6. לאחר שזוהו עוברי ההפלואידים האימהיים, אפשרו להם להתפתח לפחות 6 שעות לאחר ההפריה.
7. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי מלפחות עשרה עוברים חד-פעמיים חד-הוריים, הנח עובר הפלואיד יחיד לתוך באר בודדת של צינור רצועת PCR, הסר מדיה עודפת של E3 מהבאר והוסף 50 μL של 50 mM NaOH.
8. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 5 מיקרון ליטר של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבולות במשך 5-10 שניות. ניתן לאחסן את הדנ"א המופק בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
9. כדי לזהות אילו אתרים מנחים מכילים INDELs, תכננו פריימרים לריצוף כדי להגביר מקטע דנ"א הכולל את כל ארבעת אתרי היעד של CRISPR-Cas9. פריימרים ריצוף אלה מאפשרים זיהוי של INDELs המשתרעים על פני מספר אתרי מנחה.
10. הגדר שתי תגובות PCR של 25 μL לכל עובר באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן והפריימרים של הריצוף.
11. לאחר סיום ה-PCR, יש לטהר ולרכז את שתי הדגימות באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן הגש את מקטע הדנ"א לריצוף סנגר באמצעות פריימרים של ריצוף קדימה ואחורה.
12. לאחר ריצוף מקטע הקריספנט האימהי ההפלואידי, יישרו אותו לרצף מסוג פראי וזהו INDELs באתרי היעד באמצעות תוכנית יישור רצף.

תוצאות

הגישה הניסויית המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי של פנוטיפים של השפעה אימהית באופן מהיר וחסכוני במשאבים (איור 1).

יצירת פריכיות אימהית:
כאשר מתכננים את ארבעת הרנ"א המנחים כך שיתמקדו בגן בעל השפעה אימהית מועמד יחיד, יש לתת את הדעת במיוחד למקום שבו ה?...

Discussion

הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה מאפשר זיהוי ואפיון מולקולרי ראשוני של פנוטיפ אפקט אימהי בדור אחד במקום הדורות המרובים הנדרשים לטכניקות גנטיות קדימה ואחורה. נכון לעכשיו, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע. חוסר ידע זה נובע בחלקו מהדור הנוסף הנדרש כדי לדמיין פנוטיפ בעת זיהוי גני?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes