Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels

Résumé

Le développement précoce dépend des produits hérités de la mère, et le rôle de bon nombre de ces produits est actuellement inconnu. Ici, nous avons décrit un protocole qui utilise CRISPR-Cas9 pour identifier les phénotypes d’effet maternel en une seule génération.

Résumé

Le développement précoce dépend d’un ensemble de facteurs maternels incorporés dans l’ovocyte mature au cours de l’oogenèse qui remplissent toutes les fonctions cellulaires nécessaires au développement jusqu’à l’activation du génome zygotique. En règle générale, le ciblage génétique de ces facteurs maternels nécessite une génération supplémentaire pour identifier les phénotypes d’effet maternel, ce qui entrave la capacité de déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère au cours du développement. La découverte des capacités d’édition biallélique de CRISPR-Cas9 a permis le criblage de phénotypes embryonnaires dans les tissus somatiques d’embryons injectés ou de « crispants », augmentant ainsi la compréhension du rôle que jouent les gènes exprimés zygotiquement dans les programmes de développement. Cet article décrit un protocole qui est une extension de la méthode crispant. Dans cette méthode, l’édition biallélique des cellules germinales permet d’isoler un phénotype d’effet maternel en une seule génération, ou « crispants maternels ». Le multiplexage des ARN guides vers une seule cible favorise la production efficace de crispants maternels, tandis que l’analyse de séquence des haploïdes maternels crispants fournit une méthode simple pour corroborer les lésions génétiques qui produisent un phénotype d’effet maternel. L’utilisation de crispants maternels favorise l’identification rapide des gènes essentiels exprimés par la mère, facilitant ainsi la compréhension du développement précoce.

Introduction

Un pool de produits déposés par la mère (par exemple, ARN, protéines et autres biomolécules) est nécessaire pour tous les processus cellulaires précoces jusqu’à ce que le génome zygotique de l’embryon soit activé¹. L’épuisement prématuré de ces produits de l’ovocyte est généralement létal embryonnaire. Malgré l’importance de ces gènes dans le développement, le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère est actuellement inconnu. Les progrès de la technologie d’édition de gènes chez le poisson zèbre, tels que CRISPR-Cas9, permettent de cibler les gènes exprimés par la mère ^2,3,4. Cependant, l’identification d’un phénotype d’effet maternel nécessite une génération supplémentaire par rapport à un phénotype zygotique, nécessitant ainsi plus de ressources. Récemment, la capacité d’édition biallélique de CRISPR-Cas9 a été utilisée pour dépister les phénotypes embryonnaires dans les tissus somatiques d’embryons injectés (F0), connus sous le nom de « crispants »5,6,7,8,9,10. La technique de crispant permet un criblage efficace des gènes candidats dans les cellules somatiques, facilitant ainsi la compréhension des aspects spécifiques du développement. Le protocole décrit dans cet article permet d’identifier les phénotypes de l’effet maternel, ou « crispants maternels », en une seule génération¹¹. Ce schéma est réalisable en multiplexant les ARN guides vers un seul gène et en favorisant les événements d’édition bialléliques dans la lignée germinale. Ces embryons maternels crispants peuvent être identifiés par des phénotypes morphologiques macroscopiques et faire l’objet d’une caractérisation primaire, telle que l’étiquetage des limites cellulaires et la structuration de l’ADN¹¹. L’analyse combinée du phénotype observable et la caractérisation moléculaire de base des INDEL induites permettent de prédire le rôle du gène ciblé dans le développement précoce.

Chez le poisson zèbre, au cours des premières 24 heures post-fécondation (HPF), un petit groupe de cellules se développe dans les cellules germinales primordiales, un précurseur de la lignée germinale^12,13,14,15. Dans les couvées pondues par les femelles F0, la proportion d’embryons maternels crispants récupérés dépend du nombre de cellules germinales contenant un événement d’édition biallélique dans le gène ciblé. En général, plus l’événement d’édition se produit tôt dans l’embryon, plus la probabilité que des mutations CRISPR-Cas9 soient observées dans la lignée germinale est élevée. Dans la plupart des cas, les phénotypes des embryons maternels crispants proviennent de la perte de fonction des deux allèles maternels présents dans l’ovocyte en développement. Lorsque l’ovocyte termine la méiose, l’un des allèles maternels est extrudé de l’embryon via le corps polaire, tandis que l’autre allèle est incorporé dans le pronucleus maternel. Le séquençage de multiples haploïdes maternels crispants représentera un mélange des mutations (insertions et/ou délétions (INDEL)) présentes dans la lignée germinale qui contribuent au phénotype¹¹.

Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires pour créer des mutations CRISPR-Cas9 dans les gènes de l’effet maternel et identifier le phénotype correspondant à l’aide d’une approche de crispant maternel (Figure 1). La première section expliquera comment concevoir et créer efficacement des ARN guides, tandis que les sections deux et trois contiennent des étapes critiques pour la création de crispants maternels par micro-injection. Après l’injection du mélange CRISPR-Cas9, les embryons injectés sont examinés pour les modifications somatiques par PCR (section quatre). Une fois que les embryons F0 injectés se développent et atteignent la maturité sexuelle, les femelles F0 sont croisées avec des mâles de type sauvage, et leur progéniture est examinée pour les phénotypes d’effet maternel (section cinq). La section six comprend des instructions sur la fabrication d’haploïdes maternels crispants qui peuvent être combinés avec le séquençage de Sanger pour identifier les INDEL induites par CRISPR-Cas9. En outre, la discussion contient des modifications qui peuvent être apportées au protocole pour augmenter la sensibilité et la puissance de cette méthode.

Protocole

Dans les études qui ont conduit à l’élaboration de ce protocole, tous les logements et expériences de poisson zèbre ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).

1. Synthèse des ARN guides

REMARQUE: Les crispants zygotiques ont été créés en utilisant un seul ARN guide ou en multiplexant plusieurs ARN guides vers une seule cible 5,6,7,8,9,10. Le multiplexage des ARN guides augmente le pourcentage d’embryons présentant un phénotype zygotique crispant¹⁰. En raison de cette fréquence accrue d’embryons présentant un phénotype, les crispants maternels sont créés en multiplexant quatre ARN guides vers un seul gène. Un protocole plus détaillé sur l’utilisation de CHOPCHOP pour concevoir des ARN guides et une méthode de recuit pour synthétiser les ARN guides pour le poisson zèbre peuvent être trouvés ailleurs 16,17,18,19,20.

1. Pour identifier un gène exprimé par la mère à cibler, déterminer les niveaux de transcrit d’ARNm pendant le développement via une base de données de séquences d’ARN qui fournit des informations sur le transcriptome du zygote à 5 jours²¹. En général, les gènes spécifiques à la mère sont fortement exprimés dans l’embryon précoce et sont dégradés après l’activation du génome zygotique²².
2. Une fois qu’un gène cible exprimé par la mère a été identifié, déterminer le premier domaine protéique prédit à l’aide de la section « domaines et caractéristiques » disponible sur le navigateur génomique Ensembl²³. Utilisez ce domaine comme région cible pour les quatre ARN guides.
3. Utilisez le programme de sélection de l’ARN guide CHOPCHOP pour identifier quatre sites cibles d’ARN guides dans le premier domaine actif. Concevoir des oligonucléotides spécifiques aux gènes, comme indiqué ci-dessous pour chaque site cible. Dans l’oligonucléotide spécifique du gène, la section N²⁰ correspond à la séquence cible moins le site PAM (NGG) de CHOPCHOP. Commandez ces oligonucléotides spécifiques au gène et l’oligonucléotide constant en utilisant la purification standard du dessel (voir le tableau des matériaux).
   Oligonucléotide spécifique du gène :
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Pour créer un modèle d’ARN guide pour chaque oligonucléotide spécifique au gène, recuit à l’oligonucléotide constant et remplir les surplombs avec de l’ADN polymérase T4 comme décrit précédemment¹⁶. Une fois les quatre modèles d’ARN guides assemblés, purifiez-les et concentrez-les ensemble à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
5. Synthétiser le mélange d’ARNg à partir du modèle d’ARN guide mis en commun à l’aide d’un kit de transcription T7 in vitro (voir le tableau des matériaux). Effectuer la transcription in vitro selon les instructions du fabricant. L’utilisation de demi-réactions du kit de transcription T7 peut réduire le coût par réaction.
6. Après synthèse d’ARN, purifier le pool résultant d’ARNg à l’aide d’un protocole éthanol/acétate d’ammonium tel que décrit précédemment 16,20,24. Une fois l’ARN isolé, remettez-le en suspension dans 20 μL d’eau exempte de nucléase. Si des demi-réactions du kit de transcription T7 ont été utilisées pour transcrire le pool d’ARNg, remettre en suspension l’ARN purifié dans 10-15 μL d’eau sans nucléase.
7. Quantifier la quantité d’ARNg regroupés qui ont été créés à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer le pool d’ARNg dans de l’eau exempte de nucléases jusqu’à une dilution de 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. En règle générale, le volume final de la dilution de travail varie de 30 à 50 μL.
8. Après avoir déterminé la concentration du pool d’ARNg, vérifier l’intégrité des ARNg sur un gel d’agarose à 1%.
   1. Lancer un gel d’agarose à 1 % / 0,5 μg / mL de bromure d’éthidium / TBI. Une fois que le gel s’est solidifié, placez-le dans un tampon courant de TBE.
   2. Mélanger 1 μL du mélange d’ARNg et 1 μL de tampon de charge de gel d’ARN (voir le tableau des matériaux). Chargez cet échantillon dans le gel et faites fonctionner le gel à 100 V pendant 5 min.
9. Visualisez les bandes à l’aide de la lumière ultraviolette (UV). Le pool de sgRNAs doit apparaître comme une seule bande. Si un frottis est observé, une dégradation de l’ARN s’est probablement produite.
10. Entreposer le pool d’ARNg dans des aliquotes à usage unique de 1 μL dans des tubes en bandelettes PCR sans nucléase dans le congélateur à -80 °C. Pour de grands volumes de mélange d’ARNg (30 μL ou plus), aliquote la moitié du volume dans les tubes de bandelette de PCR sans nucléase et stocker l’autre moitié comme un plus grand volume dans un tube de microcentrifugeuse sans nucléase. Décongeler et aliquote au besoin.
11. Pour prévenir la dégradation de l’ARN, s’assurer que les échantillons dans le tube de microcentrifugation ne subissent pas plus de deux cycles de congélation-dégel.

2. Préparation des réactifs et des matériaux pour la microinjection

REMARQUE: Chez le poisson zèbre, l’injection d’ARNm Cas9 peut créer des croustillants zygotiques. Cependant, des études ont montré que la protéine Cas9 est plus efficace dans la création d’INDELs dans les embryons injectés^16,25. Ce protocole utilise la protéine Cas9 pour générer des crispants maternels car cette protéine ne connaît pas le même décalage d’activité que l’ARNm Cas9 injecté. En théorie, cela devrait augmenter la probabilité d’une mutation biallélique au début du développement, ce qui augmenterait le risque qu’une section plus étendue de la lignée germinale soit affectée. D’autres protocoles et ressources détaillant comment se préparer aux micro-injections peuvent être trouvés ailleurs^24,26.

1. Achetez ou générez de la protéine Cas9 (voir le tableau des matières). Remettez en suspension la protéine Cas9 dans de l’eau exempte de nucléases pour obtenir une solution de 2 mg/mL et aliquote 1 μL dans des tubes microcentrifuges en polypropylène sans RNase. Conservez-les sous forme de tubes à usage unique à -80 °C.
2. L’après-midi précédant l’injection, utilisez un extracteur de micropipette pour tirer un capillaire en verre et créer une aiguille d’injection. Conservez l’aiguille intacte dans un porte-aiguille fermé jusqu’au matin des micro-injections.
3. Pour créer une plaque d’injection, versez 20 ml d’agarose à 1,5 % / H₂O stérile pour remplir la moitié d’une boîte de Petri de 100 mm X 15 mm et attendez qu’elle se solidifie. Une fois la solution d’agarose prise, ajouter 20 mL d’agarose à 1,5 % / H₂O stérile à la boîte de Petri et placer le moule en plastique (voir le tableau des matériaux) dans l’agarose liquide et laisser durcir.
4. Une fois que l’agarose a durci, retirez le moule en plastique et conservez la plaque d’injection à l’envers dans un réfrigérateur jusqu’au matin des injections. Une seule plaque peut être utilisée pour des injections multiples tant que les puits conservent leur intégrité.

3. Microinjection de cocktail CRISPR-Cas9 dans un embryon de poisson-zèbre unicellulaire pour générer des crispants maternels

NOTE: Plus de ressources pour la micro-injection dans les embryons de poisson zèbre peuvent être trouvées ailleurs^24,26,27. L’injection du mélange CRISPR-Cas9 dans le blastodisque en développement d’embryons unicellulaires peut augmenter la probabilité de créer des crispants maternels. Le mélange peut également être injecté dans le sac vitellin jusqu’au stade 2 cellules. Cependant, les mélanges injectés dans le jaune dépendent du flux ooplasmique pour atteindre le blastodisque, de sorte que CRISPR-Cas9 injecté dans le jaune pourrait diminuer l’efficacité de coupe du CRISPR-Cas9²⁸.

1. L’après-midi précédant les micro-injections, installez des croisements de type sauvage dans des boîtes d’accouplement de poisson zèbre. Gardez les poissons mâles et femelles dans le même aquarium, mais séparez-les avec un séparateur de boîte d’accouplement ou placez la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte.
2. Le matin de l’expérience, sortez une partie aliquote de 2 mg/mL de protéine Cas9 et une partie aliquote du pool d’ARNg. Dans le tube microcentrifuge en polypropylène sans RNase qui contient la protéine Cas9, assemblez un mélange d’injection de 5 μL qui comprend le pool d’ARNg, 1 μL de solution de rouge phénolique à 0,5 % et de l’eau sans nucléase. Visez une concentration finale de 400 ng/μL de protéine Cas9 et 200 ng/μL des ARNg mélangés dans de l’eau exempte de RNase ou un rapport de 2:1 de la protéine Cas9 aux ARNg dans l’embryon injecté. Ce mélange d’injection peut être conservé sur de la glace pour le matin de l’injection.
3. Retirez une plaque d’injection du réfrigérateur et laissez-la chauffer à température ambiante (RT) pendant au moins 20 minutes.
4. Une fois le cocktail d’injection assemblé, laisser le mâle et la femelle s’accoupler, par exemple en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle, selon le cas.
5. Après la ponte du poisson, mais avant que les embryons aient été recueillis, coupez la pointe d’une aiguille intacte à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir ou d’une pince fine pour créer une aiguille dont l’alésage est assez petit pour éviter les dommages aux embryons, mais suffisamment large pour ne pas être obstruée par le mélange d’injection. Une fois l’aiguille coupée, chargez-la avec le mélange d’injection à l’aide d’une pointe de pipette de microchargeur insérée dans l’extrémité arrière du capillaire (voir Tableaux des matériaux).
6. Une fois l’aiguille remplie, incuber l’aiguille pendant 5 min à RT pour assembler les complexes Cas9-sgRNA.
7. Allumez le micro-injecteur et insérez l’aiguille dans le micromanipulateur. Placez une goutte d’huile minérale sur une lame micrométrique et calibrez l’aiguille en ajustant la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille éjecte un bolus de 1 nL dans l’huile minérale.
   REMARQUE: Lors de l’injection dans l’huile minérale, un bolus de 1 nL aura un diamètre d’environ 0,125 mm (ou un rayon de 0,062 mm) tel que mesuré avec la lame micrométrique.
8. Pour synchroniser les embryons, prélevez-les après 10 min à l’aide d’une passoire en plastique et rincez-les dans une boîte de Petri à l’aide de 1x milieu E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO₄, et ajoutez 20 μL de_0,03 M de Bleu de méthylène pour 1 L de 1x E3). Prélever 10 à 15 embryons et les placer dans une boîte de Petri séparée pour les conserver comme témoins non injectés.
9. Transférer le reste des embryons en développement dans les puits de la plaque d’injection.
10. Injecter 1 nL de solution (un total de 400 pg de protéine Cas9 et 200 pg d’ARNg) dans le blastodisque en développement d’un embryon unicellulaire. Si l’extrémité de l’aiguille se bouche, utilisez une pince pour casser l’extrémité vers l’arrière et recalibrez l’aiguille pour éjecter un bolus de 1 nL. Assurez-vous d’injecter tous les embryons pendant les 40 premières minutes de développement après la fécondation.
11. Une fois l’injection terminée, remettez les embryons injectés dans une boîte de Petri étiquetée contenant 1x milieu E3 et laissez-les se développer tout au long de la journée. Enlever tous les embryons qui ne sont pas fécondés ou qui ne se développent pas normalement selon la série de stadification du poisson zèbre²⁹.

4. Dépistage des INDEL somatiques dans les embryons injectés F0

REMARQUE : D’autres méthodes d’identification des INDEL, telles que le dosage de l’endonucléase T7 I ou l’analyse de fusion à haute résolution, peuvent être utilisées pour déterminer si les embryons contiennent des INDEL somatiques ³⁰.

1. Le lendemain après les injections, retirez les embryons défectueux et lysés de la boîte de Petri et remplacez le support E3 1x pour maintenir la santé de l’embryon.
2. Après avoir nettoyé le plat, prélevez six embryons injectés sains et deux embryons témoins de la plaque non injectée. Placez chaque embryon individuellement dans un seul puits d’un tube en bande PCR et étiquetez le dessus des tubes.
3. Pour extraire l’ADN génomique d’embryons individuels, retirez l’excès de milieu E3 des puits du tube en bande et ajoutez 100 μL de NaOH 50 mM par puits.
4. Incuber les embryons à 95 °C pendant 20 min. Refroidir ensuite les échantillons à 4 °C, ajouter 10 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) et les vorter pendant 5 à 10 s. Cet ADN extrait peut être conservé à -20 °C pendant au moins 6 mois sans dégradation significative de l’ADN.
5. Concevoir des amorces de criblage uniques pour chaque site guide afin d’amplifier un fragment d’ADN de 100 à 110 pb qui comprend le site cible de CRISPR-Cas9. Si possible, placez le site cible au milieu du fragment amplifié, ce qui permet d’identifier des suppressions plus importantes.
6. Pour chacun des quatre sites cibles guides, mettre en place huit réactions PCR de 25 μL en utilisant 5 μL d’ADN génomique mono-embryon préparé, le mélange de PCR et les amorces de criblage spécifiques au guide pour identifier les mutations somatiques dans le site cible (tableau 1).
7. Couler une agarose à 2,5 %/0,5 μg/mL de bromure d’éthidium/gel d’encéphalite à l’aide de peignes qui créent des puits d’environ 0,625 cm de large. Ce peigne large permet une meilleure résolution lors de la détection des changements de taille de la séquence génomique. Une fois que le gel s’est solidifié, placez-le dans une chambre d’électrophorèse contenant un tampon courant de TBE.
8. Ajouter 5 μL de colorant de chargement 6x au produit PCR et charger 25 μL de ce mélange dans le gel. Assurez-vous que les échantillons injectés et témoins sont exécutés sur la même rangée du gel. Une fois tous les échantillons chargés, ajouter 5 μL de bromure d’éthidium par 1 L de tampon courant de TBE à l’extrémité positive de la boîte de gel.
9. Exécutez le gel à 120 V jusqu’à ce que les bandes d’ADN se résolvent ou que l’ADN se soit approché de la fin de la voie. Si le Cas9 a créé des INDEL dans le site cible, un frottis est généralement observé dans les échantillons injectés, mais pas dans les témoins.
10. Si des frottis sont observés dans au moins trois des quatre sites guides dans les embryons injectés avec quatre ARN guides, grandir les embryons injectés frères et sœurs.
11. Chaque fois que les échantillons injectés ne contiennent pas de frottis dans le nombre requis de sites guides, concevoir de nouveaux ARN guides pour remplacer ceux qui n’ont pas fonctionné et créer un nouveau pool d’ARN guides qui comprend ceux qui ont fonctionné et ceux nouvellement conçus. Injectez et testez le nouveau pool pour les INDEL somatiques comme décrit ci-dessus.

5. Identification des phénotypes de l’effet maternel chez les embryons maternels crispants

NOTE: Une fois que les femelles F0 injectées ont atteint la maturité sexuelle, leurs cellules germinales ont le potentiel de générer un mélange d’embryons maternels crispants et sauvages. Même si ce mélange permet des contrôles internes pour la fécondation et le calendrier de développement, il est toujours avantageux de mettre en place un croisement de type sauvage comme contrôle externe dans le cas où une couvée de femelle F0 ne contient que des embryons maternels crispants.

1. L’après-midi précédant l’expérience, installez les femelles injectées F0 contre des mâles de type sauvage et contrôlez les croisements de type sauvage dans des boîtes d’accouplement standard de poisson zèbre. Placez les poissons mâles et femelles dans le même aquarium, mais séparez-les à l’aide d’un séparateur de boîte d’accouplement ou placez la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte.
2. Le matin de l’expérience, laissez le mâle et la femelle commencer à s’accoupler, par exemple en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle.
3. Prélevez les embryons toutes les 10 minutes en déplaçant l’insert de ponte dans un nouveau fond de réservoir d’accouplement contenant de l’eau fraîche du système et étiquetez le réservoir avec une étiquette identifiant la femelle F0 individuelle. Prenez l’ancien réservoir d’accouplement et versez l’eau dans une passoire à thé pour recueillir les embryons d’une couvée individuelle de 10 minutes.
4. Une fois que les embryons d’une seule couvée de 10 minutes ont été collectés dans la passoire, transférez-les dans une boîte de Petri contenant 1x milieu E3. Étiquetez la boîte de Petri avec l’heure de collecte et les informations sur le poisson.
5. Sous un microscope à dissection avec une source de lumière transmise, observez les embryons en cours de développement toutes les heures pendant les 6-8 premières heures et quotidiennement pendant les 5 jours suivants.
6. Identifier les embryons maternels crispants potentiels par des changements morphologiques bruts dans leur développement par rapport aux témoins de type sauvage appariés dans le temps²⁹.
7. Déplacer les embryons potentiellement crispants maternels dans une boîte de Petri contenant 1x milieu E3 et un test de phénotype morphologique à 24 hpf et de viabilité (par exemple, gonflement de la vessie natatoire) 5 jours après la fécondation.

6. Séquençage des allèles chez les haploïdes croustillants maternels

REMARQUE: Les haploïdes maternels crispants contiennent un seul allèle dans le locus ciblé, ce qui permet l’identification des INDEL dans le gène cible via le séquençage de Sanger. Les embryons haploïdes crispants maternels peuvent également être analysés à l’aide de tests de séquençage de nouvelle génération. On s’attend à ce que les embryons qui présentent un phénotype de crispant maternel soient porteurs d’une lésion dans au moins un des quatre sites cibles (voir la discussion).

1. L’après-midi précédant l’expérience, mise en place de paires d’accouplement de femelles F0 connues pour produire des embryons maternels crispants croisés avec des mâles de type sauvage. Gardez les mâles de type sauvage physiquement séparés des femelles à l’aide d’un séparateur de boîte d’accouplement ou placez la femelle dans l’insert de ponte.
2. Le matin de l’expérience, retirez la cloison physique ou placez les mâles et les femelles dans l’insert de ponte pour initier l’accouplement. Au premier signe de ponte, interrompre la reproduction en séparant le mâle et les femelles F0. Gardez chaque femelle F0 séparée dans des boîtes d’accouplement individuelles.
3. Préparer une solution de sperme traitée aux UV à l’aide de testicules provenant d’un mâle de type sauvage pour chaque tranche de 100 μL de solution de Hank (tableau 2), suffisante pour féconder les œufs extrudés d’une femelle, comme décrit précédemment³¹.
4. Extrudez manuellement les ovules matures des femelles F0 présélectionnées et effectuez la fécondation in vitro (FIV) à l’aide du sperme traité aux UV³¹.
5. Après la fécondation in vitro , laissez les embryons haploïdes se développer jusqu’à ce que le phénotype de crispant maternel soit observé et placez ces embryons dans une boîte de Petri différente.
6. Une fois que les embryons haploïdes maternels crispants ont été identifiés, laissez-les se développer pendant au moins 6 heures après la fécondation.
7. Pour extraire l’ADN génomique d’au moins dix embryons haploïdes maternels crispants, placez un seul embryon haploïde dans un puits individuel d’un tube en bandelette de PCR, retirez l’excès de milieu E3 du puits et ajoutez 50 μL de NaOH 50 mM.
8. Incuber les embryons à 95 °C pendant 20 min. Ensuite, refroidir les échantillons à 4 °C, ajouter 5 μL de 1 M Tris HCL (pH 7,5) et vortex pendant 5-10 s. L’ADN extrait peut être conservé à -20 °C jusqu’à 6 mois.
9. Pour identifier les sites guides contenant des INDEL, concevez des amorces de séquençage pour amplifier un fragment d’ADN qui comprend les quatre sites cibles CRISPR-Cas9. Ces amorces de séquençage permettent d’identifier les INDEL qui couvrent plusieurs sites guides.
10. Mettre en place deux réactions PCR de 25 μL par embryon en utilisant 5 μL de l’ADN génomique préparé et les amorces de séquençage.
11. Une fois la PCR terminée, purifier et concentrer les deux échantillons à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN (voir le tableau des matériaux). Ensuite, soumettez le fragment d’ADN au séquençage de Sanger en utilisant à la fois les amorces de séquençage avant et arrière.
12. Une fois que le fragment de crispant maternel haploïde a été séquencé, alignez-le sur la séquence de type sauvage et identifiez les INDEL dans les sites cibles à l’aide d’un programme d’alignement de séquence.

Résultats

L’approche expérimentale décrite dans ce protocole permet d’identifier les phénotypes d’effet maternel de manière rapide et économe en ressources (Figure 1).

Générer des crispants maternels :
Lors de la conception des quatre ARN guides pour cibler un seul gène candidat de l’effet maternel, une attention particulière doit être accordée à l’endroit où les ARN guides se lieront à l’ADN. En général, ils devraient tous ê...

Discussion

Le protocole présenté dans ce manuscrit permet l’identification et la caractérisation moléculaire primaire d’un phénotype d’effet maternel en une seule génération au lieu des générations multiples requises pour les techniques génétiques directes et inverses. Actuellement, le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère est inconnu. Ce manque de connaissances est en partie dû à la génération supplémentaire nécessaire pour visualiser un phénotype lors de l’identification des gènes de l’effet...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes