Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

Riepilogo

Qui, abbiamo usato la colorazione rosso alizarina per dimostrare che l'esposizione all'acetato di piombo provoca un cambiamento di massa ossea nelle larve di zebrafish. Questo metodo di colorazione può essere adattato allo studio della perdita ossea nella perdita di larve di zebrafish indotta da altre sostanze tossiche pericolose.

Abstract

La perdita ossea indotta chimicamente dovuta all'esposizione al piombo (Pb) potrebbe innescare una serie di impatti avversi sui sistemi scheletrici sia umani che animali. Tuttavia, gli effetti e i meccanismi specifici del pesce zebra rimangono poco chiari. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e può aiutare a visualizzare l'osso e illustrare la massa minerale scheletrica. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la perdita ossea indotta dall'acetato di piombo (PbAc) nelle larve di zebrafish utilizzando la colorazione rosso alizarina. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con una serie di concentrazioni di PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) tra 2 e 120 ore dopo la fecondazione. La colorazione scheletrica a montaggio intero è stata condotta sulle larve a 9 giorni dopo la fecondazione e l'area totale colorata è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. I risultati hanno indicato che i tessuti mineralizzati erano colorati in rosso e l'area colorata diminuiva significativamente nel gruppo di esposizione al PbAc, con un cambiamento dose-dipendente nella mineralizzazione ossea. Questo documento presenta un protocollo di colorazione per studiare i cambiamenti scheletrici nei difetti ossei indotti da PbAc. Il metodo può essere utilizzato anche nelle larve di zebrafish per la rilevazione della perdita ossea indotta da altre sostanze chimiche.

Introduzione

Studi recenti hanno confermato che l'osteoporosi dovuta a glucocorticoidi, inibitori dell'aromatasi e consumo eccessivo di alcol è comune ^1,2. Il piombo (Pb) è un metallo tossico presente nelle piante, nel suolo e negli ambienti acquatici³. Sebbene gli effetti avversi del Pb sul corpo umano abbiano attirato molta attenzione, il suo impatto irreversibile sull'osso deve essere studiato ulteriormente. L'intossicazione da piombo provoca una vasta gamma di cambiamenti patologici sia nello scheletro in via di sviluppo che in quello adulto, influenzando le normali attività della vita. Gli studi hanno trovato un'associazione tra esposizione cronica a Pb e danno osseo⁴, tra cui strutture ossee compromesse^5,6, ridotta densità minerale ossea e persino aumento del rischio di osteoporosi⁷.

Il tessuto mineralizzato è di grande importanza per la resistenza ossea⁸ e la deposizione della matrice di mineralizzazione ossea è un indice critico della formazione ossea⁹. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e la colorazione rosso alizarina è una procedura standard per valutare la formazione ossea¹⁰. Secondo questo metodo, il tessuto mineralizzato è colorato di rosso, mentre tutto il resto del tessuto rimane trasparente. L'area colorata viene quindi quantificata mediante analisi digitale delle immagini¹¹.

Il pesce zebra è un importante organismo modello ampiamente utilizzato nella scoperta di farmaci e nei modelli di malattia. Studi genetici nel pesce zebra e nell'uomo hanno dimostrato somiglianze nei meccanismi alla base della morfogenesi scheletrica a livello molecolare¹². Inoltre, lo screening di farmaci o biomolecole ad alto rendimento è più fattibile in grandi covate di zebrafish rispetto ai modelli murini, facilitando lo studio meccanicistico di molecole proosteogeniche o osteotossiche¹³. La colorazione differenziale dello scheletro in toto¹⁰ è frequentemente utilizzata nello studio della displasia scheletrica nei piccoli vertebrati e nei feti di mammiferi. La colorazione rossa dell'alizarina è stata eseguita per studiare la tossicità dello sviluppo osseo delle sostanze chimiche nelle larve di zebrafish. Qui, abbiamo usato il piombo come esempio per descrivere un protocollo per rilevare difetti ossei indotti dall'acetato di piombo nelle larve di zebrafish.

Protocollo

Tutte le procedure per animali descritte qui sono state esaminate e approvate dall'Animal Care Institute del Comitato Etico della Soochow University.

1. Allevamento ittico e raccolta di embrioni ¹⁴

1. Dai da mangiare ai pesci tre volte al giorno; assicurarsi che i pesci zebra siano mantenuti a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.
2. Separare il pesce adulto maschio e femmina da tavole di isolamento in vasche di deposizione delle uova con un rapporto maschio-femmina di 2: 1 la sera.
3. La mattina seguente, rimuovere le tavole di isolamento alle 9:00 e raccogliere gli embrioni 2 ore dopo.
4. Mettere gli embrioni in un incubatore biochimico mantenuto a 28,5 °C prima dell'esperimento.

2. Esposizione chimica

1. Preparare il brodo madre: pesare l'acetato di piombo triidrato (5 g) e scioglierlo in acqua ultrapura (50 ml) agitando.
   ATTENZIONE: PbAc è tossico. Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti. Eseguire l'esperimento sotto una cappa aspirante.
2. Selezionare e distribuire casualmente gli embrioni di zebrafish in piastre pulite a 6 pozzetti (30 embrioni per pozzetto in 3 ml di acqua di riproduzione del pesce zebra; vedere Tabella 1 per la sua composizione). Trattare gli embrioni con PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) da 2 a 120 ore dopo la fecondazione (hpf).
   NOTA: Le concentrazioni di PbAc sono state scelte in base agli esperimenti di determinazione del range di dose. I risultati hanno mostrato che la LC₅₀ di acetato di piombo sugli embrioni di zebrafish era 41.044 mg/L a 120 hpf. Quindi, la concentrazione più alta è stata fissata a metà della LC₅₀ e una serie di soluzioni preparate mediante diluizione 2 volte.
3. Nutrire le larve due volte al giorno da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf). Mantenere gli embrioni di zebrafish a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.
4. Rinfrescare il terreno privo di Pb (acqua di riproduzione del pesce zebra) ogni 24 ore fino a 9 dpf.
   NOTA: Al termine degli esperimenti, tutte le soluzioni contenenti piombo sono state versate in un serbatoio di liquido designato e trattate dal centro di gestione dell'esperimento.

3. Colorazione rosso alizarina

NOTA: Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti durante l'intero processo di colorazione. Le composizioni di tutte le soluzioni sono mostrate nella Tabella 1.

1. Fasi specifiche di colorazione
   NOTA: Il processo di tintura è stato effettuato in una piastra da 24 pozzetti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto ogni soluzione, posizionare la piastra a 24 pozzetti sul tavolo vibrante impostato a bassa velocità.
   1. Rimuovere 10 larve di zebrafish a caso da ciascun gruppo a 9 dpf e fissare il pesce in 1 ml di paraformaldeide al 2% / 1x soluzione salina tamponata con fosfato per 2 ore.
   2. Decantare la soluzione e lavare le larve di zebrafish con 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl₂ per 10 min.
   3. Decantare la soluzione e incubare le larve nelle seguenti soluzioni per 5 minuti ciascuna per la decolorazione: soluzione di etanolo anidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl₂, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) e 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).
   4. Decantare la soluzione, rimuovere il pigmento mediante sbiancamento con una soluzione composta da 3%H 2 O₂ e 0,5% KOH, e osservare una volta ogni 10 minuti fino a completa rimozione del pigmento.
   5. Risciacquare le larve di zebrafish più volte con glicerina al 25% / KOH allo 0,1% per 10 minuti ciascuna fino a quando non ci sono bolle.
      NOTA: È importante evitare le bolle; Altrimenti, le bolle nel corpo del pesce zebra appariranno come un campo visivo nero al microscopio, che influenzerà le osservazioni e l'analisi quantitativa.
   6. Macchiare le larve immergendo in 1 ml di alizarina allo 0,01% per 50 minuti.
   7. Decantare la soluzione e aggiungere 1 ml di glicerina al 50% / KOH allo 0,1% per 10 minuti per cancellare lo sfondo. Conservare i pesci in 50% glicerina fresca/0,1% KOH per la successiva osservazione.

4. Acquisizione di immagini

1. Trasferire una larva sul vetrino ogni volta, mantenendo la larva nel mezzo della goccia di liquido.
2. Osserva le larve al microscopio stereo.
3. Accendere la fotocamera, aprire il software (vedere la tabella dei materiali) e mantenere le impostazioni predefinite.
4. Fare clic su AE e scegliere un tempo di esposizione appropriato (60 ms in questo esperimento) per ottenere l'immagine migliore.
5. Cattura tutte le immagini con le stesse impostazioni. Salvate le immagini in formato .tif per un'analisi successiva.

5. Analisi delle immagini

NOTA: vedere il file supplementare per un esempio con una serie di grafici di esempio per l'analisi delle immagini.

1. Fare doppio clic sull'icona di ImageJ e analizzare le immagini salvate nel passaggio 4.5.
   1. Clicca su File | Aprire per aprire le immagini salvate nel passaggio 4.5.
   2. Clicca sull'immagine | Digitare, selezionare 8 bit.
   3. Clicca su Modifica | Inverti.
   4. Clicca su Analizza | Calibrare, selezionare OD non calibrato nell'interfaccia popup, selezionare Calibrazione globale nella parte inferiore sinistra dell'interfaccia inferiore e fare clic su OK.
   5. Clicca su Analizza | Imposta scala | Fare clic per rimuovere la scala nell'interfaccia popup, selezionare Globale di seguito e fare clic su OK.
   6. Clicca su Analizza | Imposta misure, seleziona l'area dell'elemento nell'interfaccia popup, seleziona la soglia Limita a di seguito (per misurare solo l'intervallo selezionato) e fai clic su OK.
   7. Clicca sull'immagine | Regola| Soglia, fai scorrere il cursore al centro dell'interfaccia popup per selezionare la soglia appropriata (modifica la soglia per ogni immagine) in modo che siano selezionate tutte le destinazioni da testare in un'immagine, quindi fai clic su Imposta.
   8. Clicca su Analizza | Misura. Registra le date di ciascun gruppo.
2. Utilizzare ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per analizzare le differenze e impostare il livello di significatività a p < 0,001 (***).

Risultati

La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. In questo studio, abbiamo osservato che PbAc ha avuto effetti avversi sulle larve di zebrafish, tra cui morte, malformazione, diminuzione della frequenza cardiaca e riduzione della lunghezza del corpo. Inoltre, le aree dello scheletro minerale delle larve di zebrafish sono state valutate per esaminare la perdita ossea indotta da PbAc. A 9 dpf (Figura 1A

Discussione

Il pesce zebra è un modello adatto per studiare la malattia metabolica ossea. Rispetto ai modelli di roditori, i modelli di zebrafish sono relativamente veloci da stabilire e la misurazione della gravità della malattia è più facile. Nelle larve di zebrafish wild-type, la mineralizzazione dello scheletro della testa avviene a 5 dpf e lo scheletro assiale a 7 dpf¹⁵. Pertanto, le ossa craniche come PS, OP, CB e NC sono ben sviluppate a 9 dpf. Dopo che le larve sono state completamente decolorate ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl (pH=7.5)	Solarbio,Beijing,China	21	for detaining
4% Paraformaldehyde Fix Solution	BBI,Shanghai,China	14	fixing tissues
10x PBS buffer	BBI,Shanghai,China	15	for fixing
35% H2O2	Yonghua,Jiangsu,China	8	removing pigment
50 mL Centrifuge tube	AKX,Jiangsu,China	4
95% Anhydrous ethanol	Enox,Jiangsu,China	2	destaining
Alizarin red (Purity 99.5%)	Solarbio,Beijing,China	1	staining
Biochemical incubator	Yiheng,Shanghai,China	3	raising zebrafish embryos
Electronic scale	Sartorius,Germany	5	weighing the solid raw materials
Glycerin (Purity 99.5%)	BBI,Shanghai,China	7	storing the stained fish
ImageJ (software)	USA	9	digital analysis
KOH (Purity 99.9%)	Sigma,America	10	bleaching solution
Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%)	Aladdin,Shanghai,China	11
MgCl2 (Purity 99.9%)	Aladdin,Shanghai,China	12	cleaning solution
NIS-Elements F (software)	Nikon, Japan	13	observing and taking photos
Pipe	AKX, Jiangsu, China	18	removal of embryos and solution
plates (24-well)	Corning,America	17	container for staining embryos
plates (6-well)	Corning,America	16	container for breeding embryos
Shaking table	Beyotime, China	19	mixing the solution
Stereo microscope	Nikon,Japan	20	observing and taking photos
Zebrafish	Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China	22	experimental animal