Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

Resumo

Aqui, usamos a coloração vermelha de alizarina para mostrar que a exposição ao acetato de chumbo causa uma mudança na massa óssea nas larvas de peixe-zebra. Este método de coloração pode ser adaptado para a investigação da perda óssea em larvas de peixe-zebra induzida por outros tóxicos perigosos.

Resumo

A perda óssea induzida quimicamente devido à exposição ao chumbo (Pb) pode desencadear uma série de impactos adversos nos sistemas esqueléticos humanos e animais. No entanto, os efeitos e mecanismos específicos no peixe-zebra permanecem obscuros. O vermelho de alizarina tem uma alta afinidade por íons de cálcio e pode ajudar a visualizar o osso e ilustrar a massa mineral esquelética. Neste estudo, nosso objetivo foi detectar a perda óssea induzida por acetato de chumbo (PbAc) em larvas de peixe-zebra utilizando a coloração vermelha de alizarina. Embriões de peixe-zebra foram tratados com uma série de concentrações de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 e 120 h após a fertilização. A coloração esquelética de montagem inteira foi realizada em larvas aos 9 dias após a fertilização, e a área total corada foi quantificada usando o software ImageJ. Os resultados indicaram que os tecidos mineralizados foram corados em vermelho, e a área corada diminuiu significativamente no grupo de exposição ao PbAc, com uma mudança dose-dependente na mineralização óssea. Este trabalho apresenta um protocolo de coloração para investigar alterações esqueléticas em defeitos ósseos induzidos por PbAc. O método também pode ser usado em larvas de peixe-zebra para a detecção de perda óssea induzida por outros produtos químicos.

Introdução

Estudos recentes têm confirmado que a osteoporose decorrente de glicocorticoides, inibidores da aromatase e consumo excessivo de álcool é comum ^1,2. O chumbo (Pb) é um metal tóxico encontrado em plantas, solo e ambientes aquáticos³. Embora os efeitos adversos do Pb no corpo humano tenham atraído muita atenção, seu impacto irreversível no osso precisa ser investigado mais a fundo. A intoxicação por chumbo causa uma gama diversificada de alterações patológicas no esqueleto em desenvolvimento e no adulto, afetando as atividades normais da vida. Estudos encontraram associação entre exposição crônica ao Pb e danos ósseos⁴, incluindo estruturas ósseas prejudicadas^5,6, redução da densidade mineral óssea e até aumento do risco de osteoporose⁷.

O tecido mineralizado é de grande importância para a resistência óssea⁸, e a deposição da matriz de mineralização óssea é um índice crítico de formação óssea⁹. O vermelho de alizarina tem alta afinidade por íons cálcio, e a coloração vermelha de alizarina é um procedimento padrão para avaliar a formação óssea¹⁰. De acordo com este método, o tecido mineralizado é manchado de vermelho, enquanto todos os outros tecidos permanecem transparentes. A área corada é então quantificada por análise de imagem digital¹¹.

O peixe-zebra é um importante organismo modelo amplamente utilizado na descoberta de medicamentos e modelos de doenças. Estudos genéticos em peixes-zebra e humanos demonstraram semelhanças nos mecanismos subjacentes da morfogênese esquelética em nível molecular¹². Além disso, o rastreamento de fármacos ou biomoléculas de alto rendimento é mais viável em grandes embreagens de peixe-zebra do que em modelos murinos, facilitando o estudo mecanicista de moléculas proosteogênicas ou osteotóxicas¹³. A coloração diferencial do esqueleto em toto¹⁰ é frequentemente usada no estudo da displasia esquelética em pequenos vertebrados e fetos de mamíferos. A coloração vermelha de alizarina foi realizada para investigar a toxicidade do desenvolvimento ósseo de produtos químicos em larvas de peixe-zebra. Aqui, usamos o chumbo como exemplo para descrever um protocolo para detectar defeitos ósseos induzidos por acetato de chumbo em larvas de peixe-zebra.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais descritos aqui foram revisados e aprovados pelo Instituto de Cuidados com Animais do Comitê de Ética da Universidade de Soochow.

1. Criação de peixes e colheita de embriões ¹⁴

1. Alimentar os peixes três vezes por dia; Assegurar que o peixe-zebra é mantido a 28,5 ± 0,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14:10 h.
2. Separe os peixes adultos machos e fêmeas por placas de isolamento em tanques de desova em uma proporção de 2: 1 macho para fêmea à noite.
3. Na manhã seguinte, retire as placas de isolamento às 9:00 da manhã e colete os embriões 2 h depois.
4. Colocar os embriões numa incubadora bioquímica mantida a 28,5 °C antes da experiência.

2. Exposição química

1. Prepare o estoque-mãe: pese o acetato de chumbo tri-hidratado (5 g) e dissolva-o em água ultrapura (50 mL) com agitação.
   CUIDADO: A PbAc é tóxica. Use máscaras de poeira adequadas, roupas de proteção e luvas. Realize o experimento sob um exaustor.
2. Selecionar e distribuir aleatoriamente embriões de peixe-zebra em placas limpas de 6 poços (30 embriões por poço em 3 mL de água de reprodução de peixe-zebra; ver Tabela 1 para sua composição). Tratar os embriões com PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) de 2 a 120 h após a fecundação (hpf).
   NOTA: As concentrações de PbAc foram escolhidas de acordo com os experimentos de determinação da faixa de dose. Os resultados mostraram que a CL₅₀ de acetato de chumbo em embriões de peixe-zebra foi de 41,044 mg/L a 120 hpf. Assim, a maior concentração foi ajustada para metade da CL₅₀ e uma série de soluções preparadas por diluição de 2 vezes.
3. Alimente as larvas duas vezes ao dia a partir de 5 dias após a fertilização (dpf). Manter os embriões de peixe-zebra a 28,5 ± 0,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14:10 h.
4. Refrescar o meio sem Pb (água de reprodução de peixe-zebra) a cada 24 h até 9 dpf.
   NOTA: Após a conclusão dos experimentos, todas as soluções contendo chumbo foram despejadas em um tanque líquido designado e tratadas pelo centro de gerenciamento de experimentos.

3. Coloração vermelha de alizarina

NOTA: Use máscaras de poeira, roupas de proteção e luvas adequadas durante todo o processo de coloração. As composições de todas as soluções são apresentadas na Tabela 1.

1. Etapas específicas de coloração
   NOTA: O processo de tingimento foi realizado em placa de 24 poços à temperatura ambiente. Depois que cada solução foi adicionada, coloque a placa de 24 poços na mesa de agitação colocada a uma velocidade baixa.
   1. Remova 10 larvas de peixe-zebra aleatoriamente de cada grupo a 9 dpf e fixe o peixe em 1 mL de solução salina tamponada com paraformaldeído a 2%/1x fosfato por 2 h.
   2. Decantar a solução e lavar as larvas de peixe-zebra com 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl₂ durante 10 min.
   3. Decante a solução e incubar as larvas nas seguintes soluções por 5 min cada para descoloração: solução de etanol anidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl₂, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) e 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
   4. Decantar a solução, remover o pigmento por branqueamento com uma solução constituída por 3% H₂O₂ e 0,5% KOH, e observar uma vez a cada 10 min até que o pigmento seja completamente removido.
   5. Lave as larvas de peixe-zebra várias vezes com 25% de glicerina / 0,1% de KOH por 10 min cada até que não haja bolhas.
      NOTA: É importante evitar bolhas; caso contrário, as bolhas no corpo do peixe-zebra aparecerão como um campo de visão preto sob o microscópio, o que afetará as observações e a análise quantitativa.
   6. Coloração das larvas por imersão em 1 mL de alizarina a 0,01% por 50 min.
   7. Decantar a solução e adicionar 1mL de glicerina a 50%/KOH a 0,1% por 10 min para limpar o fundo. Armazene os peixes em fresco 50% de glicerina / 0,1% de KOH para observação subsequente.

4. Aquisição de imagens

1. Transfira uma larva para a lâmina de vidro de cada vez, mantendo a larva no meio da gota líquida.
2. Observe as larvas sob um microscópio estéreo.
3. Ligue a câmera, abra o software (consulte a Tabela de materiais) e mantenha as configurações padrão.
4. Clique em AE e escolha um tempo de exposição apropriado (60 ms neste experimento) para obter a melhor imagem.
5. Capture todas as imagens nas mesmas configurações. Salve as imagens em formato .tif para análise posterior.

5. Análise de imagem

Observação : consulte o arquivo suplementar para obter um exemplo com um conjunto de gráficos de exemplo para análise de imagem.

1. Clique duas vezes no ícone ImageJ e analise as imagens salvas na etapa 4.5.
   1. Clique em Arquivo | Abra para abrir as imagens salvas na etapa 4.5.
   2. Clique na imagem | Digite, selecione 8 bits.
   3. Clique em Editar | Inverter.
   4. Clique em Analisar | Calibrar, selecione OD não calibrado na interface pop-up, marque Calibração global no canto inferior esquerdo da interface inferior e clique em OK.
   5. Clique em Analisar | Definir escala | Clique para remover escala na interface pop-up, marque Global abaixo e clique em OK.
   6. Clique em Analisar | Defina Medidas, selecione a área do item na interface pop-up, marque o limite Limite abaixo (para medir apenas o intervalo selecionado) e clique em OK.
   7. Clique na imagem | Ajustar| Limite, deslize o controle deslizante no meio da interface pop-up para selecionar o limite apropriado (altere o limite para cada imagem) para que todos os destinos a serem testados em uma imagem sejam selecionados e clique em Definir.
   8. Clique em Analisar | Medida. Registre as datas de cada grupo.
2. Use ANOVA one-way seguida do teste de comparação múltipla de Tukey para analisar as diferenças e defina o nível de significância em p < 0,001 (***).

Resultados

A coloração vermelha de alizarina é um método sensível e específico para medir mudanças na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra. Neste estudo, observamos que a PbAc teve efeitos adversos sobre as larvas de peixe-zebra, incluindo morte, malformação, diminuição da frequência cardíaca e encurtamento do comprimento corporal. Além disso, as áreas do esqueleto mineral de larvas de peixe-zebra foram avaliadas para examinar a perda óssea induzida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A

Discussão

O peixe-zebra é um modelo adequado para o estudo da doença metabólica óssea. Em comparação com os modelos de roedores, os modelos de peixe-zebra são relativamente rápidos de estabelecer, e a medição da gravidade da doença é mais fácil. Em larvas de peixe-zebra do tipo selvagem, a mineralização do esqueleto da cabeça ocorre a 5 dpf e do esqueleto axial a 7 dpf¹⁵. Assim, ossos cranianos como PS, OP, CB e NC estão bem desenvolvidos a 9 dpf. Depois que as larvas foram completamente de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal