Maternal Crispantlarla Erken Gelişimde Annelik İfade Edilen Genlerin Rolünün Belirlenmesi

Özet

Erken gelişim, maternal kalıtsal ürünlere bağlıdır ve bu ürünlerin çoğunun rolü şu anda bilinmemektedir. Burada, tek bir nesilde anne-etki fenotiplerini tanımlamak için CRISPR-Cas9 kullanan bir protokol tanımladık.

Özet

Erken gelişim, zigotik genom aktivasyonuna kadar gelişim için gerekli tüm hücresel fonksiyonları yerine getiren oogenez sırasında matür oosite dahil edilen maternal faktörlerin bir havuzuna bağlıdır. Tipik olarak, bu maternal faktörlerin genetik olarak hedeflenmesi, annelik etkisi fenotiplerini tanımlamak için ek bir nesil gerektirir ve bu da gelişim sırasında maternal olarak eksprese edilen genlerin rolünü belirleme yeteneğini engeller. CRISPR-Cas9'un bialelik düzenleme yeteneklerinin keşfi, enjekte edilen embriyoların veya "gevreklerin" somatik dokularındaki embriyonik fenotiplerin taranmasına izin vererek, zigotik olarak eksprese edilen genlerin gelişim programlarında oynadığı rolün anlaşılmasını arttırmıştır. Bu makalede, crispant yönteminin bir uzantısı olan bir protokol açıklanır. Bu yöntemde, germ hücrelerinin bialelik düzenlenmesi, tek bir nesilde veya "maternal gevrekler" de maternal etkili bir fenotipin izolasyonuna izin verir. RNA'ları tek bir hedefe multipleks etmek, maternal gevreklerin verimli üretimini teşvik ederken, maternal gevrek haploidlerin sekans analizi, maternal etkili bir fenotip üreten genetik lezyonları doğrulamak için basit bir yöntem sağlar. Maternal gevreklerin kullanımı, annelik tarafından ifade edilen temel genlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını destekler, böylece erken gelişimin anlaşılmasını kolaylaştırır.

Giriş

Maternal olarak biriken ürünlerden oluşan bir havuz (örneğin, RNA'lar, proteinler ve diğer biyomoleküller), embriyonun zigotik genomu aktive edilene kadar tüm erken hücresel süreçler için gereklidir¹. Bu ürünlerin oositten erken tükenmesi tipik olarak embriyonik öldürücüdür. Bu genlerin gelişimdeki önemine rağmen, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü şu anda bilinmemektedir. Zebra balıklarında CRISPR-Cas9 gibi gen düzenleme teknolojisindeki ilerleme, anne tarafından eksprese edilen genlerin^{hedeflenmesini} sağlar ^2,3,4. Bununla birlikte, bir anne-etki fenotipinin tanımlanması, zigotik bir fenotiple karşılaştırıldığında ekstra bir nesil gerektirir, bu nedenle daha fazla kaynak gerektirir. Son zamanlarda, CRISPR-Cas9'un bialelik düzenleme yeteneği, "gevrekler" olarak bilinen enjekte edilen (F0) embriyoların somatik dokularındaki embriyonik fenotipleri taramak için ^{kullanılmıştır5,6,7,8,9,10}. Crispant tekniği, somatik hücrelerdeki aday genlerin kaynak verimli bir şekilde taranmasına izin verir ve gelişimdeki belirli yönlerin anlaşılmasını kolaylaştırır. Bu yazıda açıklanan protokol, anne-etki fenotiplerinin veya "maternal gevreklerin" tek bir nesil^11'de tanımlanmasına izin vermektedir. Bu şema, kılavuz RNA'ları tek bir gene çoklayarak ve germ hattındaki bialelik düzenleme olaylarını teşvik ederek elde edilebilir. Bu maternal gevrek embriyolar brüt morfolojik fenotiplerle tanımlanabilir ve hücre sınırları için etiketleme ve DNA modellemesi¹¹ gibi birincil karakterizasyona tabi tutulur. Gözlemlenebilir fenotipin ve indüklenen INDELL'lerin temel moleküler karakterizasyonunun kombine analizi, hedeflenen genin erken gelişimdeki rolünün tahmin edilmesini sağlar.

Zebra balığında, döllenme sonrası ilk 24 saat (hpf) sırasında, küçük bir hücre grubu, germ hattı^{12,13,14,15'in} öncüsü olan ilkel germ hücrelerine dönüşür. F0 dişileri tarafından yerleştirilen debriyajlarda, geri kazanılan maternal gevrek embriyoların oranı, hedeflenen gende kaç germ hücresinin bialelik bir düzenleme olayı içerdiğine bağlıdır. Genel olarak, embriyoda düzenleme olayı ne kadar erken gerçekleşirse, germ hattında CRISPR-Cas9 mutasyonlarının gözlenme olasılığı o kadar yüksek olur. Çoğu durumda, maternal gevrek embriyoların fenotipleri, gelişmekte olan oositte bulunan iki maternal aleldeki fonksiyon kaybından kaynaklanır. Oosit mayozu bitirdiğinde, maternal alellerden biri embriyodan polar cisim yoluyla ekstrüde edilirken, diğer alel maternal pronükleusa dahil edilir. Çoklu maternal gevrek haploidlerin dizilimi, fenotip-11'e katkıda bulunan germ hattında bulunan mutasyonların (eklemeler ve / veya delesyonlar (INDEL'ler)) bir karışımını temsil edecektir.

Aşağıdaki protokol, maternal etki genlerinde CRISPR-Cas9 mutasyonları oluşturmak ve maternal crispant yaklaşımı kullanarak karşılık gelen fenotipi tanımlamak için gerekli adımları açıklamaktadır (Şekil 1). Birinci bölüm, kılavuz RNA'ların etkili bir şekilde nasıl tasarlanacağını ve oluşturulacağını açıklarken, ikinci ve üçüncü bölümler mikroenjeksiyonla maternal gevreklikler oluşturmak için kritik adımlar içermektedir. CRISPR-Cas9 karışımı enjekte edildikten sonra, enjekte edilen embriyolar PCR (bölüm dört) aracılığıyla somatik düzenlemeler için taranır. Enjekte edilen F0 embriyoları geliştikten ve cinsel olgunluğa ulaştığında, F0 dişileri vahşi tip erkeklere geçirilir ve yavruları annelik etkisi fenotipleri için taranır (beşinci bölüm). Altıncı bölüm, CRISPR-Cas9 kaynaklı INDEL'leri tanımlamak için Sanger dizilimi ile birleştirilebilen maternal gevrek haploidlerin yapımına ilişkin talimatları içermektedir. Ek olarak, Tartışma, bu yöntemin duyarlılığını ve gücünü artırmak için protokolde yapılabilecek değişiklikler içerir.

Protokol

Bu protokolün geliştirilmesine yol açan çalışmalarda, tüm zebra balığı barınma ve deneyleri Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC-M005268-R2) tarafından onaylanmıştır.

1. Kılavuz RNA'ların Sentezi

NOT: Zigotik gevrekler, tek bir kılavuz RNA kullanılarak veya çoklu kılavuz RNA'ları tek bir hedefe 5,6,7,8,9,10 olarak çoğaltarak oluşturulmuştur. Kılavuz RNA'ların çoklanması, zigotik gevrek fenotip¹⁰ gösteren embriyoların yüzdesini arttırır. Fenotip sergileyen embriyoların bu artan sıklığı nedeniyle, maternal gevrekler, dört kılavuz RNA'nın tek bir gene kopyalanmasıyla oluşturulur. Kılavuz RNA'ları tasarlamak için CHOPCHOP'u kullanma konusunda daha ayrıntılı bir protokol ve zebra balığı için kılavuz RNA'ları sentezlemek için bir tavlama yöntemi^{16,17,18,19,20} başka bir yerde bulunabilir.

1. Hedeflenecek anne tarafından eksprese edilen bir geni tanımlamak için, gelişim sırasında mRNA transkript seviyelerini, zigottan 5 gün^21'e kadar transkriptom bilgisi sağlayan bir RNA dizisi veritabanı aracılığıyla tespit edin. Genel olarak, anneye özgü genler erken embriyoda yüksek oranda eksprese edilir ve zigotik genom aktive edildikten sonra parçalanır²².
2. Anne tarafından ifade edilen bir hedef gen tanımlandıktan sonra, Ensembl genom tarayıcısı^23'te bulunan "etki alanları ve özellikler" bölümünü kullanarak ilk tahmin edilen protein alanını belirleyin. Bu etki alanını dört kılavuz RNA için hedef bölge olarak kullanın.
3. İlk aktif alandaki dört kılavuz RNA hedef bölgesini tanımlamak için kılavuz RNA seçim programı CHOPCHOP'u kullanın. Her hedef bölge için aşağıda gösterildiği gibi gene özgü oligonükleotidler tasarlayın. Gen-spesifik oligonükleotidde, N²⁰ bölümü, CHOPCHOP'dan PAM bölgesi (NGG) eksi hedef diziye karşılık gelir. Bu gen-spesifik oligonükleotidleri ve standart tuzdan arındırma saflaştırmasını kullanarak sabit oligonükleotidi sipariş edin (bakınız Malzeme Tablosu).
   Gen-spesifik oligonükleotid:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Her bir gen-spesifik oligonükleotid için bir kılavuz RNA şablonu oluşturmak için, onu sabit oligonükleotidi tavlayın ve çıkıntıları daha önce tarif edildiği gibi T4-DNA polimeraz ile doldurun¹⁶. Dört kılavuz RNA şablonu bir araya getirildikten sonra, üreticinin talimatlarına göre bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak bunları saflaştırın ve konsantre edin (bkz.
5. Bir in vitro T7 transkripsiyon kiti kullanarak havuzlanmış kılavuz RNA şablonundan sgRNA karışımını sentezleyin (bkz. İn-vitro transkripsiyonu üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin. T7 Transkripsiyon kitinin yarı reaksiyonlarının kullanılması, reaksiyon başına maliyeti azaltabilir.
6. RNA sentezinden sonra, daha önce tarif edildiği gibi bir etanol / amonyum asetat protokolü kullanarak ortaya çıkan sgRNA havuzunu saflaştırın 16,20,24. RNA izole edildikten sonra, 20 μL nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın. T7 Transkripsiyon kitinin yarı reaksiyonları sgRNA havuzunu transkripte etmek için kullanılmışsa, saflaştırılmış RNA'yı 10-15 μL nükleaz içermeyen suya yeniden askıya alın.
7. Bir spektrofotometre kullanılarak oluşturulan havuzlanmış sgRNA'ların miktarını ölçün. Nükleaz içermeyen sudaki sgRNA havuzunu 1500 ng / μL ± 500 ng / μL'lik bir seyreltmeye seyreltin. tipik olarak, çalışma seyreltmesinin son hacmi 30-50 μL arasında değişir.
8. SgRNA havuzunun konsantrasyonunu belirledikten sonra,% 1'lik bir agaroz jeli üzerindeki sgRNA'ların bütünlüğünü doğrulayın.
   1. % 1 agaroz / 0.5 μg / mL ethidyum bromür / TBE jeli dökün. Jel katılaştıktan sonra, TBE çalışma tamponuna yerleştirin.
   2. 1 μL sgRNA karışımı ve 1 μL RNA jel yükleme tamponu karıştırın (bkz. Bu numuneyi jele yükleyin ve jeli 5 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.
9. Ultraviyole (UV) ışık kullanarak bantları görselleştirin. SgRNA havuzu tek bir bant olarak görünmelidir. Bir yayma gözlenirse, RNA bozulması muhtemelen meydana gelmiştir.
10. SgRNA havuzunu -80 °C dondurucudaki nükleaz içermeyen PCR şerit tüplerinde tek kullanımlık 1 μL alikotlarda saklayın. Büyük hacimli sgRNA karışımı (30 μL veya daha fazla) için, hacmin yarısını nükleaz içermeyen PCR şerit tüplerine aliquot edin ve diğer yarısını nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpünde daha büyük bir hacim olarak saklayın. Gerektiğinde çözülün ve aliquot.
11. RNA bozulmasını önlemek için, mikrosantrifüj tüpündeki numunelerin ikiden fazla donma-çözülme döngüsüne maruz kalmadığından emin olun.

2. Mikroenjeksiyon için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

NOT: Zebra balığında, Cas9 mRNA enjeksiyonu zigotik gevrekler oluşturabilir. Bununla birlikte, çalışmalar Cas9 proteininin enjekte edilen embriyolarda INDEL oluşturmada daha etkili olduğunu göstermiştir^16,25. Bu protokol, maternal gevrekler üretmek için Cas9 proteinini kullanır, çünkü bu protein enjekte edilen Cas9 mRNA ile aktivitede aynı gecikmeyi yaşamaz. Teorik olarak, bu, gelişimin erken dönemlerinde bialelik bir mutasyon olasılığını arttırmalı, bu da germline'ın daha geniş bir bölümünün etkilenme şansının artmasına neden olmalıdır. Mikroenjeksiyonlara nasıl hazırlanılacağını detaylandıran diğer protokoller ve kaynaklar başka bir yerde bulunabilir^24,26.

1. Cas9 proteini satın alın veya üretin (bkz. Cas9 proteinini nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alarak 2 mg/mL'lik bir çözelti ve RNaz içermeyen polipropilen mikrosantrifüj tüplerine 1 μL alikot yapın. Bunları -80 °C'de tek kullanımlık tüpler olarak saklayın.
2. Enjeksiyondan önceki öğleden sonra, bir cam kılcal damarı çekmek ve bir enjeksiyon iğnesi oluşturmak için bir mikropipet çektirici kullanın. Kırılmamış iğneyi, mikroenjeksiyon sabahına kadar kapalı bir iğne tutucuda saklayın.
3. Bir enjeksiyon plakası oluşturmak için, 100 mm X 15 mm Petri kabının yarısını doldurmak için₂₀mL% 1,5 agaroz / steril H 2 O dökün ve katılaşmasını bekleyin. Agaroz çözeltisi ayarlandıktan sonra, Petri kabına 20 mL% 1.5 agaroz / steril H₂O ekleyin ve plastik kalıbı ( Malzeme Tablosuna bakınız) sıvı agarozun içine yerleştirin ve sertleşmesine izin verin.
4. Agaroz sertleştikten sonra, plastik kalıbı çıkarın ve enjeksiyon plakasını enjeksiyon sabahına kadar buzdolabında baş aşağı saklayın. Kuyular bütünlüklerini koruduğu sürece çoklu enjeksiyonlar için tek bir plaka kullanılabilir.

3. Maternal gevrekler üretmek için CRISPR-Cas9 kokteylinin tek hücreli zebra balığı embriyosuna mikroenjeksiyonu

NOT: Zebra balığı embriyolarına mikroenjeksiyon için daha fazla kaynak başka bir yerde bulunabilir^24,26,27. CRISPR-Cas9 karışımının tek hücreli embriyoların gelişmekte olan blastodiskine enjekte edilmesi, maternal gevrekler oluşturma olasılığını artırabilir. Karışım ayrıca 2 hücreli aşamaya kadar yumurta sarısı kesesine enjekte edilebilir. Bununla birlikte, yumurta sarısına enjekte edilen karışımlar, blastodiske ulaşmak için ooplazmik akışa bağlıdır, bu nedenle yumurta sarısına enjekte edilen CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas9^28'in kesme verimliliğini azaltabilir.

1. Mikroenjeksiyonlardan önceki öğleden sonra, zebra balığı çiftleşme kutularında vahşi tip haçlar kurun. Hem erkek hem de dişi balıkları aynı tankta tutun, ancak bir çiftleşme kutusu bölücüsü ile ayırın veya dişiyi yumurtlayan bir ekin içine yerleştirin.
2. Deneyin sabahında, Cas9 proteininden bir adet 2 mg/mL aliquot ve sgRNA havuzundan bir aliquot alın. Cas9 proteinini içeren RNaz içermeyen polipropilen mikrosantrifüj tüpünde, sgRNA havuzunu, 1 μL% 0.5 fenol kırmızı çözeltisini ve nükleaz içermeyen suyu içeren 5 μL'lik bir enjeksiyon karışımı oluşturun. RNaz içermeyen suda 400 ng / μL Cas9 proteininin ve 200 ng / μL'lik havuzlanmış sgRNA'ların nihai konsantrasyonunu veya enjekte edilen embriyodaki Cas9 proteininin sgRNA'lara 2: 1 oranını hedefleyin. Bu enjeksiyon karışımı, enjeksiyon sabahı için buz üzerinde saklanabilir.
3. Bir enjeksiyon plakasını buzdolabından çıkarın ve en az 20 dakika boyunca oda sıcaklığına (RT) ısınmasına izin verin.
4. Enjeksiyon kokteyli monte edildikten sonra, erkek ve dişinin çiftleşmesine izin verin, örneğin, çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya erkeği dişiyle aynı yumurtlama ekine yerleştirerek, uygun şekilde.
5. Balıklar serildikten sonra, ancak embriyolar toplanmadan önce, embriyo hasarını önlemek için yeterince küçük bir deliğe sahip ancak enjeksiyon karışımı ile tıkanmayacak kadar geniş bir iğne oluşturmak için yeni bir tıraş bıçağı veya ince forseps kullanarak kırılmamış bir iğnenin ucunu kesin. İğne kesildikten sonra, kılcal damarın arka ucuna yerleştirilmiş bir mikro yükleyici pipet ucu kullanarak iğneyi enjeksiyon karışımıyla yükleyin (bkz.
6. İğne doldurulduktan sonra, Cas9-sgRNA komplekslerini birleştirmek için iğneyi RT'de 5 dakika inkübe edin.
7. Mikroenjektörü açın ve iğneyi mikromanipülatöre yerleştirin. Bir mikrometre sürgüsüne bir damla mineral yağ yerleştirin ve iğne mineral yağa 1 nL'lik bir bolus çıkarana kadar enjeksiyon basıncını ayarlayarak iğneyi kalibre edin.
   NOT: Mineral yağa enjekte edilirken, 1 nL'lik bir bolus, mikrometre kızağı ile ölçüldüğü gibi yaklaşık 0,125 mm (veya 0,062 mm yarıçap) çapa sahip olacaktır.
8. Embriyoları senkronize etmek için, plastik bir süzgeç kullanarak 10 dakika sonra toplayın ve 1x E3 ortamı (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄) kullanarak bir Petri kabında durulayın ve 1 L'lik 1x E3 başına 20 μL 0.03 M Metilen Mavisi ekleyin. 10-15 embriyoyu çıkarın ve enjekte edilmemiş kontroller olarak tutulmak üzere ayrı bir Petri kabına yerleştirin.
9. Gelişmekte olan embriyoların geri kalanını enjeksiyon plakasının kuyucuklarına aktarın.
10. Tek hücreli bir embriyonun gelişmekte olan blastodiskine 1 nL çözelti (toplam 400 pg Cas9 proteini ve 200 pg sgRNA) enjekte edin. İğnenin ucu tıkanırsa, ucu geri kırmak için forseps kullanın ve 1 nL'lik bir bolusu çıkarmak için iğneyi yeniden kalibre edin. Döllenmeden sonraki gelişimin ilk 40 dakikasında tüm embriyoları enjekte ettiğinizden emin olun.
11. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, enjekte edilen embriyoları 1x E3 ortamı içeren etiketli bir Petri kabına geri koyun ve gün boyunca gelişmelerine izin verin. Zebra balığı evreleme serisi^29'a göre döllenmemiş veya normal şekilde gelişmemiş embriyoları çıkarın.

4. F0 enjekte edilen embriyolarda somatik INDEL taraması

NOT: T7 endonükleaz I testi veya yüksek çözünürlüklü erime analizi gibi INDEL'leri tanımlamak için diğer yöntemler, embriyoların somatik INDEL ³⁰ içerip içermediğini belirlerken kullanılabilir.

1. Enjeksiyonlardan sonraki ertesi gün, Petri kabından kusurlu ve lize olmuş embriyoları çıkarın ve embriyo sağlığını korumak için 1x E3 ortamını değiştirin.
2. Çanağı temizledikten sonra, enjekte edilmemiş plakadan altı sağlıklı enjeksiyonlu embriyo ve iki kontrol embriyosu toplayın. Her embriyoyu ayrı ayrı bir PCR şerit tüpünün tek bir kuyucuğuna yerleştirin ve tüplerin üstünü etiketleyin.
3. Tek tek embriyoların genomik DNA'sını çıkarmak için, fazla E3 ortamını şerit tüpünün kuyucuklarından çıkarın ve kuyu başına 100 μL 50 mM NaOH ekleyin.
4. Embriyoları 20 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. Daha sonra numuneleri 4 °C'ye kadar soğutun, 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7.5) ekleyin ve 5 ila 10 sn boyunca vorteks yapın. Bu ekstrakte edilen DNA, önemli DNA bozulması olmadan en az 6 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
5. CRISPR-Cas9 hedef bölgesini içeren 100-110 bp DNA parçasını yükseltmek için her kılavuz site için benzersiz tarama primerleri tasarlayın. Mümkünse, hedef siteyi güçlendirilmiş parçanın ortasına yerleştirin ve daha büyük silmelerin tanımlanmasına izin verin.
6. Dört kılavuz hedef bölgenin her biri için, hazırlanan tek embriyolu genomik DNA'nın 5 μL'sini, PCR karışımını ve hedef bölgedeki somatik mutasyonları tanımlamak için kılavuza özgü tarama primerlerini kullanarak sekiz adet 25 μL PCR reaksiyonu ayarlayın (Tablo 1).
7. Yaklaşık 0,625 cm genişliğinde kuyucuklar oluşturan taraklar kullanarak %2,5 agaroz/0,5 μg/mL ethidyum bromür/TBE jeli dökün. Bu geniş tarak, genomik dizideki boyut değişikliklerini tespit ederken daha iyi çözünürlük sağlar. Jel katılaştıktan sonra, TBE çalışma tamponu içeren bir elektroforez odasına yerleştirin.
8. PCR ürününe 5 μL 6x yükleme boyası ekleyin ve bu karışımın 25 μL'sini jele yükleyin. Enjekte edilen ve kontrol edilen numunelerin jelin aynı sırası üzerinde çalıştırıldığından emin olun. Tüm numuneler yüklendikten sonra, jel kutusunun pozitif ucuna 1 L TBE çalışma tamponu başına 5 μL ethidyum bromür ekleyin.
9. DNA bantları çözülene veya DNA şeridin sonuna yaklaşana kadar jeli 120 V'ta çalıştırın. Cas9 hedef bölgede INDEL oluşturduysa, enjekte edilen numunelerde tipik olarak bir yayma gözlenir, ancak kontrollerde gözlenmez.
10. Dört kılavuz RNA ile enjekte edilen embriyolardaki dört kılavuz bölgeden en az üçünde smear gözlenirse, kardeş enjekte edilen embriyoları büyütün.
11. Enjekte edilen numuneler gerekli sayıda kılavuz bölgesinde yayma içermediğinde, çalışmayanların yerini almak için yeni kılavuz RNA'lar tasarlayın ve işe yarayanları ve yeni tasarlananları içeren yeni bir kılavuz RNA havuzu oluşturun. Yeni havuzu yukarıda açıklandığı gibi somatik INDEL'ler için enjekte edin ve test edin.

5. Maternal gevrek embriyolarda maternal etki fenotiplerinin tanımlanması

NOT: Enjekte edilen F0 dişileri cinsel olgunluğa ulaştıktan sonra, germline hücreleri maternal gevrek ve vahşi tip embriyoların bir karışımını üretme potansiyeline sahiptir. Bu karışım döllenme ve gelişimsel zamanlama için iç kontrollere izin verse de, F0 dişisinden bir debriyajın sadece maternal gevrek embriyolar içermesi durumunda harici bir kontrol olarak vahşi tipte bir çaprazlama kurmak hala faydalıdır.

1. Deneyden önceki öğleden sonra, F0 enjekte edilen dişileri vahşi tip erkeklere karşı ayarlayın ve standart zebra balığı çiftleşme kutularında vahşi tip haçları kontrol edin. Hem erkek hem de dişi balıkları aynı tanka yerleştirin, ancak çiftleşme kutusu bölücüsü ile ayırın veya dişiyi yumurtlayan bir ekin içine yerleştirin.
2. Deneyin sabahında, erkek ve dişinin çiftleşmeye başlamasına izin verin, örneğin çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya erkeği dişi ile aynı yumurtlama ekine yerleştirerek.
3. Yumurtlama ekini taze sistem suyu içeren yeni bir çiftleşme tankı tabanına hareket ettirerek embriyoları her 10 dakikada bir toplayın ve tankı bireysel F0 dişisini tanımlayan bir etiketle etiketleyin. Eski çiftleşme tankını alın ve embriyoları 10 dakikalık bir debriyajdan toplamak için suyu bir çay süzgecinden dökün.
4. Tek bir 10 dakikalık debriyajdan elde edilen embriyolar süzgeçte toplandıktan sonra, bunları 1x E3 ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. Petri kabını toplama zamanı ve balık bilgileriyle etiketleyin.
5. İletilen bir ışık kaynağı ile diseksiyon yapan bir mikroskop altında, ilk 6-8 saat boyunca her saat başı ve sonraki 5 gün boyunca günlük olarak gelişim gösteren embriyoları gözlemleyin.
6. Potansiyel maternal gevrek embriyoları, zaman uyumlu vahşi tip kontrollere kıyasla gelişimlerindeki brüt morfolojik değişikliklerle tanımlayın²⁹.
7. Potansiyel maternal gevrek embriyoları, 1x E3 ortamı ve 24 hpf'de morfolojik fenotip ve döllenmeden sonraki 5 günde canlılık (örneğin, yüzme mesanesi şişirmesi) için tahlil içeren bir Petri kabına taşıyın.

6. Maternal gevrek haploidlerde dizileme alelleri

NOT: Maternal gevrek haploidler, hedeflenen lokusta tek bir alel içerir ve Sanger dizilimi yoluyla hedef gendeki INDEL'lerin tanımlanmasına izin verir. Maternal gevrek haploid embriyoları da yeni nesil dizileme testleri kullanılarak analiz edilebilir. Maternal gevrek fenotip gösteren embriyoların dört hedef bölgeden en az birinde lezyon taşıması beklenmektedir (Bkz. Tartışma).

1. Deneyden önceki öğleden sonra, maternal gevrek embriyolar ürettiği bilinen F0 dişi çiftlerinin çiftleşmesi, vahşi tip erkeklere geçti. Vahşi tip erkekleri bir çiftleşme kutusu bölücü kullanarak dişilerden fiziksel olarak ayrı tutun veya dişi yumurtlama ekine yerleştirin.
2. Deneyin sabahında, fiziksel bölümü çıkarın veya çiftleşmeyi başlatmak için hem erkekleri hem de dişileri yumurtlama ekinin içine yerleştirin. Yumurtlamanın ilk belirtisinde, erkek ve F0 dişilerini ayırarak üremeyi kesin. Her ayrılmış F0 dişisini ayrı ayrı çiftleşme kutularında saklayın.
3. Daha^{önce tarif edildiği} gibi bir dişiden ekstrüde yumurtaları döllemek için yeterli olan Hank çözeltisinin her 100 μL'si için bir vahşi tip erkekten testisler kullanarak UV ile muamele edilmiş sperm çözeltisi hazırlayın (Tablo 2).
4. Önceden seçilmiş F0 dişilerinden olgun yumurtaları manuel olarak ekstrüzyon yapın ve UV ile tedavi edilmiş sperm^31'i kullanarak in vitro fertilizasyon (IVF) gerçekleştirin.
5. İn vitro fertilizasyondan sonra, maternal gevrek fenotip gözlenene kadar haploid embriyoların gelişmesine izin verin ve bu embriyoları farklı bir Petri kabına yerleştirin.
6. Maternal gevrek haploid embriyolar tanımlandıktan sonra, döllenme sonrası en az 6 saat boyunca gelişmelerine izin verin.
7. Genomik DNA'yı en az on maternal gevrek haploid embriyodan çıkarmak için, tek bir haploid embriyoyu bir PCR şerit tüpünün bireysel bir kuyucuğuna yerleştirin, fazla E3 ortamını kuyudan çıkarın ve 50 μL 50 mM NaOH ekleyin.
8. Embriyoları 20 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. Daha sonra numuneleri 4 °C'ye kadar soğutun, 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7.5) ekleyin ve 5-10 sn vorteks ekleyin. Ekstrakte edilen DNA, 6 aya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
9. Hangi kılavuz bölgelerinin INDEL içerdiğini belirlemek için, dört CRISPR-Cas9 hedef bölgesinin tümünü içeren bir DNA parçasını yükseltmek için dizileme primerleri tasarlayın. Bu sıralama primerleri, birden fazla kılavuz alanına yayılan INDEL'lerin tanımlanmasına izin verir.
10. Hazırlanan genomik DNA'nın 5 μL'sini ve dizileme primerlerini kullanarak embriyo başına iki adet 25 μL PCR reaksiyonu ayarlayın.
11. PCR bittikten sonra, bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak iki numuneyi saflaştırın ve konsantre edin (bkz. Daha sonra DNA fragmanını hem ileri hem de geri dizileme primerlerini kullanarak Sanger dizilimine gönderin.
12. Haploid maternal gevrek parça sıralandıktan sonra, onu vahşi tip diziye hizalayın ve bir dizi hizalama programı kullanarak hedef bölgelerdeki INDEL'leri tanımlayın.

Sonuçlar

Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşım, maternal etki fenotiplerinin hızlı, kaynak verimli bir şekilde tanımlanmasını sağlar (Şekil 1).

Maternal gevrekliklerin üretilmesi:
Dört kılavuz RNA'yı tek bir aday anne-etki genini hedefleyecek şekilde tasarlarken, kılavuz RNA'ların DNA'ya bağlanacağı yere özel dikkat gösterilmelidir. Genel olarak, hepsi ilk tahmin edilen protein alanının başlangıcında kılavuz RNA'lar ara...

Tartışmalar

Bu makalede sunulan protokol, hem ileri hem de geri genetik teknikler için gerekli olan çoklu nesiller yerine, tek bir nesilde bir anne-etkili fenotipin tanımlanmasına ve birincil moleküler karakterizasyonuna izin vermektedir. Şu anda, annelik tarafından ifade edilen birçok genin rolü bilinmemektedir. Bu bilgi eksikliği kısmen, anne-etki genlerini tanımlarken bir fenotipi görselleştirmek için gereken ekstra üretimden kaynaklanmaktadır. Geçmişte, zebra balığında anne-etkisi genlerinin hızlı bir şe...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes