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  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

早期发育依赖于母系遗传产品，其中许多产品的作用目前尚不清楚。在本文中，我们描述了一种使用CRISPR-Cas9鉴定单代母系效应表型的方案。

摘要

早期发育取决于卵子发生过程中纳入成熟卵母细胞的母体因子库，这些因子执行发育所需的所有细胞功能，直到合子基因组激活。通常，这些母体因子的遗传靶向需要额外的一代来识别母系效应表型，从而阻碍了确定母系表达基因在发育过程中的作用的能力。CRISPR-Cas9的双等位基因编辑能力的发现允许筛选注射胚胎或"脆皮"体细胞组织中的胚胎表型，从而增强了对合子表达基因在发育程序中起作用的理解。本文介绍了一种协议，该协议是脆皮方法的扩展。在这种方法中，生殖细胞的双等位基因编辑允许在一代中分离母系效应表型，或"母体脆皮"。将RNA多路复用引导到单个靶标可促进母体脆皮的有效生产，而母体脆皮单倍体的序列分析提供了一种简单的方法来证实产生母系效应表型的遗传病变。母体清爽剂的使用支持快速鉴定必需的母系表达基因，从而促进对早期发育的理解。

引言

在胚胎的合子基因组被激活之前，所有早期细胞过程都需要一组母系沉积产物（例如RNA，蛋白质和其他生物分子）1。这些产品从卵母细胞中过早消耗通常是胚胎致命的。尽管这些基因在发育中很重要，但许多母系表达基因的作用目前尚不清楚。斑马鱼基因编辑技术的进步，如CRISPR-Cas9，能够靶向母系表达的基因2，3，4。然而，与合子表型相比，母系效应表型的鉴定需要额外的一代，因此需要更多的资源。最近，CRISPR-Cas9的双等位基因编辑能力已被用于筛选注射（F0）胚胎体组织中的胚胎表型，称为"脆皮剂"5，6，7，8，9，10。脆皮技术允许对体细胞中的候选基因进行资源高效筛选，促进对发育中特定方面的理解。本文中描述的方案允许在单代中鉴定母系效应表型或"母体脆皮"11。该方案可以通过将引导RNA多路复用到单个基因并促进种系中的双等位基因编辑事件来实现。这些母体脆胚可以通过大体形态表型进行鉴定，并进行初步表征，例如标记细胞边界和DNA模式11。对诱导的INDELs的可观察表型和基本分子特征的结合分析可以预测靶基因在早期发育中的作用。

在斑马鱼中，在受精后的前24小时（hpf），一小群细胞发育成原始生殖细胞，这是种系12，13，14，15的前体。在F0雌性埋下的离合器中，恢复的母体脆胚的比例取决于有多少个生殖细胞在靶基因中含有双等位基因编辑事件。一般来说，编辑事件发生在胚胎中越早，在种系中观察到CRISPR-Cas9突变的可能性就越高。在大多数情况下，母体脆皮胚胎的表型来自发育中的卵母细胞中存在的两个母体等位基因的功能丧失。当卵母细胞完成减数分裂时，其中一个母体等位基因通过极体从胚胎中挤出，而另一个等位基因则被掺入母体原核中。多个母体脆皮单倍体的测序将代表种系中存在的有助于表型11 的突变（插入和/或缺失 （INDEL））的混合物。

以下协议描述了在母系效应基因中创建CRISPR-Cas9突变并使用母体清脆剂方法鉴定相应表型的必要步骤（图1）。第一部分将解释如何有效地设计和创建引导RNA，而第二和第三部分包含通过显微注射创建母体脆片的关键步骤。注射CRISPR-Cas9混合物后，通过PCR筛选注射的胚胎以进行体细胞编辑（第四部分）。一旦注射的F0胚胎发育并达到性成熟，F0雌性就被杂交为野生型雄性，并对其后代进行母系效应表型筛查（第五节）。第六部分包括制作母体脆皮单倍体的说明，这些单倍体可以与Sanger测序相结合以鉴定CRISPR-Cas9诱导的INDEL。此外，讨论还包含可以对协议进行的修改，以提高此方法的灵敏度和功能。

研究方案

在导致制定该协议的研究中，所有斑马鱼的住房和实验都得到了威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会（IACUC-M005268-R2）的批准。

1. 向导RNA的合成

注意:合子脆皮浓缩剂是使用单个向导RNA或将多个向导RNA多重到单个靶标5，6，7，8，9，10创建的。向导RNA的多重化增加了显示合子脆皮表型10的胚胎的百分比。由于表现出表型的胚胎的频率增加，通过将四个引导RNA多路复用到单个基因来创建母体脆皮。关于使用CHOPCHOP设计向导RNA和退火方法合成斑马鱼向导RNA的更详细的协议可以在其他地方找到16，17，18，19，20。

  1. 为了鉴定要靶向的母系表达基因，通过RNA序列数据库确定发育过程中的mRNA转录物水平，该数据库提供从受精卵到5天21的转录组信息。一般来说，母系特异性基因在早期胚胎中高度表达，并在合子基因组被激活后降解22。
  2. 一旦鉴定出母系表达的靶基因，使用Ensembl基因组浏览器23上提供的"结构域和特征"部分确定第一个预测的蛋白质结构域。使用此结构域作为四个向导RNA的靶区域。
  3. 使用向导RNA选择程序CHOPCHOP鉴定第一个活性结构域中的四个向导RNA靶位点。设计基因特异性寡核苷酸，如下所示。在基因特异性寡核苷酸中，N20 部分对应于靶序列减去来自 CHOPCHOP 的 PAM 位点 （NGG）。使用标准脱盐纯化订购这些基因特异性寡核苷酸和恒定寡核苷酸（参见 材料表）。
    基因特异性寡核苷酸:
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
  4. 要为每个基因特异性寡核苷酸创建引导RNA模板，请将其退火至恒定寡核苷酸，并用T4-DNA聚合酶填充突出部分，如前所述16。组装四个引导RNA模板后，根据制造商的说明，使用DNA净化和浓缩试剂盒将它们纯化并浓缩在一起（参见 材料表）。
  5. 使用 体外 T7转录试剂盒从混合的引导RNA模板合成sgRNA混合物（参见 材料表）。根据制造商的说明进行 体外 转录。使用 T7 转录试剂盒的半反应可以降低每次反应的成本。
  6. RNA合成后，如前所述，使用乙醇/乙酸铵方案纯化所得的sgRNA池16，20，24。分离 RNA 后，将其重悬于 20 μL 无核酸酶水中。如果使用 T7 转录试剂盒的半反应转录 sgRNA 池，则将纯化的 RNA 重悬到 10-15 μL 无核酸酶水中。
  7. 量化使用分光光度计创建的混合 sgRNA 的数量。将无核酸酶水中的 sgRNA 池稀释至 1500 ng/μL ± 500 ng/μL 的稀释度。 通常，工作稀释度的最终体积范围为 30-50 μL。
  8. 确定 sgRNA 池的浓度后，在 1% 琼脂糖凝胶上验证 sgRNA 的完整性。
    1. 灌制 1% 琼脂糖/0.5 μg/mL 溴化乙锭/TBE 凝胶。凝胶固化后，将其置于TBE电泳缓冲液中。
    2. 混合 1 μL sgRNA 混合物和 1 μL RNA 凝胶上样缓冲液（参见 材料表）。将此样品加载到凝胶中，并在100 V下运行凝胶5分钟。
  9. 使用紫外线 （UV） 可视化条带。sgRNA池应显示为单个条带。如果观察到涂片，则可能发生RNA降解。
  10. 将sgRNA池以一次性1μL等分试样储存在-80°C冰箱的无核酸酶PCR试管中。对于大量 sgRNA 混合物（30 μL 或更多），将体积的一半等分到无核酸酶的 PCR 试管中，并将另一半作为较大体积储存在无核酸酶的微量离心管中。解冻并在需要时等分。
  11. 为防止RNA降解，请确保微量离心管中的样品经历不超过两个冻融循环。

2.制备显微注射试剂和材料

注意:在斑马鱼中，注射Cas9 mRNA可以产生合子脆剂。然而，研究表明，Cas9蛋白在注射胚胎中产生INDELs更有效16，25。该协议使用Cas9蛋白来产生母体脆剂，因为该蛋白不会经历与注射的Cas9 mRNA相同的活性滞后。从理论上讲，这应该会增加发育早期双等位基因突变的可能性，从而增加种系更广泛部分受到影响的机会。详细说明如何准备显微注射的其他协议和资源可以在其他地方找到24，26。

  1. 购买或生成Cas9蛋白（见 材料表）。将 Cas9 蛋白重悬于无核酸酶的水中，制成 2 mg/mL 溶液，并将 1 μL 等分到不含 RNase 的聚丙烯微量离心管中。将它们作为一次性管储存在-80°C。
  2. 注射前的下午，使用微量移液器拉动玻璃毛细管并制作注射针。将未折断的针头存放在封闭的针架中，直到显微注射的早晨。
  3. 要创建注射板，倒入 20 mL 1.5% 琼脂糖/无菌 H2O 以填充 100 mm X 15 mm 培养皿的一半并等待其凝固。琼脂糖溶液凝固后，向培养皿中加入 20 mL 1.5% 琼脂糖/无菌 H2O，并将塑料模具（参见 材料表）放入液体琼脂糖中并使其变硬。
  4. 琼脂糖硬化后，取出塑料模具并将注射板倒置存放在冰箱中，直到注射的早晨。只要孔保持其完整性，单个板可用于多次进样。

3. 将CRISPR-Cas9鸡尾酒显微注射到单细胞斑马鱼胚胎中，生成母体脆皮

注意:更多用于显微注射到斑马鱼胚胎的资源可以在其他地方找到24，26，27。将CRISPR-Cas9混合物注射到单细胞胚胎的发育胚盘中可能会增加产生母体脆饼的可能性。混合物也可以注入卵黄囊直至2细胞阶段。然而，注入蛋黄的混合物依赖于卵质流到达胚盘，因此注入蛋黄的CRISPR-Cas9会降低CRISPR-Cas928的切割效率。

  1. 在显微注射前的下午，在斑马鱼交配箱中设置野生型杂交。将雄鱼和雌鱼放在同一个水箱中，但用交配箱分隔器将它们分开，或者将雌鱼放在产卵插件中。
  2. 在实验的早晨，取出一个2mg / mL等分试样的Cas9蛋白和一个等分试样的sgRNA池。在含有 Cas9 蛋白的无 RNase 聚丙烯微量离心管中，组装 5 μL 进样混合物，其中包括 sgRNA 池、1 μL 0.5% 酚红溶液和无核酸酶水。目标是在无RNase的水中实现400 ng/μL Cas9蛋白和200 ng/μL混合的sgRNA的最终浓度，或在注射的胚胎中使Cas9蛋白与sgRNA的比例达到2:1。这种注射混合物可以在注射的早晨储存在冰上。
  3. 从冰箱中取出注射板，使其升温至室温（RT）至少20分钟。
  4. 注射混合物组装完成后，允许雄性和雌配，例如，通过移除交配箱分隔器或酌情将雄性放入与雌性相同的产卵插入物中。
  5. 在鱼产下后但在收集胚胎之前，使用新的剃须刀片或细镊子切割未折断的针尖，以创建一个针头，该针的孔足够小以避免胚胎损伤，但又足够宽，这样它就不会被注射混合物堵塞。切断针头后，使用插入毛细管后端的微量加载器移液器尖端将注射混合物装入针头（参见 材料表）。
  6. 填充针头后，将针头在室温下孵育5分钟以组装Cas9-sgRNA复合物。
  7. 打开显微注射器并将针头插入显微操纵器。将一滴矿物油滴在千分尺载玻片上，并通过调节注射压力来校准针头，直到针头将 1 nL 推注物喷射到矿物油中。
    注意:当注入矿物油时，用千分尺载玻片测量的 1 nL 推注的直径约为 0.125 毫米（或半径为 0.062 毫米）。
  8. 为了同步胚胎，在10分钟后使用塑料过滤器收集它们，并使用1x E3培养基（5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4）将它们冲洗到培养皿中，并每1l 1x E3添加20μL0.03M亚甲蓝）。取出10-15个胚胎并将它们放入单独的培养皿中以作为未注射的对照保存。
  9. 将其余发育中的胚胎转移到注射板的孔中。
  10. 将 1 nL 溶液（总共 400 pg Cas9 蛋白和 200 pg sgRNA）注入单细胞胚胎的发育胚盘中。如果针尖堵塞，请使用镊子将针尖折断并重新校准针头以弹出 1 nL 推注。确保在受精后发育的前40分钟内注射所有胚胎。
  11. 注射完成后，将注射的胚胎放回含有1x E3培养基的标记培养皿中，并让它们全天发育。根据斑马鱼分期系列29去除任何未受精或发育不正常的胚胎。

4. F0注射胚胎体细胞INDELs的筛选

注意:鉴定INDELs的其他方法，例如T7核酸内切酶I测定或高分辨率熔解分析，可用于确定胚胎是否含有体细胞INDELs 30。

  1. 注射后的第二天，从培养皿中取出有缺陷和裂解的胚胎，并更换1x E3培养基以维持胚胎健康。
  2. 清理培养皿后，从未注射的平板中收集六个健康的注射胚胎和两个对照胚胎。将每个胚胎单独放入PCR试管的单个孔中，并标记试管的顶部。
  3. 要提取单个胚胎的基因组DNA，请从试管的孔中去除多余的E3培养基，并在每孔中加入100μL的50mM NaOH。
  4. 将胚胎在95°C孵育20分钟。然后将样品冷却至 4 °C，加入 10 μL 1 M Tris HCL （pH 7.5），并涡旋 5 至 10 秒。这种提取的DNA可以在-20°C下储存至少6个月，而不会显着的DNA降解。
  5. 为每个引导位点设计独特的筛选引物，以扩增包含CRISPR-Cas9靶位点的100-110 bp DNA片段。如果可能，将靶位点放在扩增片段的中间，以便识别较大的缺失。
  6. 对于四个引导靶位点中的每一个，使用5 μL制备的单胚胎基因组DNA、PCR混合物和指南特异性筛选引物设置8个25 μL PCR反应，以鉴定靶位点中的体细胞突变（表1）。
  7. 使用梳子灌制 2.5% 琼脂糖/0.5 μg/mL 溴化乙锭/TBE 凝胶，形成约 0.625 cm 宽的孔。这种宽梳在检测基因组序列的大小变化时可以提供更好的分辨率。凝胶固化后，将其放入含有TBE电泳缓冲液的电泳室中。
  8. 向PCR产物中加入5 μL 6x上样染料，并将25 μL该混合物上样到凝胶中。确保进样样品和对照样品在同一行凝胶上运行。加载所有样品后，每 1 L TBE 电泳缓冲液向凝胶盒的正端加入 5 μL 溴化乙锭。
  9. 在120 V下运行凝胶，直到DNA条带消退或DNA接近泳道末端。如果Cas9在靶位点产生INDEL，则通常在注射样品中观察到涂片，但对照中不会观察到涂片。
  10. 如果在注射了四个引导RNA的胚胎的四个引导位点中的至少三个观察到涂片，则兄弟姐妹注射的胚胎长大。
  11. 当注射的样品在所需数量的引导位点中不包含涂片时，设计新的引导RNA以替换那些不起作用的引导RNA，并创建一个新的引导RNA池，其中包括有效的引导RNA和新设计的引导RNA。如上所述，注入并测试体细胞 INDEL 的新池。

5. 母体脆皮胚胎母系效应表型的鉴定

注意:一旦注射的F0雌性达到性成熟，它们的种系细胞就有可能产生母体脆剂和野生型胚胎的混合物。尽管这种混合物允许对受精和发育时间进行内部控制，但如果F0雌性的离合器仅包含母体脆皮胚胎，设置野生型杂交作为外部对照仍然是有益的。

  1. 在实验前的下午，设置F0注射雌性对抗野生型雄性，并在标准斑马鱼交配箱中控制野生型杂交。将雄鱼和雌鱼放在同一个水箱中，但用交配箱分隔器将它们分开，或者将雌鱼放在产卵插入物中。
  2. 在实验的早晨，让雄性和雌性开始交配，例如，通过移除交配箱分隔器或将雄性放在与雌性相同的产卵插入物中。
  3. 通过将产卵插入物移动到包含新鲜系统水的新交配罐底部，并用标识单个 F0 雌性的标签标记水箱，每 10 分钟收集一次胚胎。取旧的交配罐，将水倒入滤茶器中，从一个单独的10分钟离合器中收集胚胎。
  4. 一旦来自单个10分钟离合器的胚胎被收集到过滤器中，将它们转移到含有1x E3培养基的培养皿中。在培养皿上标记收集时间和鱼类信息。
  5. 在带有透射光源的解剖显微镜下，在前6-8小时内每小时观察一次发育的胚胎，在接下来的5天内每天观察一次。
  6. 通过与时间匹配的野生型对照相比，发育过程中的粗大形态变化来识别潜在的母体脆皮胚胎29。
  7. 将潜在的母体脆胚移至含有 1x E3 培养基的培养皿中，并在受精后 5 天测定 24 hpf 时的形态表型和活力（例如，鱼鳔充气）。

6. 母体脆皮单倍体等位基因测序

注意:母体脆皮单倍体在目标位点中包含一个等位基因，允许通过 Sanger 测序鉴定靶基因中的 INDEL。母体脆皮单倍体胚胎也可以使用下一代测序测定进行分析。显示母体脆皮表型的胚胎预计将在四个靶位点中的至少一个携带病变（见讨论）。

  1. 在实验前的下午，建立已知产生母体脆性胚胎的F0雌配对，杂交到野生型雄性。使用交配箱隔板将野生型雄性与雌性物理分开，或将雌性放在产卵插入物中。
  2. 在实验的早晨，移除物理隔板或将雄性和雌性都放在产卵插入物中以开始交配。在产卵的第一个迹象时，通过将雄性和F0雌性分开来中断繁殖。将每个分离的 F0 母头放在单独的交配盒中。
  3. 使用来自一个野生型男性的睾丸制备紫外线处理的精子溶液，每 100 μL Hank 溶液（表 2），足以使来自一个女性的挤出卵子受精，如前所述31。
  4. 从预先选择的F0雌性中手动挤出成熟卵子，并使用紫外线处理的精子进行 体外 受精（IVF）31。
  5. 体 外 受精后，让单倍体胚胎发育，直到观察到母体脆皮表型，并将这些胚胎放入不同的培养皿中。
  6. 一旦鉴定出母体脆皮单倍体胚胎，让它们在受精后发育至少6小时。
  7. 为了从至少十个母体脆单倍体胚胎中提取基因组DNA，将单个单倍体胚胎放入PCR试管的单个孔中，从孔中去除多余的E3培养基并加入50μL的50mM NaOH。
  8. 将胚胎在95°C孵育20分钟。然后将样品冷却至 4 °C，加入 5 μL 1 M Tris HCL （pH 7.5），涡旋 5-10 秒。提取的DNA可以在-20°C下储存长达6个月。
  9. 为了确定哪些指导位点含有INDEL，请设计测序引物来扩增包含所有四个CRISPR-Cas9靶位点的DNA片段。这些测序引物允许鉴定跨越多个指导位点的INDEL。
  10. 使用 5 μL 制备的基因组 DNA 和测序引物为每个胚胎设置两个 25 μL PCR 反应。
  11. PCR完成后，使用DNA净化和浓缩试剂盒纯化和浓缩两个样品（见 材料表）。然后使用正向和反向测序引物将DNA片段提交Sanger测序。
  12. 对单倍体母脆剂片段进行测序后，将其与野生型序列比对，并使用序列比对程序鉴定靶位点中的 INDEL。

结果

该协议中描述的实验方法允许以快速，资源高效的方式鉴定母体效应表型（图1）。

生成母体清脆:
当设计四个引导RNA以靶向单个候选母体效应基因时，应特别考虑引导RNA与DNA结合的位置。一般来说，它们都应该聚集在一起，在第一个预测的蛋白质结构域开始时，引导RNA之间几乎没有重叠区域（图2A）。将引导RNA靶向?...

讨论

本手稿中提出的协议允许在单代中鉴定和初级分子表征母体效应表型，而不是正向和反向遗传技术所需的多代。目前，许多母系表达基因的作用尚不清楚。这种知识的缺乏部分是由于在识别母系效应基因时需要额外的一代来可视化表型。过去，斑马鱼母系效应基因的快速鉴定可以通过将翻译阻断吗啉寡核苷酸注射到培养的卵母细胞中来实现32。这种方法通过表型复制多个已知的?...

披露声明

作者声明没有相互竞争的经济利益。

致谢

我们感谢过去和现在的Pelegri实验室畜牧工作人员对水上设施的照顾。我们也感谢Ryan Trevena和Diane Hanson对手稿的评论和见解。资金由NIH拨款提供给F.P.（GM065303）

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)Invirogen15568025For PCR mix
1.5 mL Eppendorf TubesAny Maker
10 mM dNTPsThermo Fischer Scientific18427013Synthesis of gRNA
100 BP ladderAny MakerFor gel electrophoresis
100% RNAse free ethanolAny Maker
100% RNAse free ethanolAny Maker
100ml BeakerAny MakerFor IVF
5 M Ammonium AccetateThermo Fischer ScientificFound in the MEGAshortscript T7 Transcription KitSynthesis of gRNA
70% EthanolSynthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm IDFHC INC27-30-1for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 poundsBulk Reef Supply255Fish supplies
CaCl2MiliporeSigmaC7902
Cas9 Protein with NLSPNABioCP01
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotideIntegrated DNA Technologies (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass PlateThermo Fischer Scientific13-748BFor IVF
Dissecting ForcepsDumontSSFor IVF
Dissecting ScissorsFine Science Tools14091-09For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)Any MakerFor IVF
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4014Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)Any MakerFor gel electrophoresis
EconoTaq DNA PolymeraseLucigen30032-1For PCR mix
Electropheresis Power SupplyAny MakerFor gel electrophoresis
Ensemblehttps://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorThermo Fischer ScientificE5242956003for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)Any Maker
FemtoJet 4iEppendorf5252000021for Microinjection
Fish NetAny MakerFish supplies
Frozen Brine ShrimpBrine Shrimp DirectFish supplies
General All Purpose AgaroseAny MakerFor gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotideIntegrated DNA Technologies (IDT)TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
GlovesAny Maker
Ice BucketAny Maker
Instant Ocean saltAny MakerFish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mLThermo Fischer Scientific15-585-011
KClMiliporeSigmaP5405
KH2PO4MiliporeSigma7778-77-0
KimwipesThermo Fischer Scientific06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription KitThermo Fischer ScientificAM1354Synthesis of gRNA
Methylene BlueThermo Fischer ScientificAC414240250For E3
MgCl2MiliporeSigma7791-18-6For PCR mix
MgSO2·7H2OMiliporeSigmaM2773
Microinjection plastic moldWorld Precision InstrumentsZ-Moldsfor Microinjection
MicromanipulatorAny Makerfor Microinjection
MicropipetersAny Maker
Micropipette PullerSutterP-87for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)Any Maker
MicrowaveAny Maker
Mineral OilMiliporeSigmam5904-5mlfor Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)Any MakerFDA approved
Na2HPO4MiliporeSigmaS3264
NaClMiliporeSigmaS5886
NaHC03MiliporeSigmaS5761
NanodropAny Maker
NaOHMiliporeSigma567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450Synthesis of gRNA
nuclease-free waterAny Maker
Paper TowelAny Maker
Pastro PipettesAny Maker
PCR Strip TubesAny Maker
Petri Plates 100 mm diameterAny Maker
Phenol Red solutionMiliporeSigmaP0290for Microinjection
Plastic PestalsVWR47747-358For IVF
Plastic SpoonAny MakerFor IVF
Premium Grade Brine Shrimp EggsBrine Shrimp DirectFine Mesh
RNA Gel Loading Dyefound in MEGAshortscript T7 Transcription KitFor gel electrophoresis
RNAse AWAYThermo Fischer Scientific21-402-178
ScaleAny Maker
SharpieAny Maker
 SpatulaAny Maker
Sterile H2OAny MakerFor PCR mix
T4 DNA PolymeraseNEBM0203Synthesis of gRNA
TapeAny Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10xAny MakerFor gel electrophoresis
Tea StainerAmazonIMU-71133WFish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2Thermo Fischer ScientificB2-12For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis SystemsThermo Fischer Scientific09-528-110BFor gel electrophoresis
ThermocyclerAny Maker
ThermocyclerAny Maker
TransilluminatorAny Maker
UV lampUVPModel XX-15 (Cat NO. UVP18006201)For IVF
UV safety glassesAny MakerFor IVF
Wash BottleThermo Fischer ScientificS39015Fish supplies
Zebrafish mating boxesAqua SchwarzSpawningBox1Fish supplies
1.5ml Eppendorf TubesFisher Scientific05-402-11
10 Molar dNTPsThermo Fischer Scientific18427013
100 BP ladderThermo Fischer Scientific15628019
100% RNAse free ethanolany maker
5m Ammonium AccetateThermo Fischer Scientific
70% Ethanol70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel BoxFisher Scientific0.625 mm
Agaroseany maker
CaCl2Sigma10043-52-4
CaCl2, dihydrateSigma10035-04-8E3 Medium
Capillary TubingCole-ParmerUX-03010-68for injection needles
Cas9 ProteinThermo Fischer ScientificA36496
ChopChophttps://chopchop.cbu.uib.no/
Computerany maker
Dissecting Forceptsany maker
Dissecting Microscopeany maker
Dissecting Scissorsany maker
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4014
DNA Gel Loading Dye (6X)Thermo Fischer ScientificR0611
EconoTaq DNA PolymeraseLucigen30032-1
Ensemblehttps://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTipsFischer Scientific1028965120 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)any maker
Ethidium BromideThermo Fischer Scientific15585011
Fish Netany makerfine mesh
Frozen Brine ShrimpLiveAquariaCD-12018fish food
Gel Comb (0.625mm)any maker
Gel Electropheresis Systemany maker
Gene-Specific oligonucleotideIntegrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary NeedleGrainger21TZ99https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishesany maker
Glovesany maker
Hank's Final Working SolutionCombine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premixcombine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solutionhttps://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #18.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #20.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #40.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #51.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #60.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HClSigma7647-01-0
Ice Bucketany maker
Instant Ocean saltany makerfor fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short ScriptThermo Fischer ScientificAM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled WaterFisher Scientific10-977-023
KClSigma7447-40-7E3 Medium
KH2PO4Sigma7778-77-0
KimwipesFisher Scientific06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption KitThermo Fischer ScientificAM1354
methylene blueFisher ScientificAC414240250E3 Medium
MgSO2-7H2OSigmaM2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic moldWorld Precision InstrumentsZ-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tipsany makerneed filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tipsany maker
Micropippetter (100-1000) with tipsany maker
Microplastic slide
Microwaveany maker
MiliQ Waterany maker
mineral oilsigma-aldrichm5904-5ml
Na2HPO4Sigma
NaClSigmaS9888
NaHC02Sigma223441
Nanodrop
NaOHSigma567530
Narrow Spatulaany maker
Needle PullerSutterP-97
Paper Towelany maker
Pastro PipettesFisher Scientific13-678-20A
PCR primer flanking guide siteIntegrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut siteIntegrated DNA Technologies (IDT)Standard desalted
PCR Strip TubesThermo Fischer ScientificAB0771W
Petri DishesFisher ScientificFB087571410 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol RedFisher ScienceS25464https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tipsany maker10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic PestalsFisher Scientific12-141-364
Plastic Spoonany maker
Primer Guide SiteIntegrated DNA Technologies (IDT)
Razor BladeUlineH-595B
RNA gel Loading Dyein megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse awayFisher21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubesThermo Fischer ScientificAM12400https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free waterFisher Scientific10-977-023
Scaleany maker
Sharpieany maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)SigmaS5761fish water
Sodium Bromide SolotionSigmaE1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2Oany brand
T4 DNA PolymeraseNEBM0203Shttps://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tapeany brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10XThermo Fischer ScientificB52https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea StaineramazonIMU-71133Wavaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer PipetteUlineS-24320
Transilluminator
Tricainefisher scientificNC0872873
Tris HCl 7.5Thermo Fischer Scientific15567027
Universal PrimerIntegrated DNA Technologies (IDT)AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lampUVP
UV safety glassesany maker
Wash Bottlefisher scientificS39015
Zebrafish mating boxesany maker
PCR Buffer RecipeAdd 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

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