JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم توضيح التحضير المكثف ل "أنابيب" البطانية الدماغية للفئران السليمة من الشرايين المتنية الدماغية لدراسة تنظيم تدفق الدم الدماغي. علاوة على ذلك ، نوضح نقاط القوة التجريبية لنموذج الدراسة البطانية هذا للتصوير الفلوري وقياس الفيزيولوجيا الكهربية لمسارات الإشارات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك التغيرات في داخل الخلايا [Ca2+] وإمكانات الغشاء.

Abstract

يتم نقل تدفق الدم الدماغي عن طريق الشرايين المقاومة للأوعية الدموية والشرايين المتنية في المصب. تزداد مقاومة الأوعية الدموية الثابتة لتدفق الدم مع انخفاض القطر من الشرايين إلى الشرايين التي تغذي الشعيرات الدموية في نهاية المطاف. نظرا لصغر حجمها وموقعها في الحمة ، فقد لم تتم دراسة الشرايين بشكل كاف نسبيا ومع قابلية أقل للتكرار في النتائج من الشرايين البينية السطحية. وبغض النظر عن ذلك، فإن بنية الخلايا البطانية الشريانية ووظيفتها - وهي جزء لا يتجزأ من فسيولوجيا ومسببات الأمراض التنكسية المزمنة - تتطلب تحقيقا مكثفا. على وجه الخصوص ، تظهر الأدلة الناشئة أن الوظيفة البطانية المعرضة للخطر تسبق وتفاقم الضعف المعرفي والخرف.

في دوران الأوعية الدقيقة المتني ، تعد وظيفة قناة K + البطانية أقوى حافز للتحكم بدقة في انتشار توسع الأوعية لتعزيز الزيادات في تدفق الدم إلى مناطق النشاط العصبي. توضح هذه الورقة طريقة مكررة لعزل "الأنابيب" البطانية السليمة والمقترنة كهربائيا (قطرها ، ~ 25 ميكرومتر) من الشرايين المتنية في دماغ الفأر. يتم تأمين الأنابيب البطانية الشريانية خلال الظروف الفسيولوجية (37 درجة مئوية ، درجة الحموضة 7.4) لحل المتغيرات التجريبية التي تشمل وظيفة قناة K + وتنظيمها ، بما في ذلك ديناميكيات Ca2 + داخل الخلايا ، والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وتنظيم الدهون الغشائية. الميزة التقنية المميزة مقابل البطانة الشريانية هي الدقة المورفولوجية المعززة لأبعاد الخلايا والعضيات (مثل الميتوكوندريا) ، مما يوسع فائدة هذه التقنية. ينطوي التروية الدماغية الصحية طوال الحياة على وظيفة بطانية قوية في الشرايين المتنية ، مما يربط مباشرة تدفق الدم بتغذية النشاط العصبي والدبقي في جميع أنحاء المناطق التشريحية الدقيقة من الدماغ. وبالتالي ، من المتوقع أن تقدم هذه الطريقة بشكل كبير المعرفة العامة لفسيولوجيا الأوعية الدموية وعلم الأعصاب فيما يتعلق بالدماغ السليم والمريض.

Introduction

توفر الشرايين المتنية مباشرة الأكسجين والمواد المغذية الأساسية في جميع أنحاء الدماغ1. أثناء التفاعل مع الشعيرات الدموية ، تستجيب الشرايين عالية النشاط للأوعية الدموية للإشارات الرجعية التي تبدأها قنوات الأيونات الشعرية التي تستشعر إشارات التمثيل الغذائي من مناطق عصبية محددة2. مع تلقي حمة الدماغ تاريخيا الجزء الأكبر من التحقيق ، ظهر الآن دور للخلل الوظيفي البطاني لتوضيح الآليات المرضية المرتبطة بمختلف الاضطرابات الدماغية الوعائية التي تكمن وراء الخرف (على سبيل المثال ، السكتة الدماغية الإقفارية ، مرض الزهايمر)3،4،5،6 . البطانة هي جزء لا يتجزأ من تروية الدماغ وفقا لعدم تجانس علم الوراثة والبنية والوظيفة في جميع أنحاء قطاعات الأوعية الدموية7. تمت دراسة شرايين Pial على نطاق واسع بسبب حجمها الكبير نسبيا ، ومقاومة الأوعية الدموية القطاعية العالية ، ودورها في توزيع تدفق الدم إلى الدماغ الأساسي 8,9. وبالتالي ، من المرجح أن يؤدي الفهم الأفضل للآليات البطانية الشريانية إلى تعزيز فهم تنظيم تدفق الدم في الدماغ في الصحة والمرض نحو تطوير أنظمة علاجية جديدة.

تسلط الأدلة الناشئة الضوء على أهمية دراسة الشرايين المتنية فيما يتعلق بمسارات الإشارات المختلفة والأمراض 8,10. ومع ذلك ، فقد اقتصر هذا النهج على استخدام الشرايين المضغوطة11 السليمة و / أو مستحضرات الشرايين الشعرية المتنية (CaPA)12. لم يتم فحص الخلايا البطانية الشريانية الدماغية الأصلية المعزولة حديثا والخالية من أنواع الخلايا الأخرى والعوامل المربكة ، على الأرجح بسبب الصعوبات التقنية في عزلها. تقدم هذه الورقة تقنية سابقة تسلط الضوء على عزل البطانة الشريانية13 حتى الآن بشكل موثوق ومتكرر عزل بطانة الشرايين المتنية في الدماغ (العرض: ~ 25 ميكرومتر ، الطول: ~ 250 ميكرومتر). تساعد هذه التقنية على تحقيق الدقة المثلى للخلايا المقترنة كهربائيا وكيميائيا في اتجاهها الفردي وشبكاتها الخلوية.

وشملت المسارات الرئيسية المثيرة للاهتمام تفاعل إشارات Ca 2+ داخل الخلايا ([Ca2+]i) وفرط استقطاب إمكانات الغشاء (Vm)14,15 - وهو جزء لا يتجزأ من توسع الأوعية 16 - للسماح للدم بدخول الشعيرات الدموية وتوصيل الأكسجين والمواد المغذية إلى الحمة النشطة 17. تسمح هذه المستحضرات بتسجيلات كهروفسيولوجية في الوقت الفعلي للقنوات الأيونية ، بما في ذلك Ca2 + ، وإمكانات المستقبلات العابرة (TRP) وقنوات K + و / أو التصوير الفلوري للعضيات داخل الخلايا داخل أنابيب الخلايا البطانية في ظروف شبه فسيولوجية. هذه تقنية مناسبة للباحثين المهتمين بالآليات الخلوية الفسيولوجية التي تحكم تحكم تحكم الخلايا البطانية في توصيل تدفق الدم الدماغي إلى حمة الدماغ. وإجمالا، ستساعد هذه التقنية الباحثين على فهم مسارات الإشارات البطانية الأساسية والتواصل الشبكي للشرايين المضمنة في حمة الدماغ بشكل أفضل أثناء معالجة الأسئلة المتعلقة بفسيولوجيا الأوعية الدموية الدماغية وعلم الأمراض.

Protocol

يجب على المجربين التأكد من أن الاستخدام المعين للحيوانات والبروتوكولات المرتبطة بها تتم الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) ويتم تنفيذه وفقا ل دليل رعاية واستخدام المختبر الصادر عن المجلس الوطني للبحوث (الطبعة 8 ، 2011) وإرشادات ARRIVE. وافقت IACUC من جامعة لوما ليندا وجامعة أريزونا على جميع البروتوكولات المستخدمة لهذه المخطوطة للفئران C57BL/6N و 3xTg-AD (الذكور والإناث ؛ الفئة العمرية: 2-30 شهرا). انظر الشكل 1 كنظرة عامة على عزل وفحص الأنابيب البطانية الشريانية المعزولة حديثا من الشرايين المتنية للفئران في الدماغ.

1. المواد والمعدات

ملاحظة: راجع جدول المواد للاطلاع على جميع الكواشف والمواد المطلوبة لهذا البروتوكول . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا الرجوع إلى الأدلة والمواقع الشبكية المرتبطة بالبائعين المعنيين حسب الحاجة. وقد سبق تقديم رسوم توضيحية لمحطات التشريح والأجهزة التجريبية13.

  1. غرفة التدفق
    1. اربط غرفة فائقة الاندماج بغطاء زجاجي على منصة مكونة من الألومنيوم المؤكسد. قم بتأمين المنصة مع الغرفة على مسرح مجهر الألومنيوم.
    2. قم بتعيين مناور دقيق يحمل ماصة تثبيت في كل طرف من أطراف المنصة على مرحلة مجهر الألومنيوم.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم جهاز مرحلة قابل للنقل مع وحدة غرفة تدفق لنقل أنبوب بطاني آمن ومعزول من جهاز مجهر إلى آخر لإجراء التجارب.
  2. المجاهر
    1. استخدم المجاهر المجسمة (نطاق التكبير من 5x إلى 50x) ومصادر ضوء الألياف البصرية لإجراءات التشريح.
    2. لعزل الأنابيب البطانية، استخدم جهاز مجهر مقلوب مجهز بأهداف متوافقة مع تباين الطور أو تباين التداخل التفاضلي (DIC) (10x و 20x و 40x) ومرحلة من الألومنيوم.
    3. اجعل وحدة التحكم في مضخة المحاقن الدقيقة جاهزة بجوار الجهاز المخصص لعزل الأنابيب البطانية عن الأوعية الدموية المهضومة جزئيا.
    4. قم بإعداد الجهاز التجريبي عن طريق ترتيب مجهر مقلوب (الأهداف: 4x و 10x و 20x و 40x و 60x) ومرحلة ألومنيوم يدوية على طاولة عزل الاهتزاز.
  3. معدات تسجيل Vm داخل الخلايا
    1. قم بتوصيل المقياس الكهربائي بمنضدة رأس متوافقة. استخدم الملحقات، مثل مولد الوظائف والمحفز، للبروتوكولات التي تتطلب الحقن الحالي.
    2. قم بتوصيل مخرجات مكبر الصوت بنظام رقمنة البيانات ومنظار الذبذبات وشاشات خط الأساس المسموعة. قم بتأمين قطب الحمام المرجعي (حبيبات Ag/AgCl) بالقرب من مخرج غرفة التدفق.
    3. قم بتجميع نظام ضوئي مع مكونات متكاملة من واجهة نظام التألق ، ومصباح قوس عالي الكثافة ومصدر طاقة ، و hyperswitch ، وأنبوب مضاعف ضوئي (أو PMT) ، وكاميرا لقياس [Ca2 +] i في الخلايا البطانية.
    4. قم بتجميع وحدة تحكم في درجة الحرارة مزودة بسخان مضمن لرفع درجة حرارة فسيولوجية (37 درجة مئوية) والحفاظ عليها طوال التجربة.
    5. قم بتجميع منصة متعددة القنوات متصلة بوحدة تحكم في الصمام مع صمام تحكم في التدفق مضمن للتحكم في توصيل الحلول إلى الأنابيب البطانية المثبتة في الغرفة.
  4. الماصات الدقيقة والأقطاب الكهربائية الحادة
    ملاحظة: سيحتاج المجرب إلى مجتذب زجاجي إلكتروني و microforge لإعداد ماصات التتبع وتثبيتها.
    1. لفصل الأنبوب البطاني عن الجزء الشرياني المهضوم جزئيا ، قم بإعداد ماصات ثلاثية مصقولة بالحرارة (قطر الطرف الداخلي: 30-50 ميكرومتر) من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات.
    2. لتأمين الأنبوب البطاني في غرفة الاندماج الفائق ، قم بإعداد ماصات تثبيت مصقولة بالحرارة بنهاية كروية حادة (القطر الخارجي: 50-70 ميكرومتر) محضرة من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكية رقيقة الجدار.
    3. لتسجيل Vm لخلية بطانية ، قم بإعداد أقطاب كهربائية حادة بمقاومة طرف ~ 150 ± 30 MΩ من الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب الزجاج فقط.

2. المحاليل والأدوية

  1. محلول الملح الفسيولوجي (PSS)
    1. قم بإعداد ما لا يقل عن 1 لتر من PSS باستخدام 140 mM NaCl و 5 mM KCl و 2 mM CaCl 2 و 1 mM MgCl 2 و 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) و 10 mM glucose.
    2. قم بإعداد الحلول اللازمة التي تفتقر إلى CaCl2 (صفر Ca2 + PSS) لتشريح الشرايين الدماغية وعزل الأنبوب البطاني.
      ملاحظة: قم بإعداد جميع المحاليل في H2O منزوع الأيونات فائق النقاء، متبوعا بالترشيح (0.22 ميكرومتر). تأكد من أن المنتج النهائي يحتوي على درجة حموضة 7.4 مع أسمولية بين 290 و 300 mOsm.
  2. ألبومين مصل البقر (BSA ، 10٪)
    1. قم بإذابة 1 غرام من مسحوق BSA المجفف بالتجميد في كوب من 10 مل من صفر Ca2 + PSS. قم بتغطية الكأس واترك 2 ساعة على الأقل مع التحريك البطيء حتى يذوب BSA.
    2. حل مرشح باستخدام حقنة 10 مل بالإضافة إلى مرشح 0.22 ميكرومتر وإعداد 1 مل aliquots ليتم تخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. حل التشريح
    1. أضف 500 ميكرولتر من BSA (10٪) إلى 49.5 مل من صفر Ca2 + PSS لحجم إجمالي قدره 50 مل.
    2. نقل الحل إلى طبق بتري لتشريح الشرايين.
  4. حل التفكك
    1. أضف 5 ميكرولتر من محلول CaCl 2 (1 M) و 500 ميكرولتر من BSA (10٪) إلى 49.5 مل من صفر Ca2 + PSS لحجم إجمالي قدره 50 مل. حضانة الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
  5. الانزيمات
    1. تحضير 1 مل من محلول الهضم مع 100 ميكروغرام / مل غراء ، 170 ميكروغرام / مل ثنائي ثيوريثريتول ، 250 ميكروغرام / مل كولاجيناز (مزيج من النوع H) ، و 40 ميكروغرام / مل إيلاستيز.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف أنشطة الإنزيم ، على الرغم من أن البروتوكولات الناجحة من المحتمل أن تتطلب الأنشطة الأنزيمية التالية: ≥ 10 وحدات / ملغ للغراء ، ≥ 1 وحدة / ملغ للكولاجيناز ، و ≥ 5 وحدات / ملغ للإيلاستيز.
  6. Fura-2 والعوامل الدوائية
    1. تحضير مخزون Fura-2 AM في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO ؛ 1 mM). تحضير 500 ميكرولتر من تركيز العمل (10 ميكرومتر) عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من المخزون إلى 495 ميكرولتر من PSS للتحميل.
    2. تحضير ما لا يقل عن 50 مل من تركيزات العمل من العوامل الدوائية في PSS أو DMSO حسب الاقتضاء.
  7. إجراء الحل
    1. تحضير 2M KCl عن طريق إذابة KCl في H 2 O منزوعالأيونات (7.455 g من KCl في 50 مل من H2O). مرر المحلول عبر حقنة بمرشح 0.22 ميكرومتر قبل ردم الأقطاب الكهربائية الحادة.
  8. أجهزة تتبع العضيات الفلورية والأجسام المضادة
    1. قم بإعداد غشاء البلازما أو الأورجانيلار (على سبيل المثال ، النواة ، الشبكة الإندوبلازمية) في محلول ملحي فسيولوجي مناسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. تحضير الأجسام المضادة الأولية والثانوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في محلول الملح الفسيولوجي المناسب.

3. تشريح وعزل الشرايين الدماغية للفئران

ملاحظة: يجب استخدام المجاهر المجسمة وأدوات التشريح المجهري الحادة (على سبيل المثال ، ملقط ذو رأس دقيق ، ومقص تشريح على غرار فاناس) لتكبير العينة (حتى 50x) في جميع إجراءات التشريح هذه.

  1. عزل دماغ الفأر
    1. تخدير فأر مختبر قياسي (على سبيل المثال ، C57BL / 6 ، 3xTg-AD ؛ 2-30 شهرا ، ذكرا أو أنثى) باستخدام استنشاق الأيزوفلوران (3٪ لمدة 2-3 دقائق) ، يليه قطع الرأس الفوري باستخدام مقص حاد أو مقصلة وفقا لموافقة IACUC. ضع رأس الماوس في طبق بتري (قطره 10 سم ، عمقه 1.5 سم) يحتوي على محلول تشريح بارد (4 درجات مئوية).
    2. أثناء المشاهدة تحت المجهر المجسم، قم بإزالة الجلد والشعر فوق الجمجمة واغسل الدم الزائد بمحلول تشريح بارد. باستخدام أطراف مقص التشريح القياسي (على سبيل المثال ، شفرات 24 مم) ، قم بعمل شق يبدأ بالعظم القذالي ويمتد عبر عظم الأنف في الجمجمة. استخدم ملقط ذو رأس خشن لفتح الجمجمة بعناية على طول الشق ، وفصل النسيج الضام (الغشاء السحائي) لعزل الدماغ الذي يحتوي على دائرة ويليس سليمة.
    3. اغسل الدماغ المعزول بمحلول تشريح بارد في كوب أو طبق بتري لإزالة الدم المتبقي من سطح الدماغ. ضع الجانب البطني للدماغ متجها لأعلى في غرفة تحتوي على محلول تشريح بارد لعزل الشرايين المتنية (الشكل 2A).
  2. عزل الشرايين المتنية
    ملاحظة: يتم اختيار الشرايين الناشئة عن الشرايين الدماغية الوسطى (MCAs) والمدمجة في حمة الدماغ لهذا البروتوكول. يتم عزل الشرايين كما هو موضح سابقا11 ، مع تعديل.
    1. استخدم دبابيس فولاذية (قطرها: 0.2 مم، طولها: 11 إلى 12 مم) لتأمين الدماغ المعزول في محلول تشريح بارد في طبق بتري يحتوي على طلاء بوليمر السيليكون المشبع بالفحم (العمق ≥ 50 سم).
    2. باستخدام مقص تشريح حاد ومحاذاة ، قم بقطع مستطيل من أنسجة المخ (الطول: 5 مم ، العرض: 3 مم) (الشكل 2B) حول MCA مع التأكد من أن الجزء العلوي من جزء الأنسجة يتجاوز نقطة التفرع من دائرة ويليس. قطع مستطيل آخر من أنسجة المخ من نصف الكرة الآخر من الدماغ للوصول إلى المزيد من الشرايين إذا لزم الأمر.
    3. قم بتأمين جزء أنسجة المخ المنفصلة في الطبق مع توجيه MCA لأعلى (بعيدا عن دائرة ويليس) باستخدام دبابيس فولاذية (قطر: 0.1 مم ، طول: 13 إلى 14 مم). قم بعمل شق ضحل بعناية بالقرب من المسامير لإزالة pia باستخدام ملقط صغير ، مع تقشير بلطف من أحد الطرفين نحو الطرف الآخر (الشكل 2C). قم بإزالة pia من جزء الأنسجة الآخر للوصول إلى المزيد من الشرايين إذا لزم الأمر. قم بتأمين pia المعزولة بعناية مع الشرايين المتنية المتفرعة من MCA في الطبق مع المسامير ، وتشريح الشرايين المتنية (الشكل 2D) ، وضمان عدم تلف الشرايين.
      ملاحظة: إذا لم يتم سحب الشرايين بسهولة باستخدام pia من الحمة ، فاستخدم ملقط ناعم وحفر في الدماغ ، بدءا من نقطة فرع MCA من دائرة ويليس. حدد موقع الشريان، وقم بفك الأنسجة حول الشرايين بعناية (الشكل 2E)، واسحب الشرايين برفق من الحمة، مع الاحتفاظ بالطرف العلوي من الشريان (الشكل 2F). يمكن عزل الشرايين المتعددة (الطول: ~ 1.5-2 مم) من مستطيل واحد من أنسجة المخ.
    4. تأكد من نظافة الشرايين مع عدم وجود أنسجة متصلة بها ، وقطع أي فروع بعيدة متبقية (الشكل 3A). استخدم هذا الشريان النظيف والسليم للهضم الإنزيمي. بدلا من ذلك ، قم بقطع كل شريان إلى قطعتين (الطول: 0.75-1 مم) للهضم الأنزيمي لإعداد الأنابيب البطانية إذا رغبت في ذلك.

4. هضم الشرايين المتنية وإعداد الأنابيب البطانية

  1. ترتيب المعدات والماصات
    ملاحظة: تم وصف عزل الأنابيب البطانية الشريانية عن الدماغ سابقا13,18. يتضمن البروتوكول الحالي تعديلات لعزل البطانة عن الشرايين المتنية (داخل المخ). يمكن استخدام الشرايين المتعددة و / أو قطع من الشرايين معا للهضم الإنزيمي.
    1. قم بتجميع جهاز التريتورات13 لإعداد الأنابيب البطانية باستخدام مرحلة من الألومنيوم تدعم الغرفة والمتلاعبين الدقيقين. قم بتجميع مجهر مجهز بالأهداف (5x-60x) وكاميرا متصلة بشاشة كمبيوتر. قم بتأمين حقنة دقيقة باستخدام وحدة تحكم في المضخة بجوار المرحلة والعينة.
    2. قم بتأمين ماصة ثلاثية مملوءة بالزيت المعدني فوق مكبس المحقنة الدقيقة. استخدم المحقنة الدقيقة مع وحدة تحكم المضخة لسحب محلول التفكك إلى ماصة التحلل (~ 130 نانولتر) فوق الزيت المعدني مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء في الماصة.
  2. الهضم الجزئي لشرائح الشرايين
    1. ضع شرائح شريانية سليمة في 1 مل من محلول التفكك في أنبوب زجاجي سعة 10 مل يحتوي على غراء 100 ميكروغرام / مل غراء ، و 170 ميكروغرام / مل ثنائي ثيوريثريتول ، و 250 ميكروغرام / مل كولاجيناز ، و 40 ميكروغرام / مل إيلاستيز. احتضان شرائح الشرايين عند 34 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة.
    2. بعد الهضم ، استبدل محلول الإنزيم ب 3-4 مل من محلول التفكك الطازج في درجة حرارة الغرفة.
  3. عزل الأنبوب البطاني الشرياني
    ملاحظة: بعد هضم محلول الإنزيم واستبداله، قم بنقل جزء واحد أو عدة أجزاء مهضومة جزئيا إلى محلول التفكك في غرفة اندماج فائق متصلة بمنصة متنقلة. أثناء العرض عند تكبير 100x إلى 200x ، حدد جزءا من الأوعية مهضومة جزئيا ولكن غير منقطعة وركز عليه تحت المجهر.
    1. ضع ماصة التريتورات المرفقة بحاقن المحقنة الدقيقة في محلول التفكك في الغرفة وضعها بالقرب من أحد طرفي جزء الوعاء المهضوم. اضبط معدلا ضمن نطاق 1-3 نانولتر/ثانية على وحدة تحكم المضخة لإجراء عملية سحب لطيفة.
    2. مع الحفاظ على تكبير 100x إلى 200x ، اسحب الجزء الشرياني إلى الماصة ثم اخرج لفصل adventitia وخلايا العضلات الملساء (الشكل 3B). قم بتثليث جزء الوعاء حتى يتم فصل جميع خلايا العضلات الملساء ، وتبقى الخلايا البطانية فقط ك "أنبوب" سليم.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر أثناء التثليث، استخدم بعناية ملقط ذو رؤوس دقيقة لإزالة الغدة الدرقية المنفصلة والصفيحة المرنة الداخلية من الأنبوب البطاني. عادة ، لا ينتج سوى بضع دورات من التريتورات أنبوب بطاني سليم.
    3. استخدم أجهزة المعالجة الدقيقة لتأمين كل طرف من الأنبوب البطاني على الغطاء الزجاجي في الغرفة باستخدام ماصات تثبيت زجاجية من البورسليكات (الشكل 3C ، D).
  4. تأمين الأنبوب البطاني الشرياني
    1. استبدل محلول التفكك بمحلول الانصهار الفائق (PSS الذي يحتوي على 2 mM CaCl2) مع ضمان غسل المواد غير البطانية خارج الغرفة.
    2. انقل الأنبوب البطاني الآمن في المنصة المتنقلة إلى جهاز المجهر المصمم للاندماج الفائق المستمر والتسجيلات / التصوير داخل الخلايا أو الفلورسنت.
    3. تطبيق التسليم المستمر ل PSS أثناء التجربة. اضبط معدل التدفق يدويا (5-7 مل / دقيقة) طوال التجربة باستخدام صمام التحكم في التدفق المضمن ، بما يتفق مع التدفق الرقائقي ، مع مطابقة تغذية تدفق المحلول إلى حد شفط الفراغ. اسمح ≥5 دقيقة من تدفق PSS إلى الغرفة للاندماج الفائق للأنبوب البطاني قبل الحصول على بيانات الخلفية و / أو تحميل الصبغة.

5. استخدام الأنابيب البطانية الشريانية لفحص الفسيولوجيا الخلوية

ملاحظة: يمكن استخدام الأنابيب البطانية الشريانية المعزولة والآمنة للتسجيلات داخل الخلايا لديناميات [Ca2+] i و Vm باستخدام القياس الضوئي والفيزيولوجيا الكهربية للأقطاب الكهربائية الحادة ، على التوالي ، كما هو موضح سابقا13 (الشكل 4). [كاليفورنيا2+] يمكن قياس i و Vm كمتغيرات تجريبية منفصلة أو مجتمعة حسب الحاجة13 (الشكل 4). ومع ذلك ، فإن الأنابيب البطانية الشريانية أكثر حساسية من البطانة الشريانية ، ويجب ألا يتجاوز وقت التجريب 1 ساعة.

  1. قياس [Ca2+]i
    1. قم بتشغيل المعدات والبرامج الخاصة بتسجيلات [Ca2+] i مع الحفاظ على الاندماج الفائق المستمر بمعدل تدفق يتراوح بين 5 و7 ملليلتر/دقيقة.
    2. قم بتحميل الأنبوب البطاني بصبغة Ca2+ Fura-2 AM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا بمحلول الانصهار الفائق لمدة 20-30 دقيقة أخرى مع رفع درجة حرارة الحمام تدريجيا إلى 37 درجة مئوية. حافظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية طوال التجربة.
    3. اضبط نافذة التصوير يدويا باستخدام برنامج القياس الضوئي للتركيز على ~ 20 خلية بطانية (الشكل 4A). في غياب الضوء ، قم بتشغيل PMT على واجهة التألق وابدأ في الحصول على [Ca2+] i بواسطة Fura-2 المثير بالتناوب (≥10 هرتز) عند 340 نانومتر و 380 نانومتر أثناء جمع انبعاثات التألق عند 510 نانومتر. بمجرد إنشاء تسجيل خط أساس مستقر ل [Ca2+]i ، قم بتطبيق العوامل الدوائية (على سبيل المثال ، ناهضات مستقبلات البيورين) لكل هدف تجريبي (الشكل 4B).
  2. قياس Vm
    1. قم بتشغيل المعدات والبرامج الخاصة بتسجيلات Vm واضبط معدل الحصول على البيانات (≥10 هرتز) مع الحفاظ على الاندماج الفائق المستمر بمعدل تدفق يتراوح بين 5-7 مل / دقيقة. ارفع درجة حرارة الحمام تدريجيا إلى 37 درجة مئوية وحافظ عليها حتى نهاية التجربة.
    2. اسحب قطبا كهربائيا حادا باستخدام شعيرات شعرية زجاجية من البورسليكات ، وردم ب 2 M KCl ، وقم بتثبيته فوق سلك فضي مطلي بالكلوريد في حامل الماصة المتصل بمقياس كهربائي ، والذي بدوره يتم الاحتفاظ به بواسطة جهاز مناور دقيق.
    3. أثناء المشاهدة من خلال هدف 4x ، استخدم micromanipulator لوضع طرف القطب الحاد بعناية فوق خلية من الأنبوب البطاني الشرياني في PSS المتدفق في الغرفة.
    4. قم بزيادة التكبير تدريجيا إلى 400x وقم بتغيير موضع طرف القطب حسب الحاجة.
    5. باستخدام المتلاعب الدقيق ، أدخل بلطف طرف قطب كهربائي حاد في إحدى خلايا الأنبوب البطاني وابدأ في تسجيل Vm باستخدام مقياس كهربائي (الشكل 4A).
    6. بمجرد أن يكون السكون البطاني Vm مستقرا (-30 إلى -40 mV) ، قم بتطبيق العوامل الدوائية المطلوبة لكل هدف تجريبي (الشكل 4C).

6. التصوير الخلوي

ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأنابيب البطانية المثبتة في غرفة المنصة المتنقلة للتصوير المجهري في كل من الظروف الحية والثابتة19 باستخدام التألق القياسي أو المجهر البؤري. يمكن أيضا تطبيق الكيمياء النسيجية المناعية مع الأجسام المضادة المختلفة للمستقبلات والقنوات الأيونية كما هو موضح سابقا20.

  1. قم بتحميل الأنبوب البطاني بمتعقب التألق لغشاء البلازما أو العضية المطلوبة (على سبيل المثال ، النواة ، الشبكة الإندوبلازمية) عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة.
  2. اغسل الخلايا باستخدام PSS الفائق الطازج وصور الخلايا الحية تحت المجهر عند الطول الموجي المثير للأصباغ المعنية (الشكل 4D ، E).
    ملاحظة: يمكن إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على نموذج الأنبوب هذا باستخدام الأجسام المضادة ذات الأهمية.

النتائج

يظهر عرض توضيحي للبروتوكول في الشكل 1 مع خطوات تشريح الشرايين وعزل الأنبوب البطاني في الشكل 2 والشكل 3 ، على التوالي. هنا ، تم تقييم الوظيفة البطانية عن طريق قياس [Ca 2 +] i و Vm باستخدام القياس الضوئي Fura-2 والفيزيولوجيا الكهربية الحادة...

Discussion

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الأمراض الدماغية الوعائية (CVD) والشيخوخة ومرض الزهايمر مرتبطة ارتباطا وثيقا وهي موضوع حالي لأبحاث الخرف4،8،14،21. وبالتالي ، من الواضح أن دراسات الشبكة الدماغية الوعائية سيكون لها تأثير واسع ...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R00AG047198 & R56AG062169 إلى EJB; R00HL140106 إلى PWP) وجمعية الزهايمر (AZRGD-21-805835 إلى PWP). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة أو جمعية الزهايمر.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifiersMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitorsAmpol US LLC, Sarasota, FL, USA BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)Warner InstrumentsG150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)Warner InstrumentsGC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
BSA: Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
CaCl2: Calcium ChlorideSigma223506
Collagenase (Type H Blend)SigmaC8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Data Acquision DigitizerMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USADigidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USADD-90-S-BLK
DithioerythritolSigmaD8255
DMSO: Dimethyl SulfoxideSigmaD8418
Elastase (porcine pancreas)SigmaE7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)ThermoFisher ScientificE34250
Fiber optic light sources Schott, Mainz, Germany & KL200, ZeissFostec 8375
Flow Control ValveWarner Instruments FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMTMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAIonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)FSTDumont #5 & Dumont #55
Function GeneratorEZ Digital, Seoul, South KoreaFG-8002
Fura-2 AM dyeInvitrogen, Carlsbad, CA, USAF14185
GlucoseSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)G7021
HCl: Hydrochloric AcidThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)A466250
HeadstagesMolecular DevicesHS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)SigmaH4034
Inline Solution HeaterWarner InstrumentsSH-27B
KCl: Potassium ChlorideSigmaP9541
MgCl2: Magnesium ChlorideSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, USA MF-900
MicromanipulatorSiskiyou MX10
Micropipette puller (digital)Sutter Instruments, Novato, CA, USAP-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USATs2
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments IncEclipse TS100
Microscope objectivesNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)Warner InstrumentsPM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)Siskiyou, Grants Pass, OR, USA8090P
Microsyringe Pump ControllerWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium saltTocris1624
NaCl: Sodium ChlorideSigmaS7653
NaOH: Sodium HydroxideSigmaS8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)ThermoFisher ScientificR37605
OscilloscopeTektronix, Beaverton, Oregon, USA TDS 2024B
PapainSigmaP4762
Phase contrast objectivesNikon Instruments Inc (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)ThermoFisher ScientificC10046
Plexiglas superfusion chamberWarner Instruments, Camden, CT, USARC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USAMoria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)World Precision Instruments555640S, 14364
StereomicroscopesZeiss, NY, USAStemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)ThermoFisher Scientific722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)Warner InstrumentsTC-344B or C
Valve Control SystemWarner InstrumentsVC-6
Vibration Isolation TableTechnical Manufacturing, Peabody, MA, USA Micro-g

References

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181 Ca2 K

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved