Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Resumen

El desarrollo temprano depende de los productos heredados por la madre, y el papel de muchos de estos productos es actualmente desconocido. En este documento, describimos un protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenotipos de efecto materno en una sola generación.

Resumen

El desarrollo temprano depende de un conjunto de factores maternos incorporados al ovocito maduro durante la ovogénesis que realizan todas las funciones celulares necesarias para el desarrollo hasta la activación del genoma cigótico. Por lo general, la orientación genética de estos factores maternos requiere una generación adicional para identificar fenotipos de efecto materno, lo que dificulta la capacidad de determinar el papel de los genes expresados por la madre durante el desarrollo. El descubrimiento de las capacidades de edición bialélica de CRISPR-Cas9 ha permitido la detección de fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados o "crispantes", aumentando la comprensión del papel que desempeñan los genes expresados cigóticamente en los programas de desarrollo. En este artículo se describe un protocolo que es una extensión del método crispant. En este método, la edición bialélica de las células germinales permite el aislamiento de un fenotipo de efecto materno en una sola generación, o "crispantes maternos". La multiplexación guía a los ARN a un solo objetivo promueve la producción eficiente de crispantes maternos, mientras que el análisis de secuencia de haploides de crispantes maternos proporciona un método simple para corroborar las lesiones genéticas que producen un fenotipo de efecto materno. El uso de crispantes maternos apoya la rápida identificación de genes esenciales expresados por la madre, facilitando así la comprensión del desarrollo temprano.

Introducción

Un conjunto de productos depositados por la madre (por ejemplo, ARN, proteínas y otras biomoléculas) es necesario para todos los procesos celulares tempranos hasta que se active el genoma cigótico del embrión¹. El agotamiento prematuro de estos productos del ovocito es típicamente letal embrionario. A pesar de la importancia de estos genes en el desarrollo, el papel de muchos genes expresados por la madre es actualmente desconocido. El avance en la tecnología de edición de genes en el pez cebra, como CRISPR-Cas9, permite la focalización de genes expresados maternamente ^2,3,4. Sin embargo, la identificación de un fenotipo de efecto materno requiere una generación adicional en comparación con un fenotipo cigótico, por lo que requiere más recursos. Recientemente, la capacidad de edición bialélica de CRISPR-Cas9 se ha utilizado para detectar fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados (F0), conocidos como "crispantes"5,6,7,8,9,10. La técnica crispant permite la detección eficiente de genes candidatos en células somáticas, facilitando la comprensión de aspectos específicos en el desarrollo. El protocolo descrito en este trabajo permite la identificación de fenotipos de efecto materno, o "crispantes maternos", en una sola generación¹¹. Este esquema se puede lograr mediante la multiplexación de ARN guía a un solo gen y la promoción de eventos de edición bialélica en la línea germinal. Estos embriones maternos crispantes pueden identificarse por fenotipos morfológicos macroscópicos y someterse a una caracterización primaria, como el etiquetado de los límites celulares y el patrón de ADN¹¹. El análisis combinado del fenotipo observable y la caracterización molecular básica de los INDEL inducidos permite predecir el papel del gen objetivo en el desarrollo temprano.

En el pez cebra, durante las primeras 24 h después de la fertilización (hpf), un pequeño grupo de células se convierte en las células germinales primordiales, un precursor de la línea germinal^12,13,14,15. En las garras colocadas por hembras F0, la proporción de embriones maternos crispantes recuperados depende de cuántas células germinales contienen un evento de edición bialélico en el gen objetivo. En general, cuanto antes ocurra el evento de edición en el embrión, mayor será la probabilidad de que se observen mutaciones CRISPR-Cas9 en la línea germinal. En la mayoría de los casos, los fenotipos de embriones crujientes maternos provienen de la pérdida de función en los dos alelos maternos presentes en el ovocito en desarrollo. A medida que el ovocito termina la meiosis, uno de los alelos maternos se extruye del embrión a través del cuerpo polar, mientras que el otro alelo se incorpora al pronúcleo materno. La secuenciación de múltiples haploides crujientes maternos representará una mezcla de las mutaciones (inserciones y/o deleciones (INDELs)) presentes en la línea germinal que contribuyen al fenotipo¹¹.

El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para crear mutaciones CRISPR-Cas9 en genes de efecto materno e identificar el fenotipo correspondiente utilizando un enfoque de crispante materno (Figura 1). La sección uno explicará cómo diseñar y crear ARN guía de manera efectiva, mientras que las secciones dos y tres contienen pasos críticos para crear crispantes maternos mediante microinyección. Después de inyectar la mezcla CRISPR-Cas9, los embriones inyectados se examinan para detectar ediciones somáticas mediante PCR (sección cuatro). Una vez que los embriones F0 inyectados se desarrollan y alcanzan la madurez sexual, las hembras F0 se cruzan con machos de tipo salvaje, y sus crías son examinadas para detectar fenotipos de efecto materno (sección cinco). La sección seis incluye instrucciones sobre cómo hacer haploides crujientes maternos que se pueden combinar con la secuenciación de Sanger para identificar los INDEL inducidos por CRISPR-Cas9. Además, la Discusión contiene modificaciones que se pueden hacer al protocolo para aumentar la sensibilidad y el poder de este método.

Protocolo

En los estudios que condujeron al desarrollo de este protocolo, todos los alojamientos y experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).

1. Síntesis de ARN guía

NOTA: Los crispantes cigóticos se han creado utilizando un solo ARN guía o multiplexando múltiples ARN guía a un solo objetivo 5,6,7,8,9,10. La multiplexación de ARN guía aumenta el porcentaje de embriones que muestran un fenotipo cigótico crujiente¹⁰. Debido a esta mayor frecuencia de embriones que exhiben un fenotipo, los crispantes maternos se crean multiplexando cuatro ARN guía a un solo gen. Un protocolo más detallado sobre el uso de CHOPCHOP para diseñar ARN guía y un método de recocido para sintetizar ARN guía para el pez cebra se puede encontrar en otra parte 16,17,18,19,20.

1. Para identificar un gen expresado maternamente para apuntar, determinar los niveles de transcripción de ARNm durante el desarrollo a través de una base de datos de secuencias de ARN que proporciona información del transcriptoma desde el cigoto hasta 5 días²¹. En general, los genes específicos de la madre están altamente expresados en el embrión temprano y se degradan después de que se activa el genoma cigótico²².
2. Una vez que se ha identificado un gen diana expresado maternamente, determine el primer dominio proteico predicho utilizando la sección "dominios y características" disponible en el navegador del genoma Ensembl²³. Utilice este dominio como región objetivo para los cuatro ARN guía.
3. Utilice el programa de selección de ARN guía CHOPCHOP para identificar cuatro sitios diana de ARN guía en el primer dominio activo. Diseñar oligonucleótidos específicos de genes, como se muestra a continuación para cada sitio objetivo. En el oligonucleótido específico del gen, la sección N²⁰ corresponde a la secuencia objetivo menos el sitio PAM (NGG) de CHOPCHOP. Ordene estos oligonucleótidos específicos de genes y el oligonucleótido constante usando la purificación de desalinización estándar (ver Tabla de materiales).
   Oligonucleótido específico del gen:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Para crear una plantilla de ARN guía para cada oligonucleótido específico del gen, recociéndolo al oligonucleótido constante y rellene los voladizos con T4-ADN polimerasa como se describió anteriormente¹⁶. Después de ensamblar las cuatro plantillas de ARN guía, purifíquelas y concéntrelas juntas utilizando un kit concentrador y de limpieza de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
5. Sintetice la mezcla de sgRNA a partir de la plantilla de ARN guía agrupada utilizando un kit de transcripción T7 in vitro (consulte la Tabla de materiales). Realice la transcripción in vitro de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de medias reacciones del kit de transcripción T7 puede disminuir el costo por reacción.
6. Después de la síntesis de ARN, purificar el conjunto resultante de sgRNAs utilizando un protocolo de etanol/acetato de amonio como se describió anteriormente 16,20,24. Después de aislar el ARN, resuspenderlo en 20 μL de agua libre de nucleasas. Si se usaron medias reacciones del kit de transcripción T7 para transcribir el conjunto de sgRNAs, resuspender el ARN purificado en 10-15 μL de agua libre de nucleasas.
7. Cuantificar la cantidad de sgRNAs agrupados que se crearon utilizando un espectrofotómetro. Diluir el conjunto de sgRNAs en agua libre de nucleasas a una dilución de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Típicamente, el volumen final de la dilución de trabajo varía de 30-50 μL.
8. Después de determinar la concentración del conjunto de sgRNAs, verifique la integridad de los sgRNAs en un gel de agarosa al 1%.
   1. Lanzar una agarosa/0,5 μg/ml de bromuro de etidio al 1%/gel EBT. Una vez que el gel se haya solidificado, colóquelo en el búfer de ejecución TBE.
   2. Mezcle 1 μL de la mezcla de sgRNA y 1 μL de tampón de carga de gel de ARN (consulte la Tabla de materiales). Cargue esta muestra en el gel y ejecute el gel a 100 V durante 5 minutos.
9. Visualice las bandas usando luz ultravioleta (UV). El conjunto de sgRNAs debe aparecer como una sola banda. Si se observa un frotis, es probable que se haya producido una degradación del ARN.
10. Almacenar el conjunto de sgRNAs en alícuotas de 1 μL de un solo uso en tubos de tiras de PCR libres de nucleasa en el congelador de -80 °C. Para grandes volúmenes de mezcla de sgRNAs (30 μL o más), alícuota la mitad del volumen en los tubos de tira de PCR libres de nucleasa y almacenar la otra mitad como un volumen mayor en un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa. Descongelar y alícuota cuando sea necesario.
11. Para evitar la degradación del ARN, asegúrese de que las muestras en el tubo de microcentrífuga no se sometan a más de dos ciclos de congelación y descongelación.

2. Preparación de reactivos y materiales para microinyección

NOTA: En el pez cebra, la inyección de ARNm Cas9 puede crear crujientes cigóticos. Sin embargo, estudios han demostrado que la proteína Cas9 es más eficiente en la creación de INDELs en embriones inyectados^16,25. Este protocolo utiliza la proteína Cas9 para generar crispantes maternos porque esta proteína no experimenta el mismo retraso en la actividad que el ARNm Cas9 inyectado. En teoría, esto debería aumentar la probabilidad de una mutación bialélica temprana en el desarrollo, lo que resulta en una mayor probabilidad de que una sección más extensa de la línea germinal se vea afectada. Otros protocolos y recursos que detallan cómo prepararse para las microinyecciones se pueden encontrar en otra parte^24,26.

1. Compre o genere proteína Cas9 (consulte la Tabla de materiales). Resuspender la proteína Cas9 en agua libre de nucleasa para hacer una solución de 2 mg/ml y alícuota 1 μL en tubos de microcentrífuga de polipropileno libres de RNasa. Almacénelos como tubos de un solo uso a -80 °C.
2. La tarde antes de la inyección, use un extractor de micropipetas para tirar de un capilar de vidrio y crear una aguja de inyección. Guarde la aguja intacta en un soporte de aguja cerrado hasta la mañana de las microinyecciones.
3. Para crear una placa de inyección, vierta 20 ml de agarosa al 1,5%_{/ H 2}O estéril para llenar la mitad de una placa de Petri de 100 mm X 15 mm y espere a que se solidifique. Una vez que la solución de agarosa esté establecida, agregue 20 ml de agarosa al 1,5%_{/ H 2}O estéril a la placa de Petri y coloque el molde de plástico (consulte la Tabla de materiales) en la agarosa líquida y deje que se endurezca.
4. Después de que la agarosa se haya endurecido, retire el molde de plástico y guarde la placa de inyección boca abajo en un refrigerador hasta la mañana de las inyecciones. Se puede usar una sola placa para múltiples inyecciones, siempre y cuando los pozos mantengan su integridad.

3. Microinyección del cóctel CRISPR-Cas9 en un embrión de pez cebra unicelular para generar crispantes maternos

NOTA: Se pueden encontrar más recursos para la microinyección en embriones de pez cebra en otros lugares^24,26,27. La inyección de la mezcla CRISPR-Cas9 en el blastodisco en desarrollo de embriones unicelulares puede aumentar la probabilidad de crear crispantes maternos. La mezcla también se puede inyectar en el saco vitelino hasta la etapa de 2 células. Sin embargo, las mezclas inyectadas en la yema dependen de la corriente ooplasmática para llegar al blastodisco, por lo que CRISPR-Cas9 inyectado en la yema podría disminuir la eficiencia de corte del CRISPR-Cas9²⁸.

1. La tarde antes de las microinyecciones, coloque cruces de tipo salvaje en cajas de apareamiento de pez cebra. Mantenga tanto el pez macho como el hembra en el mismo tanque, pero sepárelos con un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, saque una alícuota de 2 mg/ml de proteína Cas9 y una alícuota del conjunto de sgRNAs. En el tubo de microcentrífuga de polipropileno libre de RNasa que contiene la proteína Cas9, ensamble una mezcla de inyección de 5 μL que incluya el conjunto de sgRNAs, 1 μL de solución de rojo de fenol al 0,5% y agua libre de nucleasa. Apunte a una concentración final de 400 ng/μL de proteína Cas9 y 200 ng/μL de los sgRNAs agrupados en agua libre de RNasa o una proporción de 2:1 de proteína Cas9 a sgRNAs en el embrión inyectado. Esta mezcla de inyección se puede almacenar en hielo durante la mañana de la inyección.
3. Retire una placa de inyección del refrigerador y deje que se caliente a temperatura ambiente (RT) durante al menos 20 minutos.
4. Después de armar el cóctel de inyección, permita que el macho y la hembra se apareen, por ejemplo, quitando el divisor de la caja de apareamiento o colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra, según corresponda.
5. Después de que los peces hayan puesto, pero antes de que se hayan recolectado los embriones, corte la punta de una aguja intacta con una nueva cuchilla de afeitar o pinzas finas para crear una aguja que tenga un orificio lo suficientemente pequeño como para evitar daños en el embrión, pero que sea lo suficientemente ancho como para que no se obstruya con la mezcla de inyección. Después de cortar la aguja, cargue la aguja con la mezcla inyectable utilizando una punta de pipeta del microcargador insertada en el extremo posterior del capilar (consulte Tablas de materiales).
6. Después de llenar la aguja, incubar la aguja durante 5 minutos en RT para ensamblar complejos Cas9-sgRNA.
7. Encienda el microinyector e inserte la aguja en el micromanipulador. Coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de micrómetro y calibre la aguja ajustando la presión de inyección hasta que la aguja expulse un bolo de 1 nL en el aceite mineral.
   NOTA: Al inyectar en el aceite mineral, un bolo de 1 nL tendrá un diámetro de aproximadamente 0,125 mm (o radio de 0,062 mm) medido con el portaobjetos micrométrico.
8. Para sincronizar los embriones, recójalos después de 10 min usando un colador de plástico y enjuáguelos en una placa de Petri usando 1x medio E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄, y agregue 20 μL de 0.03 M Azul de metileno por 1 L de 1x E3). Retire 10-15 embriones y colóquelos en una placa de Petri separada para mantenerlos como controles no inyectados.
9. Transfiera el resto de los embriones en desarrollo a los pocillos de la placa de inyección.
10. Inyecte 1 nL de solución (un total de 400 pg de proteína Cas9 y 200 pg de sgRNAs) en el blastodisco en desarrollo de un embrión de una célula. Si la punta de la aguja se obstruye, use fórceps para romper la punta hacia atrás y recalibre la aguja para expulsar un bolo de 1 nL. Asegúrese de inyectar todos los embriones durante los primeros 40 minutos de desarrollo después de la fertilización.
11. Después de completar la inyección, devuelva los embriones inyectados a una placa de Petri etiquetada que contenga 1x medio E3 y permita que se desarrollen durante todo el día. Retire cualquier embrión que no esté fertilizado o que no se esté desarrollando normalmente de acuerdo con la serie²⁹ de estadificación del pez cebra.

4. Cribado de INDELs somáticos en embriones inyectados F0

NOTA: Se pueden utilizar otros métodos para identificar INDELs, como el ensayo de endonucleasa I T7 o el análisis de fusión de alta resolución, para determinar si los embriones contienen INDELs somáticos ³⁰.

1. Al día siguiente después de las inyecciones, retire los embriones defectuosos y lisados de la placa de Petri y reemplace el medio 1x E3 para mantener la salud del embrión.
2. Después de limpiar el plato, recoja seis embriones sanos inyectados y dos embriones de control del plato no inyectado. Coloque cada embrión individualmente en un solo pocillo de un tubo de tira de PCR y etiquete la parte superior de los tubos.
3. Para extraer el ADN genómico de embriones individuales, retire el exceso de medios E3 de los pocillos del tubo de tira y agregue 100 μL de NaOH de 50 mM por pocillo.
4. Incubar los embriones a 95 °C durante 20 min. A continuación, enfriar las muestras a 4 °C, añadir 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) y vorácelas durante 5 a 10 s. Este ADN extraído puede almacenarse a -20 °C durante al menos 6 meses sin degradación significativa del ADN.
5. Diseñe cebadores de detección únicos para cada sitio guía para amplificar un fragmento de ADN de 100-110 pb que incluya el sitio objetivo de CRISPR-Cas9. Si es posible, coloque el sitio de destino en el centro del fragmento amplificado, lo que permite la identificación de eliminaciones más grandes.
6. Para cada uno de los cuatro sitios objetivo guía, configure ocho reacciones de PCR de 25 μL utilizando 5 μL del ADN genómico de un solo embrión preparado, la mezcla de PCR y los cebadores de detección específicos de la guía para identificar mutaciones somáticas en el sitio objetivo (Tabla 1).
7. Lanzar un gel de bromuro de etidio / TBE al 2,5% de agarosa/0,5 μg/ml de bélido/EBT utilizando peines que creen pocillos de aproximadamente 0,625 cm de ancho. Este peine ancho permite una mejor resolución al detectar cambios de tamaño en la secuencia genómica. Después de que el gel se haya solidificado, colóquelo en una cámara de electroforesis que contenga tampón de ejecución TBE.
8. Agregue 5 μL de tinte de carga 6x al producto de PCR y cargue 25 μL de esta mezcla en el gel. Asegúrese de que las muestras inyectadas y de control se ejecuten en la misma fila del gel. Después de cargar todas las muestras, agregue 5 μL de bromuro de etidio por 1 L de tampón de ejecución de TBE al extremo positivo de la caja de gel.
9. Pase el gel a 120 V hasta que las bandas de ADN se resuelvan o el ADN se haya acercado al final del carril. Si el Cas9 creó INDELs en el sitio objetivo, normalmente se observa un frotis en las muestras inyectadas, pero no en los controles.
10. Si se observan frotis en un mínimo de tres de los cuatro sitios guía en embriones inyectados con cuatro ARN guía, crezcan los embriones inyectados por hermanos.
11. Siempre que las muestras inyectadas no contengan frotis en el número requerido de sitios guía, diseñe nuevos ARN guía para reemplazar los que no funcionaron y cree un nuevo grupo de ARN guía que incluya los que funcionaron y los recién diseñados. Inyecte y pruebe el nuevo grupo para detectar INDEL somáticos como se describió anteriormente.

5. Identificación de fenotipos de efecto materno en embriones maternos crispant

NOTA: Una vez que las hembras F0 inyectadas han alcanzado la madurez sexual, sus células germinales tienen el potencial de generar una mezcla de embriones maternos crujientes y de tipo salvaje. A pesar de que esta mezcla permite controles internos para la fertilización y el momento del desarrollo, sigue siendo beneficioso establecer un incross de tipo salvaje como control externo en caso de que un embrague de F0 hembra contenga solo embriones maternos crispantes.

1. La tarde antes del experimento, configure las hembras inyectadas F0 contra machos de tipo salvaje y controle cruces de tipo salvaje en cajas de apareamiento estándar de pez cebra. Coloque tanto el pez macho como la hembra en el mismo tanque, pero sepárelos con un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra dentro de un inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, permita que el macho y la hembra comiencen a aparearse, por ejemplo, quitando el divisor de la caja de apareamiento o colocando al macho en el mismo inserto de puesta de huevos que la hembra.
3. Recoja los embriones cada 10 minutos moviendo el inserto de puesta de huevos a un nuevo fondo del tanque de apareamiento que contenga agua fresca del sistema y etiquete el tanque con una etiqueta que identifique a la hembra F0 individual. Tome el tanque de apareamiento viejo y vierta el agua a través de un colador de té para recolectar los embriones de un embrague individual de 10 minutos.
4. Una vez que los embriones de un solo embrague de 10 minutos se hayan recogido en el colador, transfiéralos a una placa de Petri que contenga 1x medio E3. Etiquete la placa de Petri con la hora de recolección y la información del pescado.
5. Bajo un microscopio de disección con una fuente de luz transmitida, observe los embriones en desarrollo cada hora durante las primeras 6-8 h y diariamente durante los próximos 5 días.
6. Identificar posibles embriones maternos crispantes por cambios morfológicos macroscópicos en su desarrollo en comparación con controles de tipo salvaje emparejados en el tiempo²⁹.
7. Mover los embriones crujientes maternos potenciales a una placa de Petri que contenga 1x medio E3 y ensayo para fenotipo morfológico a 24 hpf y viabilidad (por ejemplo, inflado de la vejiga natatoria) a los 5 días después de la fertilización.

6. Secuenciación de alelos en haploides crujientes maternos

NOTA: Los haploides crujientes maternos contienen un solo alelo en el locus objetivo, lo que permite la identificación de INDEL en el gen objetivo a través de la secuenciación de Sanger. Los embriones haploides maternos crujientes también se pueden analizar utilizando ensayos de secuenciación de próxima generación. Se espera que los embriones que muestran un fenotipo materno crispante porten una lesión en al menos uno de los cuatro sitios objetivo (Ver Discusión).

1. La tarde antes del experimento, se establecieron parejas de apareamiento de hembras F0 conocidas por producir embriones maternos crujientes cruzados a machos de tipo salvaje. Mantenga a los machos de tipo salvaje físicamente separados de las hembras usando un divisor de caja de apareamiento o coloque a la hembra en el inserto de puesta de huevos.
2. En la mañana del experimento, retire la partición física o coloque tanto los machos como las hembras dentro del inserto de puesta de huevos para iniciar el apareamiento. A la primera señal de puesta de huevos, interrumpa la reproducción separando al macho y a las hembras F0. Mantenga cada hembra F0 separada en cajas de apareamiento individuales.
3. Preparar una solución de esperma tratada con UV utilizando testículos de un macho de tipo salvaje por cada 100 μL de solución de Hank (Tabla 2), suficiente para fertilizar óvulos extruidos de una hembra, como se describió anteriormente³¹.
4. Extruir manualmente óvulos maduros de las hembras F0 preseleccionadas y realizar fertilización in vitro (FIV) utilizando el esperma tratado con UV³¹.
5. Después de la fertilización in vitro , permita que los embriones haploides se desarrollen hasta que se observe el fenotipo crujiente materno y coloque esos embriones en una placa de Petri diferente.
6. Una vez que se hayan identificado los embriones haploides maternos crispantes, permítales desarrollarse durante al menos 6 h después de la fertilización.
7. Para extraer el ADN genómico de al menos diez embriones haploides maternos crispantes, coloque un solo embrión haploide en un pocillo individual de un tubo de tira de PCR, elimine el exceso de medios E3 del pocillo y agregue 50 μL de NaOH a 50 mM.
8. Incubar los embriones a 95 °C durante 20 min. A continuación, enfriar las muestras hasta 4 °C, añadir 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) y vórtice durante 5-10 s. El ADN extraído puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 6 meses.
9. Para identificar qué sitios guía contienen INDEL, diseñe cebadores de secuenciación para amplificar un fragmento de ADN que incluya los cuatro sitios objetivo de CRISPR-Cas9. Estos cebadores de secuenciación permiten la identificación de INDEL que abarcan múltiples sitios de guía.
10. Configure dos reacciones de PCR de 25 μL por embrión utilizando 5 μL del ADN genómico preparado y los cebadores de secuenciación.
11. Una vez finalizada la PCR, purifique y concentre las dos muestras utilizando un kit concentrador y de limpieza de ADN (consulte la Tabla de materiales). Luego envíe el fragmento de ADN a la secuenciación de Sanger utilizando los cebadores de secuenciación directa e inversa.
12. Después de secuenciar el fragmento de crispante materno haploide, alinéelo a la secuencia de tipo salvaje e identifique los INDEL en los sitios objetivo utilizando un programa de alineación de secuencias.

Resultados

El enfoque experimental descrito en este protocolo permite la identificación de fenotipos de efecto materno de una manera rápida y eficiente en el uso de los recursos (Figura 1).

Generación de crispantes maternos:
Al diseñar los cuatro ARN guía para dirigirse a un solo gen candidato de efecto materno, se debe prestar especial atención a dónde se unirán los ARN guía al ADN. En general, todos deben agruparse con regiones mínimas o nulas...

Discusión

El protocolo presentado en este manuscrito permite la identificación y caracterización molecular primaria de un fenotipo de efecto materno en una sola generación en lugar de las múltiples generaciones requeridas para las técnicas genéticas directas e inversas. Actualmente, se desconoce el papel de muchos genes expresados por la madre. Esta falta de conocimiento se debe en parte a la generación adicional requerida para visualizar un fenotipo al identificar genes de efecto materno. En el pasado, la rápida identific...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes