알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 화학적으로 유발된 뼈 손실 검출

요약

여기에서는 아세트산 납 노출이 제브라 피쉬 유충의 뼈 질량 변화를 유발한다는 것을 보여주기 위해 알리자린 레드 염색을 사용했습니다. 이 염색 방법은 다른 위험한 독성 물질에 의해 유도 된 제브라 피쉬 유충 손실의 뼈 손실 조사에 적용될 수 있습니다.

초록

납(Pb) 노출로 인한 화학적으로 유발된 뼈 손실은 인간과 동물의 골격계 모두에 일련의 부정적인 영향을 유발할 수 있습니다. 그러나 제브라 피쉬의 구체적인 효과와 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. Alizarin red는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 뼈를 시각화하고 골격 미네랄 덩어리를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서는 알리자린 레드 염색을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 아세트산납(PbAc)으로 인한 뼈 손실을 감지하는 것을 목표로 했습니다. 제브라피쉬 배아는 수정 후 2시간에서 120시간 사이에 일련의 PbAc 농도(0, 5, 10, 20mg/L)로 처리되었습니다. 수정 후 9일에 유충에 대해 전체 마운트 골격 염색을 수행하고, 전체 염색 면적을 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다. 결과는 광물화된 조직이 빨간색으로 염색되었고, PbAc 노출 그룹에서 염색된 영역이 유의하게 감소했으며, 뼈 광물화의 용량 의존적 변화가 있음을 나타냈다. 이 논문은 PbAc 유발 뼈 결함의 골격 변화를 조사하기 위한 염색 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 다른 화학 물질에 의해 유도 된 뼈 손실을 감지하기 위해 제브라 피쉬 유충에서도 사용할 수 있습니다.

서문

최근 연구에 따르면 글루코 코르티코이드, 아로마 타제 억제제 및 과도한 알코올 섭취로 인한 골다공증이 흔하다는 것이 확인되었습니다 ^1,2. 납 (Pb)은 식물, 토양 및 수생 환경에서 발견되는 독성 금속입니다³. 인체에 대한 Pb의 악영향이 많은 관심을 끌었지만 뼈에 대한 돌이킬 수없는 영향은 더 조사해야합니다. 납 중독은 발달 중과 성인 골격 모두에서 다양한 병리학 적 변화를 일으켜 정상적인 생활 활동에 영향을 미칩니다. 연구에 따르면 만성 Pb 노출과 뼈 손상⁴ 사이의 연관성이 발견되었으며, 여기에는 뼈 구조 손상^5,6, 골밀도 감소, 골다공증 위험 증가⁷가 포함됩니다.

광물화된 조직은 뼈 강도⁸에 매우 중요하며, 골 광물화 매트릭스 침착은^{골 형성의} 중요한 지표입니다9. 알리자린 레드는 칼슘 이온에 대한 친화력이 높으며 알리자린 레드 염색은 골 형성을 평가하기위한 표준 절차입니다¹⁰. 이 방법에 따르면, 광물 화 된 조직은 빨간색으로 염색되고 다른 모든 조직은 투명하게 유지됩니다. 염색 된 영역은 디지털 이미지 분석⁽¹¹)에 의해 정량화된다.

제브라피쉬는 약물 발견 및 질병 모델에 널리 사용되는 중요한 모델 유기체입니다. 제브라 피쉬와 인간에 대한 유전 연구는 분자 수준¹²에서 골격 형태 형성의 기본 메커니즘에서 유사성을 입증했습니다. 더욱이, 고처리량 약물 또는 생체 분자 스크리닝은 쥐 모델보다 제브라피쉬의 큰 클러치에서 더 실현 가능하여, 프로오스테겐 또는 골독성 분자¹³의 기계론적 연구를 용이하게 한다. 토토¹⁰ 에서 골격의 차별 염색은 작은 척추 동물과 포유류 태아에서 골격 이형성증을 연구하는 데 자주 사용됩니다. 알리자린 레드 염색은 제브라피쉬 유충에서 화학 물질의 골 발생 독성을 조사하기 위해 수행되었습니다. 여기에서는 제브라피쉬 유충에서 납 아세테이트 유발 뼈 결함을 검출하기 위한 프로토콜을 설명하기 위해 납을 예로 사용했습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 동물 절차는 Soochow 대학의 윤리위원회 동물 관리 연구소에서 검토하고 승인했습니다.

1. 어류 사육 및 배아 수집 ¹⁴

1. 매일 세 번 물고기를 먹이십시오. 제브라 피쉬가 28.5 ± 0.5 ° C에서 14:10 시간의 명암 주기로 유지되도록하십시오.
2. 저녁에 수컷과 암컷 성체 물고기를 산란 탱크의 격리 보드로 2 : 1 수컷 대 암컷 비율로 분리하십시오.
3. 다음날 아침 9:00 AM에 격리 보드를 제거하고 2 시간 후에 배아를 수집합니다.
4. 실험 전에 28.5°C로 유지되는 생화학적 인큐베이터에 배아를 넣었다.

2. 화학 물질 노출

1. 모국을 준비하십시오 : 아세트산 납 삼수화물 (5g)을 계량하고 교반하면서 초순수 (50mL)에 녹입니다.
   주의 : PbAc는 독성이 있습니다. 적절한 방진 마스크, 보호 복 및 장갑을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 실험을 수행하십시오.
2. 제브라 피쉬 배아를 선택하여 깨끗한 6 웰 플레이트 (제브라 피쉬 사육수 3mL에 웰 당 30 개의 배아, 조성은 표 1 참조)에 무작위로 분배합니다. 수정 후 2 시간에서 120 시간 (hpf)까지 PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L)로 배아를 처리하십시오.
   참고: PbAc의 농도는 용량 범위 측정 실험에 따라 선택되었습니다. 결과는 제브라 피쉬 배아에서 납 아세테이트의 LC_{50이 120} hpf에서 41.044 mg / L임을 보여주었습니다. 따라서, 최고 농도는_LC50 의 절반으로 설정되고 일련의 용액은 2배 희석에 의해 제조되었다.
3. 수정 후 5 일부터 하루에 두 번 유충을 먹이십시오 (dpf). 제브라 피쉬 배아를 28.5 ± 0.5 ° C에서 14:10 시간의 명암 주기로 유지하십시오.
4. 9dpf까지 24시간마다 무연 배지(제브라피쉬 번식수)를 새로 고칩니다.
   참고 : 실험 완료 후, 모든 납 함유 용액을 지정된 액체 탱크에 붓고 실험 관리 센터에서 처리했습니다.

3. 알리자린 레드 염색

알림: 전체 염색 과정에서 적절한 방진 마스크, 보호 복 및 장갑을 착용하십시오. 모든 용액의 조성은 표 1에 나타내었다.

1. 특정 염색 단계
   참고: 염색 공정은 실온에서 24-웰 플레이트에서 수행되었다. 각 용액을 첨가한 후 24웰 플레이트를 저속으로 설정된 쉐이킹 테이블 위에 놓습니다.
   1. 9dpf에서 각 그룹에서 무작위로 10마리의 제브라피쉬 유충을 제거하고 1mL의 2% 파라포름알데히드/1x 인산염 완충 식염수에 2시간 동안 물고기를 고정합니다.
   2. 용액을 따라 내고 제브라 피쉬 유충을 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl₂ 로 10 분 동안 세척하십시오.
   3. 용액을 따라 내고 무수 에탄올 (EtOH) 용액 (80 % EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl₂, 50 % EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) 및 25 % EtOH / 100mM Tris-HCl (pH = 7.5).
   4. 용액을 따라 내고, 3%_H2O2및 0.5% KOH로 이루어진 용액으로 표백하여 안료를 제거하고, 안료가 완전히 제거될 때까지 10분마다 한 번씩 관찰한다.
   5. 제브라 피쉬 유충을 25 % 글리세린 / 0.1 % KOH로 거품이 없을 때까지 각각 10 분 동안 여러 번 헹굽니다.
      알림: 거품을 피하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 제브라 피쉬 몸체의 거품이 현미경 아래에서 검은 색 시야로 나타나 관찰 및 정량 분석에 영향을 미칩니다.
   6. 0.01 % 알리자린 1mL에 50 분 동안 담가 유충을 염색합니다.
   7. 용액을 따라 내고 1mL의 50 % 글리세린 / 0.1 % KOH를 10 분 동안 첨가하여 배경을 제거합니다. 후속 관찰을 위해 신선한 50 % 글리세린 / 0.1 % KOH에 물고기를 보관하십시오.

4. 이미지 획득

1. 매번 하나의 유충을 유리 슬라이드에 옮겨 유충을 액체 방울의 중간에 유지합니다.
2. 실체 현미경으로 유충을 관찰하십시오.
3. 카메라를 켜고 소프트웨어를 열고( 재료 표 참조) 기본 설정을 유지합니다.
4. AE를 클릭하고 적절한 노출 시간(이 실험에서는 60ms)을 선택하여 최상의 이미지를 얻습니다.
5. 동일한 설정에서 모든 이미지를 캡처합니다. 나중에 분석할 수 있도록 이미지를 .tif 형식으로 저장합니다.

5. 이미지 분석

참고: 이미지 분석을 위한 샘플 그래프 세트가 있는 예는 보충 파일을 참조하십시오.

1. ImageJ 아이콘을 두 번 클릭하고 4.5단계에서 저장한 이미지를 분석합니다.
   1. 파일 | 열기 4.5단계에서 저장한 이미지를 엽니다.
   2. 클릭 이미지 | 입력하고 8비트를 선택합니다.
   3. 편집 | 반전.
   4. 분석 | 보정, 팝업 인터페이스에서 보정되지 않은 OD를 선택하고 하단 인터페이스의 왼쪽 하단에서 전역 보정을 확인한 다음 확인을 클릭합니다.
   5. 분석 | 스케일 설정 | 클릭하여 스케일 제거 팝업 인터페이스에서 글로벌 아래, 클릭 OK.
   6. 분석 | 측정을 설정하고 팝업 인터페이스에서 항목 영역을 선택한 다음 아래의 임계값 제한(선택한 범위만 측정)을 확인하고 확인을 클릭합니다.
   7. 클릭 이미지 | 조정| 임계값에서 팝업 인터페이스 중간에 있는 슬라이더를 밀어 적절한 임계값(각 이미지의 임계값 변경)을 선택하여 하나의 이미지에서 테스트할 모든 대상이 선택되도록 하고 설정을 클릭합니다.
   8. 분석 | 측정. 각 그룹의 날짜를 기록한다.
2. 일원 분산 분석과 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 차이를 분석하고 유의 수준을 p < 0.001(***)로 설정합니다.

결과

Alizarin 적색 염색은 제브라 피쉬 유충의 뼈 광물 화 변화를 측정하는 민감하고 구체적인 방법입니다. 이 연구에서 우리는 PbAc가 사망, 기형, 심박수 감소 및 신체 길이 단축을 포함하여 제브라피쉬 유충에 악영향을 미친다는 것을 관찰했습니다. 또한, 제브라피쉬 유충의 미네랄 골격 영역을 평가하여 PbAc로 인한 뼈 손실을 조사했습니다. 9dpf(그림 1A)에서 머리 골격의 많은 뼈?...

토론

제브라 피쉬는 뼈 대사 질환을 연구하기에 적합한 모델입니다. 설치류 모델에 비해 제브라 피쉬 모델은 비교적 빠르게 확립 할 수 있으며 질병의 중증도 측정이 더 쉽습니다. 야생형 제브라 피쉬 유충에서 머리 골격의 광물 화는 5dpf에서 발생하고 축 골격은 7dpf¹⁵에서 발생합니다. 따라서 PS, OP, CB 및 NC와 같은 두개골 뼈는 9dpf에서 잘 발달되어 있습니다. 유충이 완전히 염색되고 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal