Utilisation de la coloration rouge Alizarin pour détecter la perte osseuse induite chimiquement chez les larves de poisson zèbre

Résumé

Ici, nous avons utilisé la coloration rouge alizarine pour montrer que l’exposition à l’acétate de plomb provoque un changement de masse osseuse chez les larves de poisson zèbre. Cette méthode de coloration peut être adaptée à l’étude de la perte osseuse chez les larves de poisson zèbre induite par d’autres substances toxiques dangereuses.

Résumé

La perte osseuse induite chimiquement due à l’exposition au plomb (Pb) pourrait déclencher une série d’effets néfastes sur les systèmes squelettiques humains et animaux. Cependant, les effets et les mécanismes spécifiques chez le poisson zèbre restent flous. Le rouge d’alizarine a une forte affinité pour les ions calcium et peut aider à visualiser l’os et illustrer la masse minérale squelettique. Dans cette étude, nous avons cherché à détecter la perte osseuse induite par l’acétate de plomb (PbAc) chez les larves de poisson zèbre en utilisant la coloration rouge alizarine. Les embryons de poisson zèbre ont été traités avec une série de concentrations de PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) entre 2 et 120 h après la fécondation. Une coloration du squelette entier a été effectuée sur les larves 9 jours après la fécondation, et la surface totale colorée a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ. Les résultats ont indiqué que les tissus minéralisés étaient colorés en rouge et que la zone colorée diminuait considérablement dans le groupe exposé au PbAc, avec un changement dose-dépendant de la minéralisation osseuse. Cet article présente un protocole de coloration pour étudier les changements squelettiques dans les défauts osseux induits par PbAc. La méthode peut également être utilisée chez les larves de poisson zèbre pour la détection de la perte osseuse induite par d’autres produits chimiques.

Introduction

Des études récentes ont confirmé que l’ostéoporose due aux glucocorticoïdes, aux inhibiteurs de l’aromatase et à la consommation excessive d’alcool est courante ^1,2. Le plomb (Pb) est un métal toxique présent dans les plantes, le sol et les milieux aquatiques³. Bien que les effets néfastes du plomb sur le corps humain aient attiré beaucoup d’attention, son impact irréversible sur les os doit être étudié plus avant. L’intoxication au plomb provoque un large éventail de changements pathologiques dans le squelette en développement et chez l’adulte, affectant les activités normales de la vie. Des études ont trouvé une association entre l’exposition chronique au plomb et les lésions osseuses⁴, y compris des structures osseuses altérées^5,6, une densité minérale osseuse réduite et même un risque accru d’ostéoporose⁷.

Les tissus minéralisés sont d’une grande importance pour la solidité osseuse⁸, et le dépôt de la matrice de minéralisation osseuse est un indice critique de la formation osseuse⁹. Le rouge d’alizarine a une forte affinité pour les ions calcium, et la coloration au rouge d’alizarine est une procédure standard pour évaluer la formation osseuse¹⁰. Selon cette méthode, les tissus minéralisés sont colorés en rouge, tandis que tous les autres tissus restent transparents. La zone colorée est ensuite quantifiée par analyse d’images numériques¹¹.

Le poisson zèbre est un organisme modèle important largement utilisé dans la découverte de médicaments et les modèles de maladies. Des études génétiques chez le poisson zèbre et l’homme ont démontré des similitudes dans les mécanismes sous-jacents de la morphogenèse squelettique au niveau moléculaire¹². De plus, le criblage de médicaments ou de biomolécules à haut débit est plus réalisable dans de grandes couvées de poisson-zèbre que dans des modèles murins, ce qui facilite l’étude mécaniste de molécules proostéogènes ou ostéotoxiques¹³. La coloration différentielle du squelette au total¹⁰ est fréquemment utilisée dans l’étude de la dysplasie squelettique chez les petits vertébrés et les fœtus de mammifères. La coloration rouge d’alizarine a été réalisée pour étudier la toxicité pour le développement osseux des produits chimiques dans les larves de poisson zèbre. Ici, nous avons utilisé le plomb comme exemple pour décrire un protocole de détection des défauts osseux induits par l’acétate de plomb chez les larves de poisson zèbre.

Protocole

Toutes les procédures animales décrites ici ont été examinées et approuvées par l’Animal Care Institute du comité d’éthique de l’Université Soochow.

1. Pisciculture et collecte d’embryons ¹⁴

1. Nourrissez les poissons trois fois par jour; s’assurer que le poisson zèbre est maintenu à 28,5 ± 0,5 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14:10 h.
2. Séparer les poissons adultes mâles et femelles par des panneaux d’isolement dans des bassins de frai à un ratio mâle/femelle de 2:1 le soir.
3. Le lendemain matin, retirez les planches d’isolement à 9h00 et récupérez les embryons 2 h plus tard.
4. Placer les embryons dans un incubateur biochimique maintenu à 28,5 °C avant l’expérience.

2. Exposition aux produits chimiques

1. Préparer le bouillon mère : peser l’acétate de plomb trihydraté (5 g) et le dissoudre dans de l’eau ultrapure (50 mL) sous agitation.
   ATTENTION : Le PbAc est toxique. Portez des masques antipoussières, des vêtements de protection et des gants appropriés. Effectuez l’expérience sous une hotte.
2. Sélectionner et répartir au hasard les embryons de poisson-zèbre dans des plaques propres à 6 puits (30 embryons par puits dans 3 mL d’eau de reproduction du poisson zèbre; voir le tableau 1 pour sa composition). Traiter les embryons avec du PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) de 2 à 120 h après la fécondation (HPF).
   NOTE: Les concentrations de PbAc ont été choisies en fonction des expériences de détermination de la gamme de doses. Les résultats ont montré que la CL₅₀ de l’acétate de plomb sur les embryons de poisson zèbre était de 41,044 mg/L à 120 hpf. Par conséquent, la concentration la plus élevée a été fixée à la moitié de la CL₅₀ et une série de solutions préparées par dilution 2 fois.
3. Nourrissez les larves deux fois par jour à partir de 5 jours après la fécondation (dpf). Maintenir les embryons de poisson zèbre à 28,5 ± 0,5 °C avec un cycle lumière/obscurité de 14h10.
4. Rafraîchir le milieu sans plomb (eau de reproduction du poisson zèbre) toutes les 24 heures jusqu’à 9 dpf.
   NOTE: À la fin des expériences, toutes les solutions contenant du plomb ont été versées dans un réservoir de liquide désigné et traitées par le centre de gestion de l’expérience.

3. Coloration rouge Alizarin

REMARQUE: Portez des masques antipoussières, des vêtements de protection et des gants appropriés pendant tout le processus de coloration. Les compositions de toutes les solutions sont indiquées dans le tableau 1.

1. Étapes de coloration spécifiques
   NOTE: Le processus de teinture a été effectué dans une plaque de 24 puits à température ambiante. Après l’ajout de chaque solution, placer la plaque de 24 puits sur la table vibrante réglée à basse vitesse.
   1. Prélever 10 larves de poisson zèbre au hasard de chaque groupe à 9 dpf et fixer les poissons dans 1 mL de solution saline tamponnée au paraformaldéhyde à 2 % / 1x tamponnée au phosphate pendant 2 h.
   2. Décanter la solution et laver les larves de poisson zèbre avec 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM de MgCl₂ pendant 10 min.
   3. Décanter la solution et incuber les larves dans les solutions suivantes pendant 5 min chacune pour la coloration : solution d’éthanol anhydre (EtOH) (80 % EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl₂, 50 % EtOH/100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) et 25 % EtOH/100 mM Tris-HCl (pH = 7,5).
   4. Décanter la solution, enlever le pigment par blanchiment avec une solution composée de 3% H_2O2 et 0,5% KOH, et observer une fois toutes les 10 minutes jusqu’à ce que le pigment soit complètement éliminé.
   5. Rincer les larves de poisson zèbre plusieurs fois avec 25% de glycérine / 0,1% de KOH pendant 10 minutes chacune jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bulles.
      REMARQUE: Il est important d’éviter les bulles; Sinon, les bulles dans le corps du poisson zèbre apparaîtront comme un champ de vision noir sous le microscope, ce qui affectera les observations et l’analyse quantitative.
   6. Colorer les larves en les faisant tremper dans 1 mL d’alizarine à 0,01 % pendant 50 min.
   7. Décanter la solution et ajouter 1 ml de glycérine à 50 % / 0,1 % de KOH pendant 10 minutes pour effacer le bruit de fond. Conservez les poissons dans de la glycérine fraîche à 50 % / 0,1 % de KOH pour une observation ultérieure.

4. Acquisition d’images

1. Transférez une larve sur la lame de verre à chaque fois, en gardant la larve au milieu de la goutte liquide.
2. Observez les larves au microscope stéréoscopique.
3. Allumez l’appareil photo, ouvrez le logiciel (voir le tableau des matériaux) et conservez les paramètres par défaut.
4. Cliquez sur AE et choisissez un temps d’exposition approprié (60 ms dans cette expérience) pour obtenir la meilleure image.
5. Capturez toutes les images sous les mêmes paramètres. Enregistrez les images dans .tif format pour une analyse ultérieure.

5. Analyse d’images

Remarque : Voir le fichier supplémentaire pour un exemple avec un ensemble d’exemples de graphiques pour l’analyse d’image.

1. Double-cliquez sur l’icône ImageJ et analysez les images enregistrées à l’étape 4.5.
   1. Cliquez sur Fichier | Ouvrez pour ouvrir les images enregistrées à l’étape 4.5.
   2. Cliquez sur l’image | Tapez, sélectionnez 8 bits.
   3. Cliquez sur Modifier | Inverser.
   4. Cliquez sur Analyser | Calibrer, sélectionnez Non calibré dans l’interface contextuelle, cochez Calibrage global en bas à gauche de l’interface inférieure, puis cliquez sur OK.
   5. Cliquez sur Analyser | Définir l’échelle | Cliquez pour supprimer l’échelle dans l’interface contextuelle, cochez Global ci-dessous, puis cliquez sur OK.
   6. Cliquez sur Analyser | Définir les mesures, sélectionnez la zone d’élément dans l’interface contextuelle, cochez le seuil Limiter au (pour mesurer uniquement la plage sélectionnée), puis cliquez sur OK.
   7. Cliquez sur l’image | Ajuster| Seuil, faites glisser le curseur au milieu de l’interface contextuelle pour sélectionner le seuil approprié (modifiez le seuil pour chaque image) afin que toutes les cibles à tester dans une image soient sélectionnées, puis cliquez sur Définir.
   8. Cliquez sur Analyser | Mesurer. Notez les dates de chaque groupe.
2. Utilisez une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey pour analyser les différences et définissez le niveau de signification à p < 0,001 (***).

Résultats

La coloration rouge alizarine est une méthode sensible et spécifique pour mesurer les changements dans la minéralisation osseuse chez les larves de poisson zèbre. Dans cette étude, nous avons observé que le PbAc avait des effets néfastes sur les larves de poisson zèbre, notamment la mort, la malformation, la diminution de la fréquence cardiaque et le raccourcissement de la longueur corporelle. De plus, les zones squelettiques minérales des larves de poisson zèbre ont été évaluées pour examiner la perte oss...

Discussion

Le poisson zèbre est un modèle approprié pour étudier les maladies métaboliques osseuses. Comparés aux modèles de rongeurs, les modèles de poisson zèbre sont relativement rapides à établir et la mesure de la gravité de la maladie est plus facile. Chez les larves de poisson-zèbre de type sauvage, la minéralisation du squelette de la tête se produit à 5 dpf et du squelette axial à 7 dpf¹⁵. Ainsi, les os crâniens tels que PS, OP, CB et NC sont bien développés à 9 dpf. Une fois le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal