Определение роли матерински-экспрессированных генов в раннем развитии с материнскими криспантами

Резюме

Раннее развитие зависит от продуктов, унаследованных матерью, и роль многих из этих продуктов в настоящее время неизвестна. Здесь мы описали протокол, который использует CRISPR-Cas9 для идентификации фенотипов материнского эффекта в одном поколении.

Аннотация

Раннее развитие зависит от пула материнских факторов, включенных в зрелую яйцеклетку во время оогенеза, которые выполняют все клеточные функции, необходимые для развития, до активации зиготического генома. Как правило, генетическое нацеливание на эти материнские факторы требует дополнительного поколения для выявления фенотипов материнского эффекта, препятствуя способности определять роль матерински-экспрессированных генов во время развития. Открытие возможностей биаллельного редактирования CRISPR-Cas9 позволило провести скрининг эмбриональных фенотипов в соматических тканях введенных эмбрионов или «хрустящих веществ», усилив понимание роли зиготически экспрессированных генов в программах развития. В этой статье описывается протокол, который является расширением метода crispant. В этом методе биаллельное редактирование половых клеток позволяет выделить фенотип материнского эффекта в одном поколении, или «материнские хрустящие вещества». Мультиплексирование направляющих РНК к одной мишени способствует эффективному производству материнских хрустящих веществ, в то время как анализ последовательности материнских хрустящих гаплоидов обеспечивает простой метод подтверждения генетических поражений, которые производят фенотип материнского эффекта. Использование материнских криспантов способствует быстрой идентификации основных генов, экспрессируемых матерью, тем самым облегчая понимание раннего развития.

Введение

Пул материнских продуктов (например, РНК, белков и других биомолекул) необходим для всех ранних клеточных процессов до тех пор, пока не будет активирован зиготный геном эмбриона¹. Преждевременное истощение этих продуктов из ооцита, как правило, является эмбриональным летальным. Несмотря на важность этих генов в развитии, роль многих материнских экспрессированных генов в настоящее время неизвестна. Прогресс в технологии редактирования генов у рыбок данио, такой как CRISPR-Cas9, позволяет нацеливаться на гены, экспрессируемые матерью ^2,3,4. Однако идентификация фенотипа материнского эффекта требует дополнительного поколения по сравнению с зиготным фенотипом, что требует больше ресурсов. В последнее время возможность биаллельного редактирования CRISPR-Cas9 была использована для скрининга эмбриональных фенотипов в соматических тканях инъекционных (F0) эмбрионов, известных как «хрустящие ^{вещества}» 5,6,7,8,9,10. Метод crispant позволяет проводить ресурсосберегающий скрининг генов-кандидатов в соматических клетках, облегчая понимание конкретных аспектов развития. Протокол, описанный в этой статье, позволяет идентифицировать фенотипы материнского эффекта, или «материнские хрустящие жидкости», в одном поколении¹¹. Эта схема достижима путем мультиплексирования направляющих РНК к одному гену и стимулирования событий биаллельного редактирования в зародышевой линии. Эти материнские хрустящие эмбрионы могут быть идентифицированы по грубым морфологическим фенотипам и подвергнуться первичной характеристике, такой как маркировка границ клеток и паттерн ДНК¹¹. Комбинированный анализ наблюдаемого фенотипа и базовой молекулярной характеристики индуцированных INDL позволяет прогнозировать роль целевого гена в раннем развитии.

У рыбок данио в течение первых 24 ч после оплодотворения (HPF) небольшая группа клеток развивается в первичные половые клетки, предшественник зародышевой линии 12,13,14,15. В кладках, заложенных самками F0, доля восстановленных материнских хрустящих эмбрионов зависит от того, сколько половых клеток содержат биаллелевое событие редактирования в целевом гене. В целом, чем раньше происходит событие редактирования у эмбриона, тем выше вероятность мутаций CRISPR-Cas9, наблюдаемых в зародышевой линии. В большинстве случаев фенотипы материнских хрустящих эмбрионов происходят из-за потери функции в двух материнских аллелях, присутствующих в развивающейся яйцеклетке. Когда яйцеклетка завершает мейоз, один из материнских аллелей выдавливается из эмбриона через полярное тело, в то время как другой аллель включается в материнский пронуклеус. Секвенирование нескольких материнских хрустящих гаплоидов будет представлять собой смесь мутаций (вставок и/или делеций (INDL)), присутствующих в зародышевой линии, которые способствуют фенотипу¹¹.

Следующий протокол описывает необходимые шаги для создания мутаций CRISPR-Cas9 в генах материнского эффекта и идентификации соответствующего фенотипа с использованием материнского криспантного подхода (рисунок 1). В первом разделе будет объяснено, как эффективно проектировать и создавать направляющие РНК, в то время как во втором и третьем разделах содержатся критические шаги по созданию материнских хрустящих кислот путем микроинъекции. После инъекции смеси CRISPR-Cas9 введенные эмбрионы проверяются на соматические правки с помощью ПЦР (раздел четвертый). Как только введенные эмбрионы F0 развиваются и достигают половой зрелости, самки F0 скрещиваются с самцами дикого типа, а их потомство проверяется на фенотипы материнского эффекта (раздел пятый). Шестой раздел включает инструкции по созданию материнских хрустящих гаплоидов, которые могут быть объединены с секвенированием Сэнгера для идентификации CRISPR-Cas9-индуцированных INDEL. Кроме того, Обсуждение содержит изменения, которые могут быть внесены в протокол для повышения чувствительности и мощности этого метода.

протокол

В исследованиях, приведших к разработке этого протокола, все жилища и эксперименты рыбок данио были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Висконсина-Мэдисона (IACUC-M005268-R2).

1. Синтез направляющих РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Зиготные хрустящие вещества были созданы с использованием одной направляющей РНК или мультиплексирования нескольких направляющих РНК в одну мишень 5,6,7,8,9,10. Мультиплексирование направляющих РНК увеличивает процент эмбрионов, демонстрирующих зиготный хрустящий фенотип¹⁰. Из-за этой повышенной частоты эмбрионов, демонстрирующих фенотип, материнские хрустящие вещества создаются путем мультиплексирования четырех направляющих РНК в один ген. Более подробный протокол по использованию CHOPCHOP для разработки направляющих РНК и метод отжига для синтеза направляющих РНК для рыбок данио можно найти в другом месте 16,17,18,19,20.

1. Чтобы идентифицировать материнско-экспрессированный ген для мишени, определите уровни транскрипта мРНК во время развития с помощью базы данных последовательностей РНК, которая предоставляет информацию о транскриптоме от зиготы до 5 дней²¹. В целом, материнские специфические гены высоко экспрессируются в раннем эмбрионе и деградируют после активации зиготического генома²².
2. После того, как ген-мишень с материнской экспрессией был идентифицирован, определите первый прогнозируемый белковый домен, используя раздел «домены и особенности», доступный в браузере генома Ensembl²³. Используйте этот домен в качестве целевого региона для четырех направляющих РНК.
3. Используйте программу выбора направляющей РНК CHOPCHOP для идентификации четырех целевых сайтов направляющей РНК в первом активном домене. Разработка ген-специфических олигонуклеотидов, как показано ниже для каждого целевого участка. В геноспецифическом олигонуклеотиде секция^N20 соответствует целевой последовательности за вычетом сайта PAM (NGG) из CHOPCHOP. Упорядочивайте эти геноспецифические олигонуклеотиды и постоянный олигонуклеотид с помощью стандартной опреснительной очистки (см. Таблицу материалов).
   Геноспецифический олигонуклеотид:
   5' ТААТАКГАКТКАКТАТА- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Чтобы создать шаблон направляющей РНК для каждого геноспецифического олигонуклеотида, отожгите его до постоянного олигонуклеотида и заполните выступы Т4-ДНК-полимеразой, как описано ранее¹⁶. После того, как четыре шаблона направляющей РНК собраны, очистите и сконцентрируйте их вместе с помощью комплекта для очистки ДНК и концентратора в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
5. Синтезируйте смесь sgRNA из объединенного шаблона направляющей РНК с помощью набора транскрипции in vitro T7 (см. Таблицу материалов). Выполните транскрипцию in vitro в соответствии с инструкциями производителя. Использование полуреакций набора транскрипции T7 может снизить стоимость одной реакции.
6. После синтеза РНК очищают полученный пул sgRNAs с использованием протокола этанола/ацетата аммония, как описано ранее 16,20,24. После того, как РНК была выделена, повторно суспендируйте ее в 20 мкл воды без нуклеазы. Если для транскрибирования пула sgRNAs использовались полуреакции набора транскрипции T7, повторно суспендировали очищенную РНК в 10-15 мкл воды без нуклеазы.
7. Количественно оцените количество объединенных sgRNAs, которые были созданы с помощью спектрофотометра. Разбавляют пул sgRNAs в безнуклеазной воде до разбавления 1500 нг/мкл ± 500 нг/мкл. Как правило, конечный объем рабочего разбавления колеблется в пределах 30-50 мкл.
8. После определения концентрации пула sgRNAs, проверьте целостность sgRNAs на 1% агарозном геле.
   1. Отлить 1% агарозы/0,5 мкг/мл бромида этидия/Геля TBE. Как только гель затвердеет, поместите его в буфер работы TBE.
   2. Смешайте 1 мкл смеси сгРНК и 1 мкл нагрузочного буфера РНК-геля (см. Таблицу материалов). Загрузите этот образец в гель и запустите гель при 100 В в течение 5 минут.
9. Визуализируйте полосы с помощью ультрафиолетового (УФ) света. Пул sgRNAs должен отображаться как единая полоса. Если наблюдается мазок, вероятно, произошла деградация РНК.
10. Храните пул sgRNAs в одноразовых аликвотах объемом 1 мкл в безнуклеазных ленточных трубках ПЦР в морозильной камере -80 °C. Для больших объемов смеси sgRNAs (30 мкл или более) аликвотирует половину объема в безнуклеазные трубки ПЦР-полоски, а другую половину хранит в виде большего объема в микроцентрифужной трубке без нуклеазы. Оттаивайте и аликвотируйте, когда это необходимо.
11. Чтобы предотвратить деградацию РНК, убедитесь, что образцы в трубке микроцентрифуги проходят не более двух циклов замораживания-оттаивания.

2. Подготовка реагентов и материалов для микроинъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: У рыбок данио инъекция мРНК Cas9 может создать зиготные хрустящие тона. Однако исследования показали, что белок Cas9 более эффективен в создании INDEL у введенных эмбрионов ^16,25. Этот протокол использует белок Cas9 для генерации материнских криспантов, потому что этот белок не испытывает такого же отставания в активности, как инъекционная мРНК Cas9. Теоретически, это должно увеличить вероятность биаллельной мутации на ранней стадии развития, что приведет к увеличению вероятности поражения более обширного участка зародышевой линии. Другие протоколы и ресурсы, подробно описывающие, как подготовиться к микроинъекциям, можно найти в другом месте^24,26.

1. Покупка или генерация белка Cas9 (см. Таблицу материалов). Повторно суспендировать белок Cas9 в воде без нуклеазы, чтобы получить раствор 2 мг/мл и аликвотировать 1 мкл в полипропиленовые микроцентрифужные трубки без РНКазы. Храните их в виде одноразовых трубок при -80 °C.
2. Во второй половине дня перед инъекцией используйте съемник микропипетки, чтобы вытянуть стеклянный капилляр и создать инъекционную иглу. Храните неповрежденную иглу в закрытом держателе иглы до утра микроинъекций.
3. Чтобы создать инъекционную пластину, залейте 20 мл 1,5% агарозы/стерильной_H2O, чтобы заполнить половину чашки Петри размером 100 мм X 15 мм и подождите, пока она затвердеет. После того, как раствор агарозы установлен, добавьте 20 мл 1,5% агарозы/стерильной_H2Oв чашку Петри и поместите пластиковую форму (см. Таблицу материалов) в жидкую агарозу и дайте ей затвердеть.
4. После того, как агароза затвердеет, снимите пластиковую форму и храните инжекторную пластину вверх ногами в холодильнике до утра инъекций. Одна пластина может быть использована для нескольких закачек, если скважины сохраняют свою целостность.

3. Микроинъекция коктейля CRISPR-Cas9 в одноклеточный эмбрион рыбки данио для получения материнских хрустящих веществ

ПРИМЕЧАНИЕ: Больше ресурсов для микроинъекции эмбрионов рыбок данио можно найти в других местах 24,26,27. Введение смеси CRISPR-Cas9 в развивающийся бластодиск одноклеточных эмбрионов может увеличить вероятность создания материнских хрустящих хлопьев. Смесь также может быть введена в желточный мешок до 2-клеточной стадии. Однако смеси, вводимые в желток, зависят от ооплазматического потока, чтобы достичь бластодиска, поэтому CRISPR-Cas9, введенный в желток, может снизить эффективность резки CRISPR-Cas9²⁸.

1. Во второй половине дня перед микроинъекциями установите дикие скрещивания в брачных ящиках рыбок данио. Держите самцов и самок рыб в одном аквариуме, но разделяйте их разделителем брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
2. Утром в день эксперимента вынимают одну аликвоту 2 мг/мл белка Cas9 и одну аликвоту пула sgRNAs. В трубке полипропиленовой микроцентрифуги без РНКазы, содержащей белок Cas9, соберите инъекционную смесь объемом 5 мкл, которая включает пул sgRNAs, 1 мкл 0,5% фенольного красного раствора и воду без нуклеазы. Стремитесь к конечной концентрации 400 нг/мкл белка Cas9 и 200 нг/мкл объединенных sgRNAs в воде без РНКазы или соотношения белка Cas9 к sgRNAs в введенном эмбрионе 2:1. Эту инъекционную смесь можно хранить на льду в течение утра инъекции.
3. Извлеките инъекционную пластину из холодильника и дайте ей нагреться до комнатной температуры (RT) не менее 20 минут.
4. После того, как коктейль для инъекций собран, позвольте самцу и самке спариваться, например, удалив разделитель брачного ящика или поместив самца в ту же яйцекладущую вставку, что и самка, в зависимости от обстоятельств.
5. После того, как рыба уложится, но до того, как эмбрионы будут собраны, отрежьте кончик неповрежденной иглы, используя новое лезвие бритвы или тонкие щипцы, чтобы создать иглу, которая имеет отверстие, достаточно маленькое, чтобы избежать повреждения эмбриона, но достаточно широкое, чтобы оно не засорилось инъекционной смесью. После того, как игла была разрезана, загрузите иглу инъекционной смесью, используя наконечник пипетки микрозагрузчика, вставленный в задний конец капилляра (см. Таблицы материалов).
6. После того, как игла заполнена, инкубируйте иглу в течение 5 минут на RT для сборки комплексов Cas9-sgRNA.
7. Включите микроинжектор и вставьте иглу в микроманипулятор. Поместите каплю минерального масла на микрометровый слайд и откалибруйте иглу, регулируя давление впрыска, пока игла не выдаст болюс 1 нЛ в минеральное масло.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При впрыскивании в минеральное масло болюс 1 нЛ будет иметь диаметр приблизительно 0,125 мм (или радиус 0,062 мм), измеренный с помощью микрометрового слайда.
8. Чтобы синхронизировать эмбрионы, соберите их через 10 мин с помощью пластикового ситечка и промойте их в чашку Петри, используя 1 среду E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl₂, 0,33 мМ MgSO₄, и добавьте 20 мкл 0,03 М метиленового синего на 1 л 1x E3). Удалите 10-15 эмбрионов и поместите их в отдельную чашку Петри, которая будет храниться в качестве неинъективного контроля.
9. Перенесите остальные развивающиеся эмбрионы в лунки инъекционной пластины.
10. Вводят 1 нл раствора (в общей сложности 400 пг белка Cas9 и 200 пг sgRNAs) в развивающийся бластодиск одноклеточного эмбриона. Если кончик иглы забивается, используйте щипцы, чтобы сломать наконечник назад и повторно откалибровать иглу, чтобы извлечь болюс 1 нЛ. Убедитесь, что введены все эмбрионы в течение первых 40 минут развития после оплодотворения.
11. После того, как инъекция будет завершена, верните введенные эмбрионы в меченую чашку Петри, которая содержит 1 среду E3 и позвольте им развиваться в течение дня. Удалите все эмбрионы, которые не оплодотворены или не развиваются нормально в соответствии с серией²⁹ стадий рыбок данио.

4. Скрининг на соматические INPEL у эмбрионов, введенных f0

ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы идентификации INPEL, такие как анализ эндонуклеазы T7 I или анализ плавления с высоким разрешением, могут быть использованы при определении того, содержат ли эмбрионы соматические INDELs ³⁰.

1. На следующий день после инъекций удалите дефектные и лизированные эмбрионы из чашки Петри и замените 1 среду E3 для поддержания здоровья эмбрионов.
2. После очистки посуды соберите шесть здоровых введенных эмбрионов и два контрольных эмбриона из неинъецированной пластины. Поместите каждый эмбрион по отдельности в одну лунку трубки для полоски ПЦР и пометьте верхнюю часть трубок.
3. Чтобы извлечь геномную ДНК отдельных эмбрионов, удалите излишки среды E3 из лунок ленточной трубки и добавьте 100 мкл 50 мМ NaOH на лунку.
4. Инкубируют эмбрионы при 95 °C в течение 20 мин. Затем охладите образцы до 4 °C, добавьте 10 мкл 1 M Tris HCL (рН 7,5) и вращайте их в течение 5-10 с. Эта извлеченная ДНК может храниться при -20 °C в течение не менее 6 месяцев без значительной деградации ДНК.
5. Разработайте уникальные экранирующие праймеры для каждого направляющего участка, чтобы усилить фрагмент ДНК 100-110 bp, который включает в себя целевой сайт CRISPR-Cas9. Если возможно, поместите целевой сайт в середину усиленного фрагмента, что позволит идентифицировать более крупные удаления.
6. Для каждого из четырех направляющих целевых участков настройте восемь 25 мкл ПЦР-реакций с использованием 5 мкл подготовленной геномной ДНК одного эмбриона, смеси ПЦР и направляющих скрининговых праймеров для выявления соматических мутаций в целевом участке (таблица 1).
7. Отлите 2,5% агарозы/0,5 мкг/мл этидия бромида/Геля TBE с использованием гребней, которые создают скважины шириной около 0,625 см. Эта широкая гребень обеспечивает лучшее разрешение при обнаружении изменений размера геномной последовательности. После того, как гель затвердеет, поместите его в камеру электрофореза, которая содержит работающий буфер TBE.
8. Добавьте 5 мкл 6-кратного нагрузочного красителя в продукт ПЦР и загрузите 25 мкл этой смеси в гель. Убедитесь, что введенные и контрольные образцы выполняются на одном ряду геля. После того, как все образцы загружены, добавьте 5 мкл бромида этидия на 1 л работающего буфера TBE к положительному концу гелевой коробки.
9. Запускайте гель при 120 В до тех пор, пока полосы ДНК не разрешатся или ДНК не приблизится к концу полосы. Если Cas9 создал INDL в целевом участке, мазок обычно наблюдается в введенных образцах, но не в контрольных элементах.
10. Если мазки наблюдаются как минимум в трех из четырех направляющих участков у эмбрионов, вводимых четырьмя направляющими РНК, растут эмбрионы, которым вводят эмбрионы.
11. Всякий раз, когда введенные образцы не содержат мазков в необходимом количестве направляющих участков, разрабатывайте новые направляющие РНК для замены тех, которые не работали, и создавайте новый пул направляющих РНК, который включает те, которые работали, и вновь разработанные. Введите и протестируйте новый пул на наличие соматических INDL, как описано выше.

5. Идентификация фенотипов материнского эффекта у материнских хрустящих эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Как только введенные самки F0 достигают половой зрелости, их клетки зародышевой линии могут генерировать смесь материнских хрустящих и диких эмбрионов. Несмотря на то, что эта смесь позволяет осуществлять внутренний контроль за оплодотворением и сроками развития, все же полезно установить скрещивание дикого типа в качестве внешнего контроля в случае, если сцепление от самки F0 содержит только материнские хрустящие эмбрионы.

1. Во второй половине дня перед экспериментом настройте самок F0 против самцов дикого типа и контролируйте скрещивания дикого типа в стандартных брачных ящиках для рыбок данио. Поместите самца и самку рыб в один аквариум, но разделите их разделителем брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
2. Утром в день эксперимента позвольте самцу и самке начать спаривание, например, удалив разделитель брачного ящика или поместив самца в ту же яйцекладущую вставку, что и самка.
3. Собирайте эмбрионы каждые 10 минут, перемещая яйцекладущую вставку в новое дно брачного резервуара, которое содержит пресную системную воду, и маркируйте резервуар меткой, идентифицирующей особую самку F0. Возьмите старый брачный бак и налейте воду через чайное ситечко, чтобы собрать эмбрионы из одной индивидуальной 10-минутной кладки.
4. После того, как эмбрионы из одной 10-минутной муфты будут собраны в ситечке, перенесите их в чашку Петри, содержащую 1 среду E3. Пометьте чашку Петри временем сбора и информацией о рыбе.
5. Под рассекающим микроскопом с прошедшим источником света наблюдайте за эмбрионами, подвергающимися развитию, каждый час в течение первых 6-8 ч и ежедневно в течение следующих 5 дней.
6. Идентифицировать потенциальные материнские хрустящие эмбрионы по грубым морфологическим изменениям в их развитии по сравнению с контрольными группами дикого типа²⁹.
7. Переместите потенциальные материнские хрустящие эмбрионы в чашку Петри, которая содержит 1 среду E3 и анализ на морфологический фенотип при 24 л.с.ф. и жизнеспособность (например, инфляция плавательного пузыря) через 5 дней после оплодотворения.

6. Секвенирование аллелей в материнских хрустящих гаплоидах

ПРИМЕЧАНИЕ: Материнские хрустящие гаплоиды содержат один аллель в целевом локусе, что позволяет идентифицировать INDELs в гене-мишени с помощью секвенирования Сэнгера. Эмбрионы материнских хрустящих гаплоидов также могут быть проанализированы с использованием анализов секвенирования следующего поколения. Ожидается, что эмбрионы, которые показывают фенотип материнского хрустящего вещества, будут нести поражение по крайней мере в одном из четырех целевых участков (см. Обсуждение).

1. Во второй половине дня перед экспериментом установили спаривание пар самок F0, которые, как известно, производят материнские хрустящие эмбрионы, скрещенные с самцами дикого типа. Держите самцов дикого типа физически отделенными от самок с помощью разделителя брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
2. Утром в день эксперимента удалите физическую перегородку или поместите самцов и самок в яйцекладущую вставку, чтобы начать спаривание. При первых признаках яйцекладки прерывают размножение, разделяя самца и самок F0. Держите каждую отдельную самку F0 в отдельных брачных коробках.
3. Готовят обработанный УФ-излучением раствор спермы с использованием яичек одного самца дикого типа на каждые 100 мкл раствора Хэнка (таблица 2), достаточные для оплодотворения экструдированных яйцеклеток одной самки, как описано ранее³¹.
4. Вручную экструдируйте зрелые яйцеклетки из предварительно отобранных самок F0 и выполняйте экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) с использованием очищенных УФ-излучением сперматозоидов³¹.
5. После экстракорпорального оплодотворения позвольте гаплоидным эмбрионам развиваться до тех пор, пока не будет наблюдаться фенотип материнского хрустящего вещества, и поместите эти эмбрионы в другую чашку Петри.
6. После того, как материнские гаплоидные эмбрионы были идентифицированы, позвольте им развиваться в течение не менее 6 часов после оплодотворения.
7. Чтобы извлечь геномную ДНК по меньшей мере из десяти материнских гаплоидных эмбрионов, поместите один гаплоидный эмбрион в отдельный колодец трубки для полосы ПЦР, удалите излишки среды E3 из скважины и добавьте 50 мкл 50 мМ NaOH.
8. Инкубируют эмбрионы при 95 °C в течение 20 мин. Затем охладите образцы до 4 °C, добавьте 5 мкл 1 M Tris HCL (рН 7,5) и вихрь в течение 5-10 с. Извлеченная ДНК может храниться при -20 °C до 6 месяцев.
9. Чтобы определить, какие направляющие сайты содержат INDL, разработайте праймеры секвенирования для амплификации фрагмента ДНК, который включает в себя все четыре целевых сайта CRISPR-Cas9. Эти буквари по виртуализации позволяют идентифицировать INDL, которые охватывают несколько направляющих сайтов.
10. Настройте две реакции ПЦР по 25 мкл на эмбрион, используя 5 мкл подготовленной геномной ДНК и праймеры для секвенирования.
11. После завершения ПЦР очистите и сконцентрируйте два образца с помощью комплекта для очистки ДНК и концентратора (см. Таблицу материалов). Затем отправьте фрагмент ДНК на секвенирование Сэнгера, используя как прямые, так и обратные праймеры секвенирования.
12. После того, как гаплоидный фрагмент материнского хрустящего вещества был секвенирован, выровняйте его по последовательности дикого типа и идентифицируйте INDL в целевых участках с помощью программы выравнивания последовательностей.

Результаты

Экспериментальный подход, описанный в этом протоколе, позволяет быстро и эффективно идентифицировать фенотипы материнского эффекта (рисунок 1).

Производство материнских хрустящих кислот:
При разработке четырех направляющих РНК для нацеливан?...

Обсуждение

Протокол, представленный в этой рукописи, позволяет идентифицировать и первично-молекулярную характеристику фенотипа материнского эффекта в одном поколении вместо нескольких поколений, необходимых как для прямых, так и для обратных генетических методов. В настоящее время роль многи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes