Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants

Zusammenfassung

Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.

Zusammenfassung

Die frühe Entwicklung hängt von einem Pool mütterlicher Faktoren ab, die während der Oogenese in die reife Eizelle eingebaut werden und alle für die Entwicklung notwendigen zellulären Funktionen bis zur Aktivierung des zygotischen Genoms erfüllen. Typischerweise erfordert das genetische Targeting dieser mütterlichen Faktoren eine zusätzliche Generation, um Phänotypen mit mütterlichem Effekt zu identifizieren, was die Fähigkeit behindert, die Rolle von maternal exprimierten Genen während der Entwicklung zu bestimmen. Die Entdeckung der biallelischen Editierfähigkeiten von CRISPR-Cas9 hat das Screening embryonaler Phänotypen in somatischen Geweben injizierter Embryonen oder "Crispants" ermöglicht und das Verständnis der Rolle zygotisch exprimierter Gene in Entwicklungsprogrammen erweitert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das eine Erweiterung der Crispant-Methode darstellt. Bei dieser Methode ermöglicht die biallelische Bearbeitung von Keimzellen die Isolierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation oder "mütterlichen Crispants". Multiplexing-Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel fördert die effiziente Produktion von mütterlichen Crispants, während die Sequenzanalyse von mütterlichen Crispant-Haploiden eine einfache Methode zur Bestätigung genetischer Läsionen bietet, die einen mütterlichen Phänotyp erzeugen. Die Verwendung von mütterlichen Crispants unterstützt die schnelle Identifizierung essentieller maternal exprimierter Gene und erleichtert so das Verständnis der frühen Entwicklung.

Einleitung

Ein Pool von mütterlich abgelagerten Produkten (z. B. RNAs, Proteine und andere Biomoleküle) ist für alle frühen zellulären Prozesse notwendig, bis das zygotische Genom des Embryos aktiviert ist¹. Die vorzeitige Erschöpfung dieser Produkte aus der Eizelle ist typischerweise embryonal tödlich. Trotz der Bedeutung dieser Gene für die Entwicklung ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene derzeit unbekannt. Fortschritte in der Gen-Editing-Technologie bei Zebrafischen, wie CRISPR-Cas9, ermöglichen das Targeting von maternal exprimierten Genen ^2,3,4. Die Identifizierung eines mütterlichen Phänotyps erfordert jedoch eine zusätzliche Generation im Vergleich zu einem zygotischen Phänotyp und erfordert daher mehr Ressourcen. Vor kurzem wurde die biallelische Bearbeitungsfähigkeit von CRISPR-Cas9 genutzt, um nach embryonalen Phänotypen in somatischen Geweben injizierter (F0) Embryonen, bekannt als "Crispants"5,6,7,8,9,10, zu suchen. Die Crispant-Technik ermöglicht ein ressourceneffizientes Screening von Kandidatengenen in somatischen Zellen und erleichtert so das Verständnis spezifischer Aspekte in der Entwicklung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von mütterlichen Effekt-Phänotypen oder "maternalen Crispants" in einer einzigen Generation¹¹. Dieses Schema ist erreichbar, indem Guide-RNAs auf ein einzelnes Gen gemultiplext und biallelische Editierereignisse in der Keimbahn gefördert werden. Diese mütterlichen Crispant-Embryonen können durch grobe morphologische Phänotypen identifiziert werden und einer primären Charakterisierung unterzogen werden, wie z. B. Markierung für Zellgrenzen und DNA-Musterung¹¹. Die kombinierte Analyse des beobachtbaren Phänotyps und die grundlegende molekulare Charakterisierung der induzierten INDELs ermöglichen die Vorhersage der Rolle des Zielgens in der frühen Entwicklung.

Im Zebrafisch entwickelt sich während der ersten 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) eine kleine Gruppe von Zellen zu den primordialen Keimzellen, einem Vorläufer der Keimbahn^12,13,14,15. In Gelege von F0-Weibchen hängt der Anteil der gewonnenen mütterlichen Crispant-Embryonen davon ab, wie viele Keimzellen ein biallelisches Editierungsereignis im Zielgen enthalten. Im Allgemeinen gilt: Je früher das Bearbeitungsereignis im Embryo auftritt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass CRISPR-Cas9-Mutationen in der Keimbahn beobachtet werden. In den meisten Fällen stammen die Phänotypen mütterlicher Crispant-Embryonen aus dem Funktionsverlust der beiden mütterlichen Allele, die in der sich entwickelnden Eizelle vorhanden sind. Wenn die Eizelle die Meiose beendet, wird eines der mütterlichen Allele über den Polkörper aus dem Embryo extrudiert, während das andere Allel in den mütterlichen Vorkern eingebaut wird. Die Sequenzierung mehrerer mütterlicher Crispant-Haploide stellt eine Mischung der in der Keimbahn vorhandenen Mutationen (Insertionen und/oder Deletionen (INDELs)) dar, die zum Phänotyp¹¹ beitragen.

Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Erzeugung von CRISPR-Cas9-Mutationen in maternalen Effektgenen und zur Identifizierung des entsprechenden Phänotyps mit einem mütterlichen Crispant-Ansatz (Abbildung 1). Abschnitt eins wird erklären, wie man Guide-RNAs effektiv entwirft und erstellt, während die Abschnitte zwei und drei kritische Schritte zur Herstellung mütterlicher Crispants durch Mikroinjektion enthalten. Nach der Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung werden die injizierten Embryonen mittels PCR auf somatische Schnitte untersucht (Abschnitt vier). Sobald sich die injizierten F0-Embryonen entwickeln und die Geschlechtsreife erreichen, werden die F0-Weibchen mit Wildtyp-Männchen gekreuzt, und ihre Nachkommen werden auf mütterliche Phänotypen untersucht (Abschnitt fünf). Abschnitt sechs enthält Anweisungen zur Herstellung mütterlicher Crispant-Haploide, die mit der Sanger-Sequenzierung kombiniert werden können, um die CRISPR-Cas9-induzierten INDELs zu identifizieren. Darüber hinaus enthält die Diskussion Änderungen, die am Protokoll vorgenommen werden können, um die Empfindlichkeit und Leistungsfähigkeit dieser Methode zu erhöhen.

Protokoll

In Studien, die zur Entwicklung dieses Protokolls führten, wurden alle Zebrafischhaltungen und Experimente vom University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2) genehmigt.

1. Synthese von Guide-RNAs

HINWEIS: Zygotische Crispants wurden unter Verwendung einer einzigen Guide-RNA oder des Multiplexens mehrerer Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel 5,6,7,8,9,10 hergestellt. Das Multiplexing von Guide-RNAs erhöht den Prozentsatz der Embryonen mit einem zygotischen crispant-Phänotyp¹⁰. Aufgrund dieser erhöhten Häufigkeit von Embryonen, die einen Phänotyp aufweisen, werden mütterliche Crispants erzeugt, indem vier Guide-RNAs zu einem einzigen Gen gemultiplext werden. Ein detaillierteres Protokoll über die Verwendung von CHOPCHOP zum Design von Guide-RNAs und eine Annealing-Methode zur Synthese von Guide-RNAs für Zebrafische finden Sie an anderer Stelle 16,17,18,19,20.

1. Um ein mütterlich exprimiertes Gen zu identifizieren, das anvisiert werden soll, bestimmen Sie die mRNA-Transkriptspiegel während der Entwicklung über eine RNA-Sequenzdatenbank, die Transkriptominformationen von Zygote bis 5 Tage²¹ liefert. Im Allgemeinen werden maternspezifische Gene im frühen Embryo stark exprimiert und nach Aktivierung des zygotischen Genoms abgebaut²².
2. Sobald ein mütterlich exprimiertes Zielgen identifiziert wurde, bestimmen Sie die erste vorhergesagte Proteindomäne mithilfe des Abschnitts "Domänen und Merkmale", der im Ensembl-Genombrowser²³ verfügbar ist. Verwenden Sie diese Domäne als Zielregion für die vier Guide-RNAs.
3. Verwenden Sie das Guide-RNA-Auswahlprogramm CHOPCHOP, um vier Guide-RNA-Zielstellen in der ersten aktiven Domäne zu identifizieren. Entwerfen Sie genspezifische Oligonukleotide, wie unten für jede Zielstelle gezeigt. Im genspezifischen Oligonukleotid entspricht der^{N20-Abschnitt} der Zielsequenz abzüglich der PAM-Stelle (NGG) von CHOPCHOP. Ordnen Sie diese genspezifischen Oligonukleotide und das konstante Oligonukleotid mittels Standard-Entsalzungsreinigung (siehe Materialtabelle).
   Genspezifisches Oligonukleotid:
   5' TAATACGACTCACTATA- N²⁰ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
4. Um eine Leit-RNA-Vorlage für jedes genspezifische Oligonukleotid zu erstellen, glühen Sie es auf das konstante Oligonukleotid und füllen Sie die Überhänge mit T4-DNA-Polymerase, wie zuvor beschrieben¹⁶. Nachdem die vier Guide-RNA-Templates zusammengesetzt sind, reinigen und konzentrieren Sie sie zusammen mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
5. Synthetisieren Sie die sgRNA-Mischung aus der gepoolten Guide-RNA-Vorlage unter Verwendung eines In-vitro-T7-Transkriptionskits (siehe Materialtabelle). Führen Sie die In-vitro-Transkription gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Die Verwendung von Halbreaktionen des T7-Transkriptionskits kann die Kosten pro Reaktion senken.
6. Nach der RNA-Synthese wird der resultierende Pool von sgRNAs unter Verwendung eines Ethanol/Ammoniumacetat-Protokolls gereinigt, wie zuvor beschrieben 16,20,24. Nachdem die RNA isoliert wurde, resuspendieren Sie sie in 20 μL nukleasefreiem Wasser. Wenn Halbreaktionen des T7-Transkriptionskits verwendet wurden, um den Pool von sgRNAs zu transkribieren, resuspendieren Sie die gereinigte RNA in 10-15 μL nukleasefreies Wasser.
7. Quantifizieren Sie die Menge der gepoolten sgRNAs, die mit einem Spektralphotometer erzeugt wurden. Verdünnen Sie den Pool von sgRNAs in nukleasefreiem Wasser auf eine Verdünnung von 1500 ng / μL ± 500 ng / μL. Typischerweise liegt das Endvolumen der Arbeitsverdünnung zwischen 30 und 50 μL.
8. Nachdem Sie die Konzentration des Pools von sgRNAs bestimmt haben, überprüfen Sie die Integrität der sgRNAs auf einem 1% igen Agarosegel.
   1. Gießen Sie ein 1% Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/FSME-Gel. Sobald das Gel erstarrt ist, legen Sie es in den FSME-Laufpuffer.
   2. Mischen Sie 1 μL der sgRNA-Mischung und 1 μL RNA-Gel-Ladepuffer (siehe Materialtabelle). Laden Sie diese Probe in das Gel und lassen Sie das Gel bei 100 V für 5 min laufen.
9. Visualisieren Sie die Bänder mit ultraviolettem (UV) Licht. Der Pool der sgRNAs sollte als eine einzige Bande erscheinen. Wenn ein Abstrich beobachtet wird, ist wahrscheinlich ein RNA-Abbau aufgetreten.
10. Lagern Sie den Pool der sgRNAs in 1 μL Aliquots zur einmaligen Verwendung in nukleasefreien PCR-Streifenröhrchen im -80 °C Gefrierschrank. Bei großen Mengen an sgRNAs-Gemischen (30 μL oder mehr) aliquot die Hälfte des Volumens in die nukleasefreien PCR-Streifenröhrchen und speichern Sie die andere Hälfte als größeres Volumen in einem nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen. Auftauen und bei Bedarf aliquot.
11. Um einen RNA-Abbau zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Proben im Mikrozentrifugenröhrchen nicht mehr als zwei Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen.

2. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für die Mikroinjektion

HINWEIS: Im Zebrafisch kann die Injektion von Cas9 mRNA zygotische Crispants erzeugen. Studien haben jedoch gezeigt, dass Cas9-Protein effizienter bei der Erzeugung von INDELs in injizierten Embryonen^{ist 16,25}. Dieses Protokoll verwendet Cas9-Protein, um mütterliche Crispants zu erzeugen, da dieses Protein nicht die gleiche Verzögerung in der Aktivität erfährt wie injizierte Cas9-mRNA. Theoretisch sollte dies die Wahrscheinlichkeit einer biallelischen Mutation früh in der Entwicklung erhöhen, was zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit führt, dass ein ausgedehnterer Abschnitt der Keimbahn betroffen ist. Andere Protokolle und Ressourcen, die detailliert beschreiben, wie man sich auf Mikroinjektionen vorbereitet, finden Sie an anderer Stelle^24,26.

1. Cas9-Protein kaufen oder erzeugen (siehe Materialtabelle). Resuspendieren Sie das Cas9-Protein in nukleasefreiem Wasser, um eine 2 mg/ml-Lösung herzustellen, und aliquot 1 μL in RNase-freie Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie diese als Einwegröhrchen bei -80 °C.
2. Verwenden Sie am Nachmittag vor der Injektion einen Mikropipettenzieher, um eine Glaskapillare zu ziehen und eine Injektionsnadel herzustellen. Bewahren Sie die ungebrochene Nadel bis zum Morgen der Mikroinjektionen in einem geschlossenen Nadelhalter auf.
3. Um eine Injektionsplatte herzustellen, gießen Sie 20 ml 1,5% Agarose/steriles_H2O, um die Hälfte einer 100 mm x 15 mm großen Petrischale zu füllen, und warten Sie, bis sie sich verfestigt hat. Sobald die Agaroselösung fest ist, geben Sie 20 ml 1,5% Agarose/steriles_H2Oin die Petrischale und legen Sie die Kunststoffform (siehe Materialtabelle) in die flüssige Agarose und lassen Sie sie aushärten.
4. Nachdem die Agarose ausgehärtet ist, entfernen Sie die Kunststoffform und lagern Sie die Spritzplatte kopfüber in einem Kühlschrank bis zum Morgen der Injektionen. Eine einzelne Platte kann für mehrere Injektionen verwendet werden, solange die Vertiefungen ihre Integrität beibehalten.

3. Mikroinjektion des CRISPR-Cas9-Cocktails in einen einzelligen Zebrafischembryo zur Erzeugung mütterlicher Crispants

HINWEIS: Weitere Ressourcen für die Mikroinjektion in Zebrafischembryonen finden Sie an anderer Stelle^24,26,27. Die Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung in die sich entwickelnde Blastodisc von einzelligen Embryonen kann die Wahrscheinlichkeit erhöhen, mütterliche Crispants zu erzeugen. Die Mischung kann auch bis zum 2-Zell-Stadium in den Dottersack injiziert werden. Mischungen, die in das Eigelb injiziert werden, hängen jedoch von oplasmatischem Strömen ab, um die Blastoscheibe zu erreichen, so dass CRISPR-Cas9, das in das Eigelb injiziert wird, die Schneideffizienz des CRISPR-Cas9²⁸ verringern könnte.

1. Stellen Sie am Nachmittag vor den Mikroinjektionen Wildtyp-Kreuzungen in Zebrafisch-Paarungsboxen auf. Halten Sie sowohl den männlichen als auch den weiblichen Fisch im selben Tank, aber trennen Sie sie mit einem Paarungskastenteiler oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz.
2. Nehmen Sie am Morgen des Experiments ein 2 mg/ml Aliquot Cas9-Protein und ein Aliquot aus dem Pool der sgRNAs heraus. In der RNase-freien Polypropylen-Mikrozentrifugenröhre, die das Cas9-Protein enthält, wird eine 5-μL-Injektionsmischung zusammengestellt, die den Pool von sgRNAs, 1 μL 0,5% ige Phenolrotlösung und nukleasefreies Wasser enthält. Ziel ist eine Endkonzentration von 400 ng/μL Cas9-Protein und 200 ng/μL der gepoolten sgRNAs in RNase-freiem Wasser oder ein 2:1-Verhältnis von Cas9-Protein zu sgRNAs im injizierten Embryo. Diese Injektionsmischung kann für den Morgen der Injektion auf Eis gelagert werden.
3. Nehmen Sie eine Injektionsplatte aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie mindestens 20 Minuten auf Raumtemperatur (RT) erwärmen.
4. Nachdem der Injektionscocktail zusammengesetzt ist, lassen Sie das Männchen und das Weibchen paaren, z. B. indem Sie den Trennwand der Steckbox entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen.
5. Nachdem die Fische gelegt haben, aber bevor die Embryonen gesammelt wurden, schneiden Sie die Spitze einer ungebrochenen Nadel mit einer neuen Rasierklinge oder einer feinen Pinzette ab, um eine Nadel zu schaffen, deren Bohrung klein genug ist, um Embryoschäden zu vermeiden, aber breit genug ist, damit sie nicht mit Injektionsmischung verstopft wird. Nachdem die Nadel geschnitten wurde, beladen Sie die Nadel mit der Injektionsmischung unter Verwendung einer Mikroladerpipettenspitze, die in das hintere Ende der Kapillare eingeführt wird (siehe Materialtabellen).
6. Nachdem die Nadel gefüllt ist, inkubieren Sie die Nadel für 5 min bei RT, um Cas9-sgRNA-Komplexe zusammenzusetzen.
7. Schalten Sie den Mikroinjektor ein und führen Sie die Nadel in den Mikromanipulator ein. Legen Sie einen Tropfen Mineralöl auf einen Mikrometerobjektträger und kalibrieren Sie die Nadel durch Einstellen des Einspritzdrucks, bis die Nadel einen 1 nL Bolus in das Mineralöl ausstößt.
   HINWEIS: Bei der Injektion in das Mineralöl hat ein 1-nL-Bolus einen Durchmesser von ca. 0,125 mm (oder einen Radius von 0,062 mm), gemessen mit dem Mikrometerobjektträger.
8. Um die Embryonen zu synchronisieren, sammeln Sie sie nach 10 min mit einem Kunststoffsieb und spülen Sie sie mit 1x E3-Medien (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM_MgSO4) in eine Petrischale und spülen Sie sie mit 1 l 1x E3 in eine Petrischale ein. Entfernen Sie 10-15 Embryonen und legen Sie sie in eine separate Petrischale, um sie als nicht injizierte Kontrollen zu behalten.
9. Übertragen Sie den Rest der sich entwickelnden Embryonen in die Vertiefungen der Injektionsplatte.
10. Injizieren Sie 1 nL Lösung (insgesamt 400 pg Cas9-Protein und 200 pg sgRNAs) in die sich entwickelnde Blastodisc eines einzelligen Embryos. Wenn die Spitze der Nadel verstopft, verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze zurückzubrechen und die Nadel neu zu kalibrieren, um einen 1-nL-Bolus auszustoßen. Stellen Sie sicher, dass alle Embryonen während der ersten 40 Minuten der Entwicklung nach der Befruchtung injiziert werden.
11. Nach Abschluss der Injektion geben Sie die injizierten Embryonen in eine markierte Petrischale zurück, die 1x E3-Medien enthält, und lassen Sie sie den ganzen Tag über entwickeln. Entfernen Sie alle Embryonen, die unbefruchtet sind oder sich nicht normal gemäß der Zebrafisch-Staging-Serie²⁹ entwickeln.

4. Screening auf somatische INDELs in injizierten F0-Embryonen

HINWEIS: Andere Methoden zur Identifizierung von INDELs, wie der T7-Endonuklease-I-Test oder die hochauflösende Schmelzanalyse, können verwendet werden, um festzustellen, ob die Embryonen somatische INDELs ³⁰ enthalten.

1. Am nächsten Tag nach den Injektionen entfernen Sie defekte und lysierte Embryonen aus der Petrischale und ersetzen Sie die 1x E3-Medien, um die Gesundheit des Embryos zu erhalten.
2. Nachdem Sie die Schale gereinigt haben, sammeln Sie sechs gesunde injizierte Embryonen und zwei Kontrollembryonen von der nicht injizierten Platte. Legen Sie jeden Embryo einzeln in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens und beschriften Sie die Oberseite der Röhrchen.
3. Um die genomische DNA einzelner Embryonen zu extrahieren, entfernen Sie die überschüssigen E3-Medien aus den Vertiefungen des Streifenrohrs und fügen Sie 100 μL 50 mM NaOH pro Vertiefung hinzu.
4. Inkubieren Sie die Embryonen bei 95 °C für 20 min. Dann kühlen Sie die Proben auf 4 °C ab, fügen Sie 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) hinzu und wirbeln Sie sie für 5 bis 10 s. Diese extrahierte DNA kann bei -20 °C für mindestens 6 Monate ohne signifikanten DNA-Abbau gelagert werden.
5. Entwerfen Sie einzigartige Screening-Primer für jede Guide-Site, um ein 100-110 bp DNA-Fragment zu amplifizieren, das die CRISPR-Cas9-Zielstelle enthält. Wenn möglich, platzieren Sie die Zielstelle in der Mitte des amplifizierten Fragments, um die Identifizierung größerer Deletionen zu ermöglichen.
6. Richten Sie für jede der vier Leitzielstellen acht 25-μL-PCR-Reaktionen unter Verwendung von 5 μL der vorbereiteten genomischen DNA eines einzelnen Embryos, eines PCR-Mixes und der leitfadenspezifischen Screening-Primer ein, um somatische Mutationen in der Zielstelle zu identifizieren (Tabelle 1).
7. Gießen Sie ein 2,5% Agarose/0,5 μg/ml Ethidiumbromid/FSME-Gel mit Kämmen, die etwa 0,625 cm breite Vertiefungen erzeugen. Dieser breite Kamm ermöglicht eine bessere Auflösung bei der Erkennung von Größenänderungen der genomischen Sequenz. Nachdem das Gel erstarrt ist, legen Sie es in eine Elektrophoresekammer, die FSME-Laufpuffer enthält.
8. Fügen Sie 5 μL 6x Ladenfarbstoff zum PCR-Produkt hinzu und laden Sie 25 μL dieser Mischung in das Gel. Stellen Sie sicher, dass die injizierten und die Kontrollproben in derselben Reihe des Gels ausgeführt werden. Nachdem alle Proben geladen sind, fügen Sie 5 μL Ethidiumbromid pro 1 L FSME-Laufpuffer zum positiven Ende der Gelbox hinzu.
9. Lassen Sie das Gel bei 120 V laufen, bis sich die DNA-Banden auflösen oder die DNA sich dem Ende der Spur genähert hat. Wenn das Cas9 INDELs an der Zielstelle erzeugt, wird typischerweise ein Abstrich in injizierten Proben beobachtet, nicht jedoch in den Kontrollen.
10. Wenn Abstriche an mindestens drei der vier Führungsstellen bei Embryonen beobachtet werden, denen vier Leit-RNAs injiziert wurden, wachsen die injizierten Geschwisterembryonen auf.
11. Wenn die injizierten Proben keine Abstriche in der erforderlichen Anzahl von Führungsstellen enthalten, entwerfen Sie neue Guide-RNAs, um diejenigen zu ersetzen, die nicht funktioniert haben, und erstellen Sie einen neuen Pool von Guide-RNAs, der die funktionierten und die neu entworfenen enthält. Injizieren und testen Sie den neuen Pool für somatische INDELs wie oben beschrieben.

5. Identifizierung maternaler Effekt-Phänotypen in maternalen Crispant-Embryonen

HINWEIS: Sobald die injizierten F0-Weibchen die Geschlechtsreife erreicht haben, haben ihre Keimbahnzellen das Potenzial, eine Mischung aus mütterlichen Crispant- und Wildtyp-Embryonen zu erzeugen. Obwohl diese Mischung interne Kontrollen für die Befruchtung und das Entwicklungstiming ermöglicht, ist es dennoch vorteilhaft, eine Wildtyp-Kreuzung als externe Kontrolle einzurichten, falls ein Gelege von F0-Weibchen nur mütterliche knusprige Embryonen enthält.

1. Am Nachmittag vor dem Experiment stellten die F0-injizierten Weibchen gegen Wildtyp-Männchen auf und kontrollierten Wildtyp-Kreuzungen in Standard-Zebrafisch-Paarungsboxen. Setzen Sie sowohl den männlichen als auch den weiblichen Fisch in dasselbe Becken, trennen Sie sie jedoch mit einem Paarungskastenteiler oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz.
2. Lassen Sie das Männchen und das Weibchen am Morgen des Experiments mit der Paarung beginnen, z. B. indem Sie den Trennkasten entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen.
3. Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten, indem Sie den Eiablageeinsatz in einen neuen Boden des Paarungsbeckens bewegen, der frisches Systemwasser enthält, und den Tank mit einem Etikett versehen, das das einzelne F0-Weibchen identifiziert. Nehmen Sie das alte Paarungsbecken und gießen Sie das Wasser durch ein Teesieb, um die Embryonen aus einem einzelnen 10-minütigen Gelege zu sammeln.
4. Nachdem die Embryonen eines einzigen 10-minütigen Geleges im Sieb gesammelt wurden, werden sie in eine Petrischale mit 1x E3-Medien überführt. Beschriften Sie die Petrischale mit dem Zeitpunkt der Entnahme und den Fischinformationen.
5. Beobachten Sie unter einem Seziermikroskop mit einer Durchlichtquelle die Entwicklung der Embryonen jede Stunde für die ersten 6-8 h und täglich für die nächsten 5 Tage.
6. Identifizierung potenzieller mütterlicher Crispant-Embryonen durch grobe morphologische Veränderungen in ihrer Entwicklung im Vergleich zu zeitangepassten Wildtyp-Kontrollen²⁹.
7. Bringen Sie die potenziellen mütterlichen Crispant-Embryonen in eine Petrischale, die 1x E3-Medien und Assay für den morphologischen Phänotyp bei 24 hpf und die Lebensfähigkeit (z. B. Schwimmblaseninflation) 5 Tage nach der Befruchtung enthält.

6. Sequenzierung von Allelen in mütterlichen Crispant-Haploiden

HINWEIS: Maternale Crispant-Haploide enthalten ein einzelnes Allel im Ziellocus, was die Identifizierung von INDELs im Zielgen mittels Sanger-Sequenzierung ermöglicht. Mütterliche Crispant-Haploide-Embryonen können auch mit Next-Generation-Sequenzierungsassays analysiert werden. Es wird erwartet, dass Embryonen, die einen mütterlichen Crispant-Phänotyp aufweisen, eine Läsion an mindestens einer der vier Zielstellen tragen (siehe Diskussion).

1. Am Nachmittag vor dem Experiment wurden Paarungspaare von F0-Weibchen aufgestellt, von denen bekannt ist, dass sie mütterliche Crispant-Embryonen produzieren, die mit Wildtyp-Männchen gekreuzt wurden. Halten Sie die Wildtyp-Männchen physisch von den Weibchen mit einem Paarungskastenteiler getrennt oder legen Sie das Weibchen in den Eiablageeinsatz.
2. Entfernen Sie am Morgen des Experiments die physische Trennwand oder legen Sie sowohl die Männchen als auch die Weibchen in den Eiablageeinsatz, um die Paarung einzuleiten. Bei den ersten Anzeichen einer Eiablage unterbrechen Sie die Brut, indem Sie das Männchen und das F0-Weibchen trennen. Bewahren Sie jedes getrennte F0-Weibchen in einzelnen Steckboxen auf.
3. Bereiten Sie UV-behandelte Spermienlösung unter Verwendung von Hoden eines Wildtyp-Männchens für jeweils 100 μL Hank-Lösung vor (Tabelle 2), die ausreicht, um extrudierte Eier von einem Weibchen zu befruchten, wie zuvor beschrieben³¹.
4. Extrudieren Sie manuell reife Eier von den vorausgewählten F0-Weibchen und führen Sie eine In-vitro-Fertilisation (IVF) mit den UV-behandelten Spermien^{durch 31}.
5. Lassen Sie nach der In-vitro-Fertilisation die haploiden Embryonen sich entwickeln, bis der mütterliche Crispant-Phänotyp beobachtet ist, und legen Sie diese Embryonen in eine andere Petrischale.
6. Sobald die mütterlichen haploiden Crispant-Embryonen identifiziert wurden, lassen Sie sie mindestens 6 Stunden nach der Befruchtung entwickeln.
7. Um die genomische DNA aus mindestens zehn mütterlichen haploiden Crispant-Embryonen zu extrahieren, legen Sie einen einzelnen haploiden Embryo in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens, entfernen Sie überschüssige E3-Medien aus der Vertiefung und fügen Sie 50 μL 50 mM NaOH hinzu.
8. Inkubieren Sie die Embryonen bei 95 °C für 20 min. Dann kühlen Sie die Proben auf 4 °C ab, fügen Sie 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) hinzu und wirbeln Sie für 5-10 s. Die extrahierte DNA kann bei -20 °C bis zu 6 Monate gelagert werden.
9. Um zu identifizieren, welche Leitstellen INDELs enthalten, entwerfen Sie Sequenzierungsprimer, um ein DNA-Fragment zu amplifizieren, das alle vier CRISPR-Cas9-Zielstellen enthält. Diese Sequenzierungsprimer ermöglichen die Identifizierung von INDELs, die sich über mehrere Führungsstellen erstrecken.
10. Richten Sie zwei 25-μL-PCR-Reaktionen pro Embryo unter Verwendung von 5 μL der vorbereiteten genomischen DNA und der Sequenzierungsprimer ein.
11. Nachdem die PCR abgeschlossen ist, reinigen und konzentrieren Sie die beiden Proben mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit (siehe Materialtabelle). Dann reichen Sie das DNA-Fragment an die Sanger-Sequenzierung mit den Vorwärts- und Rückwärtssequenzierungsprimern ein.
12. Nachdem das haploide mütterliche Crispant-Fragment sequenziert wurde, richten Sie es an die Wildtyp-Sequenz aus und identifizieren Sie INDELs an den Zielstellen mit einem Sequenz-Alignment-Programm.

Ergebnisse

Der in diesem Protokoll beschriebene experimentelle Ansatz ermöglicht die schnelle und ressourcenschonende Identifizierung mütterlicher Effektphänotypen (Abbildung 1).

Erzeugung von mütterlichen Knuspern:
Bei der Entwicklung der vier Guide-RNAs für ein einzelnes Kandidaten-Gen mit mütterlichem Effekt sollte besonders berücksichtigt werden, wo die Guide-RNAs an DNA binden. Im Allgemeinen sollten sie alle zusammen mit minimalen bis keinen ...

Diskussion

Das in diesem Manuskript vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und primäre molekulare Charakterisierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation anstelle der mehreren Generationen, die für vorwärts- und rückwärtsgenetische Techniken erforderlich sind. Derzeit ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene unbekannt. Dieser Mangel an Wissen ist zum Teil auf die zusätzliche Generation zurückzuführen, die erforderlich ist, um einen Phänotyp bei der Identifizierung von Genen m...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4)	Invirogen	15568025	For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes	Any Maker
10 mM dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013	Synthesis of gRNA
100 BP ladder	Any Maker		For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100% RNAse free ethanol	Any Maker
100ml Beaker	Any Maker		For IVF
5 M Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific	Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Synthesis of gRNA
70% Ethanol			Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID	FHC INC	27-30-1	for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds	Bulk Reef Supply	255	Fish supplies
CaCl2	MiliporeSigma	C7902
Cas9 Protein with NLS	PNABio	CP01
ChopChop			https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate	Thermo Fischer Scientific	13-748B	For IVF
Dissecting Forceps	Dumont	SS	For IVF
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14091-09	For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source)	Any Maker		For IVF
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014	Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x)	Any Maker		For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1	For PCR mix
Electropheresis Power Supply	Any Maker		For gel electrophoresis
Ensemble			https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector	Thermo Fischer Scientific	E5242956003	for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	Any Maker
FemtoJet 4i	Eppendorf	5252000021	for Microinjection
Fish Net	Any Maker		Fish supplies
Frozen Brine Shrimp	Brine Shrimp Direct		Fish supplies
General All Purpose Agarose	Any Maker		For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)		TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves	Any Maker
Ice Bucket	Any Maker
Instant Ocean salt	Any Maker		Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL	Thermo Fischer Scientific	15-585-011
KCl	MiliporeSigma	P5405
KH2PO4	MiliporeSigma	7778-77-0
Kimwipes	Thermo Fischer Scientific	06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354	Synthesis of gRNA
Methylene Blue	Thermo Fischer Scientific	AC414240250	For E3
MgCl2	MiliporeSigma	7791-18-6	For PCR mix
MgSO2·7H2O	MiliporeSigma	M2773
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds	for Microinjection
Micromanipulator	Any Maker		for Microinjection
Micropipeters	Any Maker
Micropipette Puller	Sutter	P-87	for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes)	Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes)	Any Maker
Microwave	Any Maker
Mineral Oil	MiliporeSigma	m5904-5ml	for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D)	Any Maker		FDA approved
Na2HPO4	MiliporeSigma	S3264
NaCl	MiliporeSigma	S5886
NaHC03	MiliporeSigma	S5761
Nanodrop	Any Maker
NaOH	MiliporeSigma	567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12450	Synthesis of gRNA
nuclease-free water	Any Maker
Paper Towel	Any Maker
Pastro Pipettes	Any Maker
PCR Strip Tubes	Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter	Any Maker
Phenol Red solution	MiliporeSigma	P0290	for Microinjection
Plastic Pestals	VWR	47747-358	For IVF
Plastic Spoon	Any Maker		For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs	Brine Shrimp Direct		Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye		found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit	For gel electrophoresis
RNAse AWAY	Thermo Fischer Scientific	21-402-178
Scale	Any Maker
Sharpie	Any Maker
Spatula	Any Maker
Sterile H2O	Any Maker		For PCR mix
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203	Synthesis of gRNA
Tape	Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x	Any Maker		For gel electrophoresis
Tea Stainer	Amazon	IMU-71133W	Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2	Thermo Fischer Scientific	B2-12	For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems	Thermo Fischer Scientific	09-528-110B	For gel electrophoresis
Thermocycler	Any Maker
Thermocycler	Any Maker
Transilluminator	Any Maker
UV lamp	UVP	Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201)	For IVF
UV safety glasses	Any Maker		For IVF
Wash Bottle	Thermo Fischer Scientific	S39015	Fish supplies
Zebrafish mating boxes	Aqua Schwarz	SpawningBox1	Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes	Fisher Scientific	05-402-11
10 Molar dNTPs	Thermo Fischer Scientific	18427013
100 BP ladder	Thermo Fischer Scientific	15628019
100% RNAse free ethanol	any maker
5m Ammonium Accetate	Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol			70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box	Fisher Scientific		0.625 mm
Agarose	any maker
CaCl2	Sigma	10043-52-4
CaCl2, dihydrate	Sigma	10035-04-8	E3 Medium
Capillary Tubing	Cole-Parmer	UX-03010-68	for injection needles
Cas9 Protein	Thermo Fischer Scientific	A36496
ChopChop	https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer	any maker
Dissecting Forcepts	any maker
Dissecting Microscope	any maker
Dissecting Scissors	any maker
DNA Clean & Concentrator -5	Zymo Research	D4014
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fischer Scientific	R0611
EconoTaq DNA Polymerase	Lucigen	30032-1
Ensemble	https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips	Fischer Scientific	10289651	20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free)	any maker
Ethidium Bromide	Thermo Fischer Scientific	15585011
Fish Net	any maker		fine mesh
Frozen Brine Shrimp	LiveAquaria	CD-12018	fish food
Gel Comb (0.625mm)	any maker
Gel Electropheresis System	any maker
Gene-Specific oligonucleotide	Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle	Grainger	21TZ99	https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes	any maker
Gloves	any maker
Hank's Final Working Solution			Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix			combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution			https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1			8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2			0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4			0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5			1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6			0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl	Sigma	7647-01-0
Ice Bucket	any maker
Instant Ocean salt	any maker		for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script	Thermo Fischer Scientific	AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water	Fisher Scientific	10-977-023
KCl	Sigma	7447-40-7	E3 Medium
KH2PO4	Sigma	7778-77-0
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1354
methylene blue	Fisher Scientific	AC414240250	E3 Medium
MgSO2-7H2O	Sigma	M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold	World Precision Instruments	Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips	any maker		need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips	any maker
Micropippetter (100-1000) with tips	any maker
Microplastic slide
Microwave	any maker
MiliQ Water	any maker
mineral oil	sigma-aldrich	m5904-5ml
Na2HPO4	Sigma
NaCl	Sigma	S9888
NaHC02	Sigma	223441
Nanodrop
NaOH	Sigma	567530
Narrow Spatula	any maker
Needle Puller	Sutter	P-97
Paper Towel	any maker
Pastro Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20A
PCR primer flanking guide site	Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site	Integrated DNA Technologies (IDT)		Standard desalted
PCR Strip Tubes	Thermo Fischer Scientific	AB0771W
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875714	10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red	Fisher Science	S25464	https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips	any maker		10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals	Fisher Scientific	12-141-364
Plastic Spoon	any maker
Primer Guide Site	Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade	Uline	H-595B
RNA gel Loading Dye	in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away	Fisher	21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes	Thermo Fischer Scientific	AM12400	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water	Fisher Scientific	10-977-023
Scale	any maker
Sharpie	any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested)	Sigma	S5761	fish water
Sodium Bromide Solotion	Sigma	E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O	any brand
T4 DNA Polymerase	NEB	M0203S	https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape	any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X	Thermo Fischer Scientific	B52	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer	amazon	IMU-71133W	avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette	Uline	S-24320
Transilluminator
Tricaine	fisher scientific	NC0872873
Tris HCl 7.5	Thermo Fischer Scientific	15567027
Universal Primer	Integrated DNA Technologies (IDT)		AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC
UV lamp	UVP
UV safety glasses	any maker
Wash Bottle	fisher scientific	S39015
Zebrafish mating boxes	any maker
PCR Buffer Recipe	Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes