小鼠脑实质小动脉内皮的分离及功能分析

摘要

来自脑实质小动脉的完整小鼠脑内皮"管"的强化制备用于研究脑血流调节。此外，我们证明了这种内皮研究模型在荧光成像和关键细胞信号通路的电生理学测量方面的实验优势，包括细胞内[Ca^{2 +}]和膜电位的变化。

摘要

脑血流通过血管阻力动脉和下游实质小动脉输送。稳态血管对血流的阻力随着从动脉到最终进入毛细血管的小动脉直径减小而增加。由于它们在实质中较小的尺寸和位置，小动脉的研究相对不足，并且与表皮动脉相比，其结果的可重复性较低。无论如何，小动脉内皮细胞结构和功能是慢性退行性疾病生理学和病因学不可或缺的一部分，需要广泛的研究。特别是，新出现的证据表明，内皮功能受损先于并加重认知障碍和痴呆。

在实质微循环中，内皮K⁺ 通道功能是精细控制血管舒张扩散以促进流向神经元活动区域血流的增加的最强大的刺激。本文说明了一种从小鼠脑实质小动脉中新鲜分离完整和电耦合的内皮"管"（直径，〜25μm）的改进方法。在生理条件下（37°C，pH 7.4）固定小动脉内皮管，以解析包含K ⁺ 通道功能及其调节的实验变量，包括细胞内Ca^{2 +} 动力学，膜电位变化和膜脂质调节。与动脉内皮相比，一个明显的技术优势是增强了细胞和细胞器（例如线粒体）尺寸的形态学分辨率，这扩大了该技术的实用性。终生健康的脑灌注需要实质小动脉的强大内皮功能，直接将血液流动与大脑精确解剖区域的神经元和神经胶质活动提供燃料联系起来。因此，预计这种方法将显着推进有关健康和患病大脑的血管生理学和神经科学的一般知识。

引言

实质小动脉直接在整个大脑中输送必需的氧气和营养物质¹.在与毛细血管连接时，高度血管活性的小动脉对由毛细血管离子通道启动的逆行信号作出反应，这些通道感知来自特定神经元区域的代谢信号²。由于脑实质历来接受了大部分研究，内皮功能障碍在阐明与痴呆症（例如缺血性卒中，阿尔茨海默病）相关的各种脑血管疾病（例如缺血性卒中，阿尔茨海默病）的病理机制方面已经出现的作用^{3，4，5，6}.内皮是大脑灌注的组成部分，符合整个血管节段的遗传学，结构和功能的异质性⁷。Pial动脉由于其相对较大的尺寸，高节段血管阻力以及在向下层大脑的血流分布中的作用^8，9，已被广泛研究。因此，更好地了解小动脉内皮机制可能会增强对健康和疾病中脑血流调节的理解，以开发新的治疗方案。

新出现的证据强调了研究实质小动脉与不同信号通路和疾病的关系的重要性^8，10。然而，这种方法仅限于使用完整的加压小动脉¹¹ 和/或毛细血管 - 实质小动脉（CaPA）制剂¹²。尚未检查新鲜分离的天然脑小动脉内皮细胞，这可能是由于分离的技术困难。本文推进了先前的技术，突出了pial动脉内皮¹³ 的分离，现在可靠且可重复地分离脑实质小动脉的内皮（宽度:〜25μm，长度:〜250μm）。该技术有助于在电耦合和化学耦合细胞的个体方向和细胞网络中实现最佳分辨率。

感兴趣的关键途径包括细胞内Ca^{2 +}（[Ca^{2 + ]}_i）信号传导和膜电位（V_m）^14，15的超极化 - 血管舒张¹⁶的组成部分 - 允许血液进入毛细血管并将氧气和营养物质输送到活动性实质¹⁷。这些制剂允许对离子通道进行实时电生理学记录，包括Ca^{2 +}通透性，瞬时受体电位（TRP）和K ⁺通道和/或在近生理条件下内皮细胞管内细胞器的荧光成像。对于对控制内皮细胞控制脑血流输送到脑实质的生理细胞机制感兴趣的研究人员来说，这是一种合适的技术。总而言之，这项技术将帮助研究人员更好地了解嵌入脑实质的小动脉的基本内皮信号通路和网络通信，同时解决与脑血管生理学和病理学相关的问题。

研究方案

实验人员应确保动物的指定使用和相关协议得到其机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并按照国家研究委员会的"实验动物护理和使用指南"（^第 8版，2011年）和ARRARD指南进行。Loma Linda大学的IACUC和亚利桑那大学已经批准了用于C57BL / 6N和 3xTg-AD 小鼠（雄性和雌性;年龄范围:2-30个月）的所有手稿方案。参见 图1 作为从小鼠脑实质小动脉新鲜分离的小动脉内皮管的分离和检查的概述。

1. 材料和设备

注:参见 材料表， 了解本方案所需的所有试剂和材料。此外，还可以根据需要查阅与相应供应商相关的手册和网站。解剖站和实验装置的插图先前已提供¹³。

1. 流动室
   1. 用玻璃盖玻片将超聚变室固定在由阳极氧化铝组成的平台上。将带有腔室的平台固定在铝制显微镜载物台上。
   2. 在铝显微镜载物台上，在平台的两端设置一个显微操作器，固定一个固定移液器。
      注意:如有必要，请使用带有流动室单元的可转移载物台设备将安全，隔离的内皮管从一个显微镜设备移动到另一个显微镜设备进行实验。
2. 显微镜
   1. 使用立体显微镜（5x至50x放大倍率范围）和光纤光源进行解剖手术。
   2. 为了隔离内皮管，请使用配备相差或差分干涉对比（DIC）兼容物镜（10x，20x和40x）和铝载物台的倒置显微镜装置。
   3. 在专用于将内皮管与部分消化的血管隔离的装置旁边准备好一个微量注射器泵控制器。
   4. 通过在隔振台上布置倒置显微镜（物镜:4x，10x，20x，40x和60x）和手动铝载物台来设置实验装置。
3. 细胞内V_m 记录设备
   1. 将静电计连接到兼容的头台。使用附件（如函数发生器和激励器）进行需要电流注入的协议。
   2. 将放大器输出连接到数据数字化仪系统、示波器和可听基线监视器。将参比浴电极（Ag/AgCl 沉淀）固定在流动室出口附近。
   3. 组装一个光度测量系统，其中包含荧光系统接口，高强度弧光灯和电源，超开关，光电倍增管（或PMT）和相机的集成组件，以测量内皮细胞中的[Ca^{2 +} _]i 。
   4. 组装一个配备在线加热器的温度控制器，以在整个实验过程中提高并保持生理温度（37°C）。
   5. 组装一个连接到阀门控制器的多通道平台，带有在线流量控制阀，以控制溶液向固定在腔室中的内皮管的输送。
4. 微量移液器和尖锐电极
   注意:实验者将需要一个电子玻璃拉拔器和一个微锻造机来准备研磨和固定移液器。
   1. 为了将内皮管与部分消化的小动脉段分离，从硼硅酸盐玻璃毛细管中制备热抛光研磨移液管（内尖直径:30-50μm）。
   2. 为了将内皮管固定在超融合室中，制备由薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管制备的钝球形末端（外径:50-70μm）的热抛光销式移液器。
   3. 为了记录内皮细胞的V_m ，仅使用玻璃拉拔器从玻璃毛细管制备尖端电阻约为150±30 MΩ的尖锐电极。

2. 解决方案和药物

1. 生理盐溶液
   1. 使用140mM NaCl，5mM KCl，2 mM CaCl₂，1 mM_MgCl 2，10 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）和10mM葡萄糖制备至少1 L PSS。
   2. 准备缺乏CaCl₂ （零Ca^{2 +} PSS）的必要溶液，用于解剖脑小动脉和隔离内皮管。
      注意:在超纯去离子H₂O中制备所有溶液，然后过滤（0.22μm）。确保最终产品的pH值为7.4，渗透压在290至300 mOsm之间。
2. 牛血清白蛋白（BSA，10%）
   1. 将1克冻干BSA粉末溶解在10mL零Ca^{2 +} PSS的烧杯中。盖上烧杯，缓慢搅拌至少2小时，使BSA溶解。
   2. 使用10 mL注射器加0.22μm过滤器过滤溶液，并制备1mL等分试样以储存在-20°C。
3. 解剖液
   1. 将 500 μL BSA （10%） 加入 49.5 mL 零 Ca²⁺ PSS 中，总体积为 50 mL。
   2. 将溶液转移到培养皿中进行小动脉夹层。
4. 解离解决方案
   1. 将5μL氯化钙₂溶液（1 M）和500μLBSA（10%）加入49.5mL零Ca^{2 +} PSS中，总体积为50mL。将溶液在室温下孵育至少1小时。
5. 酶
   1. 用100μg/ mL木瓜蛋白酶，170μg/ mL二硫代赤藓糖醇，250μg/ mL胶原酶（H型混合物）和40μg/ mL弹性蛋白酶制备1mL消化溶液。
      注意:酶活性可能会有所不同，尽管成功的方案可能需要以下酶活性:木瓜蛋白酶≥10单位/mg，胶原酶≥1单位/mg，弹性蛋白酶≥5单位/mg。
6. 呋喃-2和药理剂
   1. 在二甲基亚砜（DMSO;1 mM）中制备Fura-2 AM储备。通过将5μL储备液加入495μLPS中以加载来制备500μL工作浓度（10μM）。
   2. 根据需要准备至少50 mL工作浓度的PSS或DMSO中的药理剂。
7. 传导解决方案
   1. 通过将KCl溶解在去离子的H₂O中（7.455g KCl在50mL H 2 O中）来制备_2MKCl。在回填尖锐电极之前，将溶液通过带有0.22μm过滤器的注射器。
8. 荧光细胞器跟踪仪和抗体
   1. 根据制造商的说明，在适当的生理盐水溶液中制备质膜或有机体（例如，细胞核，内质网）跟踪器。
   2. 根据制造商的说明在适当的生理盐溶液中制备一抗和二抗。

3.小鼠脑小动脉的解剖和分离

注意:在所有这些解剖手术中，必须使用立体显微镜和锐化显微切割工具（例如，细尖镊子，Vannas式解剖剪刀）进行标本放大倍率（高达50倍）。

1. 小鼠大脑的隔离
   1. 使用吸入异氟醚（3%，持续 2-3 分钟）麻醉标准实验室小鼠（例如 C57BL/6， 3xTg-AD;2-30 个月大，男性或雌性），然后根据 IACUC 批准，使用锋利的剪刀或断头台立即斩首。将小鼠头置于含有冷（4°C）解剖溶液的培养皿（直径10厘米，深度1.5厘米）中。
   2. 在立体显微镜下观察时，去除颅骨上的皮肤和毛发，并用冷解剖液冲洗掉多余的血液。使用标准解剖剪刀的尖端（例如，24 mm刀片），从枕骨开始，通过颅骨的鼻骨向上延伸，做一个切口。使用粗尖端的镊子沿着切口小心地打开颅骨，并分离结缔组织（脑膜）以分离含有完整威利斯环的大脑。
   3. 在烧杯或培养皿中用冷解剖溶液清洗分离的大脑，以清除大脑表面残留的血液。将脑腹侧朝上放置在含有冷解剖溶液的腔室中，以隔离实质小动脉（图2A）。
2. 实质小动脉的分离
   注意:该方案选择由大脑中动脉（MCAs）引起并嵌入脑实质中的小动脉。如前所述¹¹分离小动脉，并进行修改。
   1. 使用钢针（直径:0.2毫米，长度:11至12毫米）将分离的大脑固定在含有注入木炭的硅聚合物涂层（深度≥50厘米）的培养皿中的冷解剖溶液中。
   2. 使用锋利且对齐的解剖剪刀，在MCA周围切割一个矩形的脑组织（长度:5 mm，宽度:3 mm）（图2B），同时确保组织段的上部超过威利斯圆的分支点。如有必要，从大脑的另一半球切下另一个矩形脑组织，以进入更多的小动脉。
   3. 使用钢销（直径:0.1 mm，长度:13至14 mm）将分离的脑组织段固定到培养皿中，MCA朝上（威利斯圆的远端）。小心地在针脚附近做一个浅切口，用小镊子去除pia，从一端向另一端轻轻剥离（图2C）。如果需要，从其他组织段取出软脑膜以进入更多小动脉。用针在培养皿中小心地用从MCA分支的实质小动脉小心地固定孤立的pia，并解剖实质小动脉（图2D），确保小动脉不受损。
      注意:如果小动脉不容易用软脑从实质上拔出，请使用细镊子并挖掘大脑，从威利斯圈的MCA分支点开始。定位小动脉，小心地松弛小动脉周围的组织（图2E），并轻轻地将小动脉从实质中拉出，保持小动脉的上端（图2F）。可以从一个矩形的脑组织中分离出多个小动脉（长度:~1.5-2 mm）。
   4. 确保小动脉清洁，没有组织附着在它上面，并切断任何剩余的远端分支（图3A）。使用这种干净、完整的小动脉进行酶消化。或者，根据需要将每个小动脉切成两块（长度:0.75-1mm）进行酶消化，以制备内皮管。

4.实质小动脉的消化和内皮管的制备

1. 设备和移液器的布置
   注意:从大脑中分离动脉内皮管之前已经描述了^13，18。目前的方案包括从实质（脑内）小动脉中分离内皮的修改。多个小动脉或/和小动脉碎片可以一起使用进行酶消化。
   1. 组装研磨装置¹³ ，用于制备内皮管，使用铝制阶段支撑腔室和显微操作器。组装配备物镜（5x-60x）的显微镜和连接到计算机监视器的相机。使用载物台和试样旁边的泵控制器固定微量注射器。
   2. 将回填矿物油的研磨移液器固定在微量注射器活塞上。使用带有泵控制器的微量注射器将解离溶液吸入矿物油顶部的研磨移液器（~130 nL），同时注意避免移液器中的气泡。
2. 小动脉段部分消化
   1. 将完整的小动脉段放入1 mL解离溶液中，放入含有100μg/ mL木瓜蛋白酶，170μg/ mL二硫代赤藓糖醇，250μg/ mL胶原酶和40μg/ mL弹性蛋白酶的10mL玻璃管中。在34°C下孵育小动脉段10-12分钟。
   2. 消化后，在室温下用3-4mL新鲜解离溶液代替酶溶液。
3. 小动脉内皮管的隔离
   注意:在酶溶液消化和置换后，将一个或多个部分消化的片段转移到连接到移动平台的超融合室中的解离溶液中。在100x至200x放大倍率下观察时，选择一个部分消化但未断裂的血管段，并在显微镜下聚焦。
   1. 将与微量注射器注射器连接在腔室中的解离溶液中，并将其放置在靠近消化容器段的一端的一端。在泵控制器上将速率设置在 1-3 nL/s 的范围内，以实现轻柔的研磨。
   2. 在保持100x至200x放大倍率的同时，将小动脉段撤回移液管中，然后弹出以解离外翻和平滑肌细胞（图3B）。对血管段进行研磨，直到所有平滑肌细胞解离，只有内皮细胞保持为完整的"管子"。
      注意:如果在磨痂过程中有必要，请小心使用细尖的镊子从内皮管中取出解离的外切和内部弹性层。通常，只有几个周期的磨痂产生完整的内皮管。
   3. 使用显微操作器将内皮管的每一端固定在腔室中的玻璃盖玻片上，使用硼硅酸盐玻璃固定移液器（图3C，D）。
4. 固定小动脉内皮管
   1. 用超融合溶液（含有2mM_{CaCl 2}的PSS）代替解离溶液，同时确保非内皮材料被洗出腔室。
   2. 将移动平台中的固定内皮管转移到专为连续超融合和细胞内或荧光记录/成像而设计的显微镜装置上。
   3. 在实验期间应用 PSS 的持续递送。使用在线流量控制阀在整个实验过程中手动设置流量（5-7 mL/min），与层流一致，同时将溶液流量的进料匹配到真空抽吸的程度。在获取背景数据和/或染料上样之前，允许≥5分钟的PSS流到腔室中以进行内皮管的超灌注。

5.利用小动脉内皮管检查细胞生理学

注意:分离和固定的小动脉内皮管可用于使用光度测定和锐电极电生理学分别用于[Ca^{2 +} ]_i 动力学和V_m 的细胞内记录，如前面所示¹³ （图4）。[钙²⁺]_i 和V_m 可以根据需要作为单独的或组合的实验变量¹³ 进行测量（图4）。但小动脉内皮管比动脉内皮更细腻，实验时间不应超过1 h。

1. [钙²⁺]_{i 的}测量
   1. 打开用于[Ca²⁺]i记录的设备和软件_， 同时以5-7 mL/min的流速保持连续的超融合。
   2. 在室温下用Ca^{2 +} 染料Fura-2 AM加载内皮管30分钟。用超融合溶液再次洗涤细胞20-30分钟，同时逐渐将浴温提高到37°C。 在整个实验过程中将温度保持在37°C。
   3. 使用光度法软件手动调整成像窗口，聚焦约20个内皮细胞（图4A）。在没有光的情况下，打开荧光界面上的PMT并开始通过340nm和380nm处交替激发Fura-2（≥10 Hz）来获取[Ca^{2 +} ]_i ，同时在510nm处收集荧光发射。一旦建立了[Ca²⁺]_i 的稳定基线记录，根据实验目标应用药理学药物（例如，嘌呤能受体激动剂）（图4B）。
2. V_{m 的}测量
   1. 打开用于V_m 记录的设备和软件并设置数据采集速率（≥10 Hz），同时以5-7 mL / min的流速保持连续超融合。逐渐将浴温升高至37°C并保持至实验结束。
   2. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管拉动尖锐的电极，用2 M KCl回填，并将其固定在连接到静电计的移液器支架中涂有氯化物的银丝上，该移液器又由显微操作器固定。
   3. 在通过4x物镜观察时，使用显微操纵器小心地将尖锐的电极尖端定位在小动脉内皮管的细胞上方，进入腔室中流动的PSS。
   4. 逐渐将放大倍率增至400倍，并根据需要重新定位电极尖端。
   5. 使用显微操作器，轻轻地将尖锐电极的尖端插入内皮管的一个细胞中，并使用静电计开始记录V_m （图4A）。
   6. 一旦内皮静息V_m 稳定（−30至−40mV），根据实验目标应用所需的药理药物（图4C）。

6. 细胞成像

注:固定在移动平台腔室中的内皮管也可用于使用标准荧光或共聚焦显微镜在活体和固定条件下的显微成像¹⁹ 。具有针对受体和离子通道的不同抗体的免疫组织化学也可以如前面描述的那样应用²⁰。

1. 在37°C下用质膜或所需细胞器（例如，细胞核，内质网）的荧光跟踪器加载内皮管15-30分钟。
2. 用新鲜的超融合PSS洗涤细胞，并在显微镜下以相应染料的激发波长对活细胞进行成像（图4D，E）。
   注意:可以使用感兴趣的抗体在此管模型上进行免疫组化。

结果

方案的演示如图1所示，小动脉夹层和内皮管分离步骤分别如图2和图3所示。在这里，通过使用Fura-2光度测定法和锐电极电生理学（图4A）测量[Ca^{2 +} ]_i和V_m来评估内皮功能，以响应药理学剂[2-甲基硫代腺苷二磷酸（MTA），一种有效的嘌呤能受体（P2YR）激动剂]在37°C下。 在应用MTA（1μM）...

讨论

越来越多的证据表明，脑血管疾病（CVD），衰老和阿尔茨海默病密切相关，并且是痴呆症研究的当前主题^{4，8，14，21}。因此，很明显，对脑血管网络的研究将对健康产生广泛影响，同时需要在疾病条件下继续进行广泛的调查。作为脑灌注血管阻力的重要点，实质小动脉在CVD的病因和发展中的一般重要?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (porcine pancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potassium Chloride	Sigma	P9541
MgCl2: Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscope objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pump Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibration Isolation Table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g