استخدام تلطيخ أليزارين الأحمر للكشف عن فقدان العظام المستحث كيميائيا في يرقات الزرد

Summary

هنا ، استخدمنا تلطيخ أليزارين الأحمر لإظهار أن التعرض لأسيتات الرصاص يسبب تغيرا في كتلة العظام في يرقات الزرد. يمكن تكييف طريقة التلوين هذه للتحقيق في فقدان العظام في فقدان يرقات الزرد الناجم عن المواد السامة الخطرة الأخرى.

Abstract

يمكن أن يؤدي فقدان العظام المستحث كيميائيا بسبب التعرض للرصاص (Pb) إلى مجموعة من الآثار الضارة على كل من أنظمة الهيكل العظمي البشري والحيواني. ومع ذلك ، فإن الآثار والآليات المحددة في الزرد لا تزال غير واضحة. يحتوي Alizarin red على تقارب كبير لأيونات الكالسيوم ويمكن أن يساعد في تصور العظام وتوضيح الكتلة المعدنية للهيكل العظمي. في هذه الدراسة ، كنا نهدف إلى الكشف عن فقدان العظام الناجم عن أسيتات الرصاص (PbAc) في يرقات الزرد باستخدام تلطيخ أليزارين الأحمر. وعولجت أجنة أسماك الزرد بسلسلة من تركيزات PbAc (0، 5، 10، 20 ملغم/لتر) بين 2 و120 ساعة بعد الإخصاب. تم إجراء تلطيخ الهيكل العظمي بالكامل على اليرقات في 9 أيام بعد الإخصاب ، وتم تحديد إجمالي المساحة الملطخة باستخدام برنامج ImageJ. أشارت النتائج إلى أن الأنسجة المعدنية كانت ملطخة باللون الأحمر ، وانخفضت المنطقة الملطخة بشكل ملحوظ في مجموعة التعرض ل PbAc ، مع تغير يعتمد على الجرعة في تمعدن العظام. تقدم هذه الورقة بروتوكول تلطيخ للتحقيق في التغيرات الهيكلية في عيوب العظام التي يسببها PbAc. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة في يرقات الزرد للكشف عن فقدان العظام الناجم عن المواد الكيميائية الأخرى.

Introduction

أكدت الدراسات الحديثة أن هشاشة العظام بسبب الجلوكوكورتيكويد ومثبطات الأروماتاز والاستهلاك المفرط للكحول أمر شائع ^1,2. الرصاص (Pb) هو معدن سام موجود في النباتات والتربة والبيئات المائية³. على الرغم من أن الآثار الضارة للرصاص على جسم الإنسان قد جذبت الكثير من الاهتمام ، إلا أن تأثيره الذي لا رجعة فيه على العظام يحتاج إلى مزيد من التحقيق. يسبب التسمم بالرصاص مجموعة متنوعة من التغيرات المرضية في كل من الهيكل العظمي النامي والبالغ ، مما يؤثر على أنشطة الحياة الطبيعية. وجدت الدراسات ارتباطا بين التعرض المزمن ل Pb وتلف العظام⁴ ، بما في ذلك ضعف هياكل العظام ^5,6 ، وانخفاض كثافة المعادن في العظام ، وحتى زيادة خطر الإصابة بهشاشة العظام⁷.

الأنسجة المعدنية لها أهمية كبيرة لقوة العظام⁸ ، وترسب مصفوفة تمعدن العظام هو مؤشر حاسم لتكوين العظام⁹. يحتوي Alizarin red على تقارب كبير لأيونات الكالسيوم ، وتلوين Alizarin الأحمر هو إجراء قياسي لتقييم تكوين العظام¹⁰. وفقا لهذه الطريقة ، تكون الأنسجة المعدنية ملطخة باللون الأحمر ، بينما تظل جميع الأنسجة الأخرى شفافة. ثم يتم تحديد المنطقة الملطخة عن طريق تحليل الصور الرقمية¹¹.

الزرد هو كائن نموذجي مهم يستخدم على نطاق واسع في اكتشاف الأدوية ونماذج الأمراض. أظهرت الدراسات الجينية في الزرد والبشر أوجه تشابه في الآليات الأساسية لتكوين الهيكل العظمي على المستوى^{الجزيئي 12}. علاوة على ذلك ، فإن فحص الأدوية أو الجزيئات الحيوية عالي الإنتاجية أكثر جدوى في براثن الزرد الكبيرة من نماذج الفئران ، مما يسهل الدراسة الميكانيكية للجزيئات proosteogenic أو السامة للعظام¹³. كثيرا ما يستخدم التلوين التفاضلي للهيكل العظمي في توتو¹⁰ في دراسة خلل التنسج الهيكلي في الفقاريات الصغيرة والأجنة الثديية. تم إجراء تلطيخ أحمر Alizarin للتحقيق في السمية التنموية للعظام للمواد الكيميائية في يرقات الزرد. هنا ، استخدمنا الرصاص كمثال لوصف بروتوكول للكشف عن عيوب العظام التي تسببها أسيتات الرصاص في يرقات الزرد.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الموضحة هنا والموافقة عليها من قبل معهد رعاية الحيوان التابع للجنة الأخلاقيات بجامعة سوشو.

1. تربية الأسماك وجمع الأجنة ¹⁴

1. إطعام الأسماك ثلاث مرات كل يوم ؛ تأكد من الحفاظ على سمك الزرد عند 28.5 ± 0.5 درجة مئوية مع دورة ضوء / مظلمة 14:10 ساعة.
2. فصل ذكور وإناث الأسماك البالغة بواسطة ألواح عزل في أحواض التفريخ بنسبة 2: 1 من الذكور إلى الإناث في المساء.
3. في صباح اليوم التالي ، قم بإزالة ألواح العزل في الساعة 9:00 صباحا وجمع الأجنة بعد 2 ساعة.
4. ضع الأجنة في حاضنة كيميائية حيوية يتم الحفاظ عليها عند 28.5 درجة مئوية قبل التجربة.

2. التعرض الكيميائي

1. تحضير المرق الأم: وزن ثلاثي هيدرات خلات الرصاص (5 غرام) ، ويذوب في ماء عالي النقاء (50 مل) مع التحريك.
   تنبيه: PbAc سام. ارتد أقنعة الغبار المناسبة والملابس الواقية والقفازات. إجراء التجربة تحت غطاء الدخان.
2. اختيار أجنة الزرد وتوزيعها عشوائيا في ألواح نظيفة من 6 آبار (30 جنينا لكل بئر في 3 مل من مياه تربية الزرد ؛ انظر الجدول 1 لتكوينها). علاج الأجنة باستخدام PbAc (0 ، 5 ، 10 ، 20 مجم / لتر) من 2 إلى 120 ساعة بعد الإخصاب (HPF).
   ملاحظة: اختيرت تركيزات PbAc وفقا لتجارب تحديد نطاق الجرعة. أظهرت النتائج أن LC₅₀ من أسيتات الرصاص على أجنة الزرد كان 41.044 ملغم / لتر عند 120 hpf. وبالتالي ، تم تعيين أعلى تركيز إلى نصف LC₅₀ وسلسلة من الحلول التي أعدها التخفيف 2 أضعاف.
3. إطعام اليرقات مرتين في اليوم من 5 أيام بعد الإخصاب (dpf). الحفاظ على أجنة الزرد عند 28.5 ± 0.5 درجة مئوية مع دورة ضوئية / مظلمة 14:10 ساعة.
4. قم بتحديث الوسط الخالي من الرصاص (مياه تربية الزرد) كل 24 ساعة حتى 9 dpf.
   ملاحظة: عند الانتهاء من التجارب ، تم سكب جميع المحاليل المحتوية على الرصاص في خزان سائل مخصص ومعالجتها بواسطة مركز إدارة التجارب.

3. اليزارين تلطيخ أحمر

ملاحظة: ارتد أقنعة غبار مناسبة وملابس واقية وقفازات أثناء عملية التلوين بأكملها. يتم عرض تركيبات جميع الحلول في الجدول 1.

1. خطوات تلطيخ محددة
   ملاحظة: تم تنفيذ عملية الصباغة في لوحة 24 بئر في درجة حرارة الغرفة. بعد إضافة كل محلول ، ضع لوحة 24 بئرا على طاولة الاهتزاز الموضوعة بسرعة منخفضة.
   1. قم بإزالة 10 يرقات من أسماك الزرد بشكل عشوائي من كل مجموعة بمعدل 9 dpf وثبت الأسماك في 1 مل من 2٪ بارافورمالدهيد / 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات لمدة 2 ساعة.
   2. صب المحلول واغسل يرقات الزرد ب 100 mM Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) / 10 mM MgCl₂ لمدة 10 دقائق.
   3. صب المحلول واحتضان اليرقات في المحاليل التالية لمدة 5 دقائق لإزالة البقع منها: محلول الإيثانول اللامائي (EtOH) (80٪ EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl₂ ، 50٪ EtOH / 100 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5) ، و 25٪ EtOH / 100mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5).
   4. صب المحلول ، وأزل الصباغ عن طريق التبييض بمحلول يتكون من 3٪ H 2 O₂و 0.5٪ KOH ، ولاحظ مرة واحدة كل 10 دقائق حتى تتم إزالة الصبغة تماما.
   5. اشطف يرقات الزرد عدة مرات باستخدام 25٪ جلسرين / 0.1٪ KOH لمدة 10 دقائق لكل منهما حتى لا تكون هناك فقاعات.
      ملاحظة: من المهم تجنب الفقاعات. خلاف ذلك ، ستظهر الفقاعات في جسم الزرد كمجال رؤية أسود تحت المجهر ، مما سيؤثر على الملاحظات والتحليل الكمي.
   6. وصمة عار اليرقات عن طريق نقع في 1 مل من 0.01 ٪ alizarin لمدة 50 دقيقة.
   7. صب المحلول وأضف 1 مل من 50٪ جلسرين / 0.1٪ KOH لمدة 10 دقائق لمسح الخلفية. قم بتخزين الأسماك في 50٪ جلسرين طازج / 0.1٪ KOH للمراقبة اللاحقة.

4. الحصول على الصور

1. انقل يرقة واحدة على الشريحة الزجاجية في كل مرة ، مع إبقاء اليرقة في منتصف قطرة السائل.
2. مراقبة اليرقات تحت المجهر ستيريو.
3. قم بتشغيل الكاميرا وافتح البرنامج (انظر جدول المواد) واحتفظ بالإعدادات الافتراضية.
4. انقر فوق AE ، واختر وقت التعرض المناسب (60 مللي ثانية في هذه التجربة) للحصول على أفضل صورة.
5. التقط جميع الصور تحت نفس الإعدادات. احفظ الصور بتنسيق .tif لتحليلها لاحقا.

5. تحليل الصور

ملاحظة: راجع الملف التكميلي للحصول على مثال مع مجموعة من الرسوم البيانية النموذجية لتحليل الصور.

1. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز ImageJ وقم بتحليل الصور المحفوظة في الخطوة 4.5.
   1. انقر فوق ملف | افتح لفتح الصور المحفوظة في الخطوة 4.5.
   2. انقر على الصورة | اكتب ، حدد 8 بت.
   3. انقر فوق تحرير | عكس.
   4. انقر فوق تحليل | معايرة ، حدد OD غير معاير في الواجهة المنبثقة ، تحقق من المعايرة العامة في الجزء السفلي الأيسر من الواجهة السفلية ، وانقر فوق موافق.
   5. انقر فوق تحليل | ضبط الميزان | انقر لإزالة المقياس في الواجهة المنبثقة ، وتحقق من Global أدناه ، وانقر فوق موافق.
   6. انقر فوق تحليل | قم بتعيين القياسات ، وحدد منطقة العنصر في الواجهة المنبثقة ، وحدد الحد إلى الحد أدناه (لقياس النطاق المحدد فقط) ، وانقر فوق موافق.
   7. انقر على الصورة | ضبط | Threshold ، حرك شريط التمرير في منتصف الواجهة المنبثقة لتحديد العتبة المناسبة (تغيير الحد لكل صورة) بحيث يتم تحديد جميع الأهداف المراد اختبارها في صورة واحدة ، وانقر فوق تعيين.
   8. انقر فوق تحليل | التدبير. سجل تواريخ كل مجموعة.
2. استخدم ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey للمقارنة المتعددة لتحليل الاختلافات ، واضبط مستوى الأهمية على p < 0.001 (***).

النتائج

تلطيخ Alizarin الأحمر هو طريقة حساسة ومحددة لقياس التغيرات في تمعدن العظام في يرقات الزرد. في هذه الدراسة ، لاحظنا أن PbAc كان له آثار ضارة على يرقات الزرد ، بما في ذلك الموت والتشوه وانخفاض معدل ضربات القلب وتقصير طول الجسم. علاوة على ذلك ، تم تقييم مناطق الهيكل العظمي المعدني ليرقات الزرد لفحص ?...

Discussion

الزرد هو نموذج مناسب لدراسة أمراض التمثيل الغذائي للعظام. بالمقارنة مع نماذج القوارض ، فإن نماذج الزرد سريعة نسبيا في التأسيس ، وقياس شدة المرض أسهل. في يرقات الزرد من النوع البري ، يحدث تمعدن الهيكل العظمي للرأس عند 5 dpf والهيكل العظمي المحوري عند 7 dpf¹⁵. وبالتالي ، تم تطوير عظام...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal