Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Hier haben wir die Alizarin-Rot-Färbung verwendet, um zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Bleiacetat eine Veränderung der Knochenmasse bei Zebrafischlarven verursacht. Diese Färbemethode kann an die Untersuchung des Knochenverlustes bei Zebrafischlarven angepasst werden, der durch andere gefährliche Giftstoffe induziert wird.

Zusammenfassung

Chemisch induzierter Knochenverlust aufgrund von Bleiexposition (Pb) könnte eine Reihe nachteiliger Auswirkungen auf das Skelettsystem von Mensch und Tier haben. Die spezifischen Effekte und Mechanismen im Zebrafisch sind jedoch noch unklar. Alizarinrot hat eine hohe Affinität zu Kalziumionen und kann helfen, den Knochen sichtbar zu machen und die skelettale Mineralmasse zu veranschaulichen. In dieser Studie zielten wir darauf ab, Bleiacetat (PbAc)-induzierten Knochenverlust in Zebrafischlarven durch Alizarin-Rotfärbung nachzuweisen. Zebrafischembryonen wurden mit einer Reihe von PbAc-Konzentrationen (0, 5, 10, 20 mg/L) zwischen 2 und 120 h nach der Befruchtung behandelt. Die gesamte Skelettfärbung wurde 9 Tage nach der Befruchtung an Larven durchgeführt, und die gesamte gefärbte Fläche wurde mit der ImageJ-Software quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die mineralisierten Gewebe rot gefärbt waren und der gefärbte Bereich in der PbAc-Expositions-Gruppe signifikant abnahm, mit einer dosisabhängigen Veränderung der Knochenmineralisierung. Dieser Artikel stellt ein Färbeprotokoll zur Untersuchung von Skelettveränderungen bei PbAc-induzierten Knochendefekten vor. Die Methode kann auch in Zebrafischlarven zum Nachweis von Knochenschwund verwendet werden, der durch andere Chemikalien induziert wird.

Einleitung

Neuere Studien haben bestätigt, dass Osteoporose aufgrund von Glukokortikoiden, Aromatasehemmern und übermäßigem Alkoholkonsum häufig ist ^1,2. Blei (Pb) ist ein giftiges Metall, das in Pflanzen, Böden und Gewässern vorkommt³. Obwohl die nachteiligen Auswirkungen von Pb auf den menschlichen Körper viel Aufmerksamkeit erregt haben, muss seine irreversible Wirkung auf den Knochen weiter untersucht werden. Bleiintoxikation verursacht eine Vielzahl von pathologischen Veränderungen sowohl im sich entwickelnden als auch im erwachsenen Skelett, die normale Lebensaktivitäten beeinträchtigen. Studien haben einen Zusammenhang zwischen chronischer Pb-Exposition und Knochenschäden gefunden⁴, einschließlich beeinträchtigter Knochenstrukturen^5,6, reduzierter Knochenmineraldichte und sogar erhöhtem Osteoporoserisiko⁷.

Mineralisiertes Gewebe ist von großer Bedeutung für die Knochenstärke⁸, und die Ablagerung der Knochenmineralisierungsmatrix ist ein kritischer Index der Knochenbildung⁹. Alizarinrot hat eine hohe Affinität zu Kalziumionen, und die Alizarinrot-Färbung ist ein Standardverfahren zur Beurteilung der Knochenbildung¹⁰. Nach dieser Methode wird mineralisiertes Gewebe rot gefärbt, während alles andere Gewebe transparent bleibt. Die gefärbte Fläche wird dann durch digitale Bildanalyse¹¹ quantifiziert.

Zebrafische sind ein wichtiger Modellorganismus, der in der Arzneimittelforschung und in Krankheitsmodellen weit verbreitet ist. Genetische Studien an Zebrafischen und Menschen haben Ähnlichkeiten in den zugrunde liegenden Mechanismen der Skelettmorphogenese auf molekularer Ebene gezeigt¹². Darüber hinaus ist ein Hochdurchsatz-Wirkstoff- oder Biomolekül-Screening in großen Gelege von Zebrafischen besser durchführbar als in Mausmodellen, was die mechanistische Untersuchung proosteogener oder osteotoxischer Moleküle erleichtert¹³. Die differentielle Färbung des Skeletts in toto¹⁰ wird häufig bei der Untersuchung von Skelettdysplasie bei kleinen Wirbeltieren und Säugetierföten verwendet. Die Alizarin-Rotfärbung wurde durchgeführt, um die Knochenentwicklungstoxizität von Chemikalien in Zebrafischlarven zu untersuchen. Hier haben wir Blei als Beispiel verwendet, um ein Protokoll zum Nachweis von Bleiacetat-induzierten Knochendefekten in Zebrafischlarven zu beschreiben.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden vom Animal Care Institute der Ethikkommission der Soochow University überprüft und genehmigt.

1. Fischzucht und Embryonenentnahme ¹⁴

1. Füttern Sie Fische dreimal täglich; Stellen Sie sicher, dass die Zebrafische bei 28,5 ± 0,5 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14:10 h gehalten werden.
2. Trennen Sie die männlichen und weiblichen erwachsenen Fische abends durch Isolationsbretter in Laichbecken im Verhältnis 2:1 von Männchen zu Weibchen.
3. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Isolierplatten um 9:00 Uhr und sammeln die Embryonen 2 h später.
4. Die Embryonen werden vor dem Experiment in einen biochemischen Inkubator gegeben, der bei 28,5 °C gehalten wird.

2. Chemische Exposition

1. Bereiten Sie die Mutterbrühe vor: Bleiacetattrihydrat (5 g) wiegen und unter Rühren in Reinstwasser (50 ml) auflösen.
   ACHTUNG: PbAc ist giftig. Tragen Sie geeignete Staubmasken, Schutzkleidung und Handschuhe. Führen Sie das Experiment unter einem Abzug durch.
2. Auswahl und zufällige Verteilung der Zebrafischembryonen in saubere 6-Well-Platten (30 Embryonen pro Vertiefung in 3 ml Zebrafisch-Brutwasser; siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung). Behandeln Sie die Embryonen mit PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) von 2 bis 120 h nach der Befruchtung (hpf).
   ANMERKUNG: Die Konzentrationen von PbAc wurden entsprechend den Dosisbereichsfindungsexperimenten ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass die LC₅₀ von Bleiacetat auf Zebrafischembryonen 41,044 mg / L bei 120 hpf betrug. Daher wurde die höchste Konzentration auf die Hälfte des LC₅₀ eingestellt und eine Reihe von Lösungen durch 2-fache Verdünnung hergestellt.
3. Füttern Sie die Larven zweimal täglich ab 5 Tagen nach der Befruchtung (dpf). Halten Sie die Zebrafischembryonen bei 28,5 ± 0,5 °C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 14:10 Uhr.
4. Erfrischen Sie das bleifreie Medium (Zebrafisch-Brutwasser) alle 24 h bis 9 dpf.
   HINWEIS: Nach Abschluss der Experimente wurden alle bleihaltigen Lösungen in einen dafür vorgesehenen Flüssigkeitstank gegossen und vom Experimentmanagementzentrum behandelt.

3. Alizarin-Rotfärbung

HINWEIS: Tragen Sie während des gesamten Färbevorgangs geeignete Staubmasken, Schutzkleidung und Handschuhe. Die Zusammensetzungen aller Lösungen sind in Tabelle 1 dargestellt.

1. Spezifische Färbeschritte
   HINWEIS: Der Färbeprozess wurde in einer 24-Well-Platte bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem jede Lösung hinzugefügt wurde, stellen Sie die 24-Well-Platte auf den Schütteltisch, der bei niedriger Geschwindigkeit eingestellt ist.
   1. Entfernen Sie 10 Zebrafischlarven zufällig aus jeder Gruppe bei 9 dpf und fixieren Sie den Fisch in 1 ml 2% Paraformaldehyd / 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 2 h.
   2. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Zebrafischlarven mit 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM_MgCl2 für 10 min.
   3. Dekantieren Sie die Lösung und inkubieren Sie die Larven in den folgenden Lösungen für jeweils 5 min zur Entfärbung: wasserfreie Ethanollösung (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl₂, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) und 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
   4. Dekantieren Sie die Lösung, entfernen Sie das Pigment durch Bleichen mit einer Lösung aus 3%_H2O2und 0,5% KOH und beobachten Sie einmal alle 10 Minuten, bis das Pigment vollständig entfernt ist.
   5. Spülen Sie die Zebrafischlarven mehrmals mit 25% Glycerin/0,1% KOH für jeweils 10 min ab, bis keine Blasen mehr vorhanden sind.
      HINWEIS: Es ist wichtig, Blasen zu vermeiden; Andernfalls erscheinen die Blasen im Zebrafischkörper als schwarzes Sichtfeld unter dem Mikroskop, was die Beobachtungen und die quantitative Analyse beeinflusst.
   6. Färben Sie die Larven, indem Sie 1 ml 0,01% Alizarin für 50 min einweichen.
   7. Dekantieren Sie die Lösung und fügen Sie 1 ml 50% Glycerin / 0,1% KOH für 10 min hinzu, um den Hintergrund zu löschen. Lagern Sie die Fische in frischem 50% Glycerin/0,1% KOH für die anschließende Beobachtung.

4. Bildaufnahme

1. Übertragen Sie jedes Mal eine Larve auf den Glasobjektträger, wobei die Larve in der Mitte des Flüssigkeitstropfens bleibt.
2. Beobachten Sie die Larven unter einem Stereomikroskop.
3. Schalten Sie die Kamera ein, öffnen Sie die Software (siehe Materialtabelle) und behalten Sie die Standardeinstellungen bei.
4. Klicken Sie auf AE und wählen Sie eine geeignete Belichtungszeit (60 ms in diesem Experiment), um das beste Bild zu erhalten.
5. Nehmen Sie alle Bilder unter den gleichen Einstellungen auf. Speichern Sie die Bilder für .tif spätere Analyse im Format.

5. Bildanalyse

HINWEIS: In der Zusatzdatei finden Sie ein Beispiel mit einer Reihe von Beispieldiagrammen für die Bildanalyse.

1. Doppelklicken Sie auf das ImageJ-Symbol und analysieren Sie die in Schritt 4.5 gespeicherten Bilder.
   1. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie, um die in Schritt 4.5 gespeicherten Bilder zu öffnen.
   2. Klicken Sie auf Bild | Geben Sie ein, wählen Sie 8-Bit.
   3. Klicken Sie auf Bearbeiten | Umkehren.
   4. Klicken Sie auf Analysieren | Kalibrieren, wählen Sie Unkalibrierte OD in der Popup-Schnittstelle, aktivieren Sie Globale Kalibrierung unten links auf der unteren Benutzeroberfläche und klicken Sie auf OK.
   5. Klicken Sie auf Analysieren | Maßstab einstellen | Klicken Sie, um die Skalierung in der Popup-Oberfläche zu entfernen, aktivieren Sie Global unten und klicken Sie auf OK.
   6. Klicken Sie auf Analysieren | Legen Sie Messungen fest, wählen Sie den Elementbereich in der Popup-Oberfläche aus, aktivieren Sie unten den Schwellenwert begrenzen (um nur den ausgewählten Bereich zu messen) und klicken Sie auf OK.
   7. Klicken Sie auf Bild | Anpassen| Schwellenwert, schieben Sie den Schieberegler in die Mitte der Popup-Oberfläche, um den entsprechenden Schwellenwert auszuwählen (ändern Sie den Schwellenwert für jedes Bild), so dass alle in einem Bild zu testenden Ziele ausgewählt sind, und klicken Sie auf Festlegen.
   8. Klicken Sie auf Analysieren | Messen. Notieren Sie die Daten jeder Gruppe.
2. Verwenden Sie die Einweg-ANOVA gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest, um die Unterschiede zu analysieren, und legen Sie das Signifikanzniveau auf p < 0,001 (***) fest.

Ergebnisse

Die Alizarin-Rotfärbung ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Veränderungen der Knochenmineralisierung in Zebrafischlarven. In dieser Studie haben wir beobachtet, dass PbAc nachteilige Auswirkungen auf Zebrafischlarven hatte, einschließlich Tod, Fehlbildung, verminderter Herzfrequenz und Körperlängenverkürzung. Darüber hinaus wurden die mineralischen Skelettbereiche von Zebrafischlarven ausgewertet, um den PbAc-induzierten Knochenverlust zu untersuchen. Bei 9 dpf (Abbil...

Diskussion

Der Zebrafisch ist ein geeignetes Modell zur Untersuchung von Knochenstoffwechselerkrankungen. Im Vergleich zu Nagetiermodellen sind Zebrafischmodelle relativ schnell zu etablieren, und die Messung der Schwere der Erkrankung ist einfacher. Bei Wildtyp-Zebrafischlarven erfolgt die Mineralisierung des Kopfskeletts bei 5 dpf und des axialen Skeletts bei 7 dpf¹⁵. Daher sind Schädelknochen wie PS, OP, CB und NC bei 9 dpf gut entwickelt. Nachdem die Larven vollständig entfärbt und gebleicht waren, wu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal