JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы использовали красное окрашивание ализарином, чтобы показать, что воздействие ацетата свинца вызывает изменение костной массы у личинок рыбок данио. Этот метод окрашивания может быть адаптирован для исследования потери костной массы у личинок рыбок данио, вызванной другими опасными токсикантами.

Аннотация

Химически индуцированная потеря костной массы из-за воздействия свинца (Pb) может вызвать множество неблагоприятных воздействий как на скелетные системы человека, так и на животных. Тем не менее, конкретные эффекты и механизмы у рыбок данио остаются неясными. Красный ализарин обладает высоким сродством к ионам кальция и может помочь визуализировать кость и проиллюстрировать скелетную минеральную массу. В этом исследовании мы стремились обнаружить потерю костной массы, вызванную ацетатом свинца (PbAc), у личинок рыбок данио с помощью красного окрашивания ализарином. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали серией концентраций PbAc (0, 5, 10, 20 мг/л) между 2 и 120 ч после оплодотворения. Окрашивание скелета цельным креплением проводилось на личинках через 9 дней после оплодотворения, а общая площадь окрашивания была количественно определена с помощью программного обеспечения ImageJ. Результаты показали, что минерализованные ткани были окрашены в красный цвет, а окрашенная область значительно уменьшилась в группе воздействия PbAc с дозозависимым изменением минерализации кости. В данной статье представлен протокол окрашивания для исследования скелетных изменений в PbAc-индуцированных костных дефектах. Метод также может быть использован у личинок рыбок данио для обнаружения потери костной массы, вызванной другими химическими веществами.

Введение

Недавние исследования подтвердили, что остеопороз из-за глюкокортикоидов, ингибиторов ароматазы и чрезмерного употребления алкоголя распространен 1,2. Свинец (Pb) является токсичным металлом, обнаруженным в растениях, почве и водной среде3. Хотя неблагоприятное воздействие Pb на организм человека привлекло большое внимание, его необратимое влияние на кости нуждается в дальнейшем исследовании. Свинцовая интоксикация вызывает разнообразный спектр патологических изменений как в развивающемся, так и во взрослом скелете, влияя на нормальную жизнедеятельность. Исследования обнаружили связь между хроническим воздействием Pb и повреждением костей4, включая нарушение костных структур 5,6, снижение минеральной плотности кости и даже повышенный риск остеопороза7.

Минерализованная ткань имеет большое значение для прочности кости8, а отложение матрицы минерализации кости является критическим показателем костного образования9. Ализарин красный имеет высокое сродство к ионам кальция, а окрашивание ализариновым красным является стандартной процедурой оценки формирования кости10. Согласно этому методу, минерализованная ткань окрашивается в красный цвет, в то время как вся остальная ткань остается прозрачной. Затем окрашенная область количественно определяется с помощью анализа11 цифрового изображения.

Рыбка данио является важным модельным организмом, широко используемым в моделях открытия лекарств и заболеваний. Генетические исследования на рыбках данио и людях продемонстрировали сходство в основных механизмах морфогенеза скелета на молекулярном уровне12. Кроме того, высокопроизводительный скрининг лекарств или биомолекул более осуществим в больших скоплениях рыбок данио, чем мышиные модели, что облегчает механистическое изучение проостеогенных или остеотоксических молекул13. Дифференциальное окрашивание скелета в toto10 часто используется при изучении дисплазии скелета у мелких позвоночных и плодов млекопитающих. Красное окрашивание ализарином было выполнено для исследования токсичности химических веществ для развития костей у личинок рыбок данио. Здесь мы использовали свинец в качестве примера для описания протокола обнаружения костных дефектов, вызванных ацетатом свинца, у личинок рыбок данио.

протокол

Все процедуры для животных, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институтом по уходу за животными Комитета по этике Университета Сучжоу.

1. Рыбоводство и сбор эмбрионов 14

  1. Кормить рыбу три раза в день; убедитесь, что рыбки данио поддерживаются при температуре 28,5 ± 0,5 ° C с циклом 14:10 ч света / темноты.
  2. Разделите самцов и самок взрослых рыб с помощью изоляционных досок в нерестилищах при соотношении самцов и самок 2:1 вечером.
  3. На следующее утро снимите изоляционные доски в 9:00 утра и соберите эмбрионы через 2 часа.
  4. Поместите эмбрионы в биохимический инкубатор, поддерживаемый при температуре 28,5 °C перед экспериментом.

2. Химическое воздействие

  1. Подготовьте материнский бульон: взвесьте тригидрат ацетата свинца (5 г) и растворите его в сверхчистой воде (50 мл) при перемешивании.
    ВНИМАНИЕ: PbAc токсичен. Носите подходящие пылевые маски, защитную одежду и перчатки. Проведите эксперимент под вытяжным кожухом.
  2. Отбирайте и случайным образом распределяйте эмбрионы рыбок данио по чистым 6-луночным пластинам (30 эмбрионов на лунку в 3 мл воды для размножения рыбок данио; см. таблицу 1 для его состава). Обработайте эмбрионы PbAc (0, 5, 10, 20 мг/л) от 2 до 120 ч после оплодотворения (HPF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации PbAc были выбраны в соответствии с экспериментами по определению диапазона доз. Результаты показали, что LC50 ацетата свинца на эмбрионах рыбок данио составлял 41,044 мг / л при 120 л.с. Следовательно, наибольшую концентрацию устанавливали на половину ЛК50 и серию растворов, приготовленных 2-кратным разбавлением.
  3. Кормите личинок два раза в день с 5 дней после оплодотворения (дпф). Поддерживайте эмбрионы рыбок данио при температуре 28,5 ± 0,5 °C с циклом 14:10 ч света/темноты.
  4. Обновляйте среду без Pb (воду для размножения рыбок данио) каждые 24 ч до 9 dpf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По завершении экспериментов все свинцовосодержащие растворы выливались в специальный резервуар для жидкости и обрабатывались центром управления экспериментом.

3. Ализарин красное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Носите подходящие пылевые маски, защитную одежду и перчатки в течение всего процесса окрашивания. Составы всех растворов приведены в таблице 1.

  1. Специальные этапы окрашивания
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс окрашивания проводили в 24-луночной плите при комнатной температуре. После того, как каждый раствор был добавлен, поместите 24-луночную тарелку на встряхивающий стол, установленный на низкой скорости.
    1. Удалите 10 личинок рыбок данио случайным образом из каждой группы при 9 dpf и зафиксируйте рыбу в 1 мл 2% параформальдегида / 1x фосфатно-буферного физиологического раствора в течение 2 ч.
    2. Деканировать раствор и промыть личинок рыбок данио 100 мМ Tris-HCl (рН 7,5)/10 мМMgCl2 в течение 10 мин.
    3. Декантируйте раствор и инкубируйте личинки в следующих растворах в течение 5 мин каждый для очистки: раствор безводного этанола (EtOH) (80% EtOH/100 мМ Tris-HCl (pH 7,5)/10 мМ MgCl2, 50% EtOH/100 мМ Tris-HCl (pH=7,5) и 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
    4. Деканировать раствор, удалить пигмент путем отбеливания раствором, состоящим из 3% H2O2 и 0,5% KOH, и наблюдать один раз в 10 мин до полного удаления пигмента.
    5. Промыть личинок рыбок данио несколько раз 25% глицерина / 0,1% KOH в течение 10 минут каждый, пока не останется пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать пузырьков; в противном случае пузырьки в теле рыбки данио будут появляться в виде черного поля зрения под микроскопом, что повлияет на наблюдения и количественный анализ.
    6. Окрашивают личинки, замачивая в 1 мл 0,01% ализарина в течение 50 мин.
    7. Деканировать раствор и добавить 1 мл 50% глицерина/0,1% КОН в течение 10 мин для очистки фона. Храните рыбу в свежем 50% глицерине / 0,1% KOH для последующего наблюдения.

4. Получение изображений

  1. Каждый раз переносите одну личинку на стеклянную горку, удерживая личинку в середине капли жидкости.
  2. Наблюдайте за личинками под стереомикроскопом.
  3. Включите камеру, откройте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) и сохраните настройки по умолчанию.
  4. Нажмите на AE и выберите подходящее время экспозиции (60 мс в этом эксперименте), чтобы получить лучшее изображение.
  5. Захват всех изображений с одинаковыми настройками. Сохраните изображения в .tif формате для последующего анализа.

5. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: См. файл Supplemental для примера с набором образцов графиков для анализа изображений.

  1. Дважды щелкните значок ImageJ и проанализируйте изображения, сохраненные на шаге 4.5.
    1. Нажмите на Файл | Откройте , чтобы открыть изображения, сохраненные на шаге 4.5.
    2. Нажмите на изображение | Введите, выберите 8-бит.
    3. Нажмите на Редактировать | Инвертировать.
    4. Нажмите на Анализ | Откалибруйте, выберите Некалиброванный OD во всплывающем интерфейсе, проверьте Глобальная калибровка в левом нижнем углу нижнего интерфейса и нажмите кнопку ОК.
    5. Нажмите на Анализ | Установить масштаб | Щелкните, чтобы Удалить масштаб во всплывающем интерфейсе, установите флажок Глобальный ниже и нажмите кнопку ОК.
    6. Нажмите на Анализ | Установите параметр «Измерения», выберите область элемента во всплывающем интерфейсе, установите флажок Ограничить пороговое значение ниже (чтобы измерить только выбранный диапазон) и нажмите кнопку «ОК».
    7. Нажмите на изображение | Настроить| Пороговое значение, сдвиньте ползунок в середине всплывающего интерфейса, чтобы выбрать соответствующее пороговое значение (измените пороговое значение для каждого изображения), чтобы были выбраны все цели, которые будут протестированы в одном изображении, и нажмите кнопку Установить.
    8. Нажмите на Анализ | Мера. Запишите даты каждой группы.
  2. Используйте одностороннюю ANOVA, за которой следует множественный сравнительный тест Туки, чтобы проанализировать различия, и установите уровень значимости на уровне p < 0,001 (***).

Результаты

Красное окрашивание ализарином является чувствительным и специфическим методом измерения изменений минерализации костей у личинок рыбок данио. В этом исследовании мы заметили, что PbAc оказывает неблагоприятное воздействие на личинок рыбок данио, включая смерть, пороки развития, сниж?...

Обсуждение

Рыбка данио является подходящей моделью для изучения метаболических заболеваний костей. По сравнению с моделями грызунов, модели рыбок данио относительно быстро устанавливаются, а измерение тяжести заболевания проще. У личинок рыбок данио дикого типа минерализация головного скелета...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81872646; 81811540034; 81573173) и Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений Цзянсу (PAPD).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)Solarbio,Beijing,China21for detaining
4% Paraformaldehyde Fix SolutionBBI,Shanghai,China14fixing tissues
10x PBS bufferBBI,Shanghai,China15for fixing
35% H2O2Yonghua,Jiangsu,China8removing pigment
50 mL Centrifuge tubeAKX,Jiangsu,China4
95% Anhydrous ethanolEnox,Jiangsu,China2destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)Solarbio,Beijing,China1staining
Biochemical incubatorYiheng,Shanghai,China3raising zebrafish embryos
Electronic scaleSartorius,Germany5weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)BBI,Shanghai,China7storing the stained fish
ImageJ (software)USA9digital analysis
KOH (Purity 99.9%)Sigma,America10bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)Aladdin,Shanghai,China11
MgCl2 (Purity 99.9%)Aladdin,Shanghai,China12cleaning solution
NIS-Elements F (software)Nikon, Japan13observing and taking photos
PipeAKX, Jiangsu, China18removal of embryos and solution
plates (24-well)Corning,America17container for staining embryos
plates (6-well)Corning,America16container for breeding embryos
Shaking tableBeyotime, China19mixing the solution
Stereo microscopeNikon,Japan20observing and taking photos
ZebrafishZebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China22experimental animal

Ссылки

  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
  3. Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
  4. Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
  5. Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
  6. Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
  7. Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
  8. Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
  9. Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
  10. Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
  11. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
  14. Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
  15. Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
  16. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  17. Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
  18. Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены