마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

요약

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [^Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

초록

대뇌 혈류는 혈관 저항성 동맥과 하류 실질 세동맥에 의해 전달된다. 혈류에 대한 정상 상태 혈관 저항은 궁극적으로 모세 혈관으로 공급되는 동맥에서 세동맥까지 직경이 감소함에 따라 증가합니다. 실질의 크기와 위치가 작기 때문에 세동맥은 상대적으로 과소 연구되었으며 표면 경동맥보다 소견에서 재현성이 떨어집니다. 그럼에도 불구하고, 동맥 내피 세포 구조와 기능 - 만성 퇴행성 질환의 생리학 및 병인학에 필수적인 - 광범위한 조사가 필요합니다. 특히, 새로운 증거는 손상된 내피 기능이인지 장애와 치매보다 선행하고 악화된다는 것을 보여줍니다.

실질 미세 순환에서 내피 K ⁺ 채널 기능은 신경 활동 영역으로의 혈류 증가를 촉진하기 위해 혈관 확장의 확산을 미세하게 조절하는 가장 강력한 자극입니다. 이 논문은 마우스 뇌 실질 세동맥으로부터 온전하고 전기적으로 결합된 내피 "튜브"(직경, ∼25 μm)를 신선하게 분리하기 위한 정제된 방법을 예시한다. 동맥 내피 튜브는 생리적 조건 (37°C, pH 7.4) 동안 확보되어 세포내^Ca2+ 역학, 막 전위의 변화 및 막 지질 조절을 포함한 K⁺ 채널 기능 및 그 조절을 포괄하는 실험 변수를 해결합니다. 동맥 내피에 비해 뚜렷한 기술적 이점은 세포 및 소기관 (예를 들어, 미토콘드리아) 치수의 향상된 형태 학적 분해능이며,이 기술의 유용성을 확장시킨다. 평생 동안 건강한 대뇌 관류는 실질 세동맥의 강력한 내피 기능을 수반하며, 혈류를 뇌의 정확한 해부학 적 영역에 걸쳐 신경 및 신경교 활동의 촉진과 직접 연결합니다. 따라서이 방법은 건강하고 병든 뇌에 관한 혈관 생리학 및 신경 과학에 대한 일반적인 지식을 상당히 발전시킬 것으로 예상됩니다.

서문

실질 세동맥은 뇌 전체에 필수 산소와 영양소를 직접 전달합니다¹. 모세혈관과 상호 작용하는 동안, 고도로 혈관 활성 세동맥은 특정 신경 영역으로부터의 대사 신호를 감지하는 모세관 이온 채널에 의해 개시되는 역행 신호전달에 반응한다². 뇌 실질이 역사적으로 많은 조사를 받음에 따라, 치매의 기초가되는 다양한 뇌 혈관 장애 (예 : 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 병)와 관련된 병리학 적 메커니즘을 명확히하기위한 내피 기능 장애의 역할이 등장했습니다.^3,4,5,6 . 내피는 혈관 세그먼트 전반에 걸쳐 유전학, 구조 및 기능의 이질성에 따라 뇌의 관류에 필수적입니다⁷. Pial 동맥은 상대적으로 큰 크기, 높은 분절 혈관 저항성 및 기저 대뇌 ^8,9로의 혈류 분포의 역할로 인해 광범위하게 연구되었습니다. 따라서, 동맥 내피 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 새로운 치료 요법의 개발을 향한 건강 및 질병에서의 뇌 혈류 조절에 대한 이해를 향상시킬 것입니다.

새로운 증거는 다른 신호 전달 경로 및 질병 ^8,10과 관련하여 실질 세동맥을 연구하는 것의 중요성을 강조합니다. 그러나, 이러한 접근법은 무손상 가압된 세동맥(¹¹) 및/또는 모세관-실질 세동맥(CaPA) 제제(¹²)를 사용하는 것으로 제한되었다. 갓 분리된, 다른 세포 유형 및 교란 요인이 결여된 원시적 대뇌 동맥 내피 세포는 그들의 분리에 있어서 기술적인 어려움 때문에 검사되지 않았다. 이 논문은 pial 동맥 내피¹³의 분리를 강조하는 이전 기술을 발전시켜 뇌 실질 세동맥의 내피를 안정적이고 재현 가능하게 분리합니다 (폭 : ~ 25 μm, 길이 : ~ 250 μm). 이 기술은 개별 방향 및 세포 네트워크에서 전기적, 화학적으로 결합 된 세포의 최적 분해능을 달성하는 데 도움이됩니다.

관심의 주요 경로에는 세포 내 Ca2+ ([^Ca2+]_i) 신호 전달의 상호 작용과 혈관 확장에 필수적인 막 전위 (_Vm) 14,15 (혈관 확장에 필수적 임)^14,15의 과분극이 포함되어있어 혈액이 모세 혈관에 들어가고 활성 실질에 산소와 영양소를 전달할 수 있습니다 ¹⁷. 이러한 제제는^Ca2+-투과, TRP(transient receptor potential) 및 K⁺ 채널 및/또는 거의 생리학적 조건에서 내피 세포관 내의 세포내 소기관의 형광 이미징을 포함하는 이온 채널의 실시간 전기생리학적 기록을 허용한다. 이것은 뇌 실질로의 대뇌 혈류 전달의 내피 세포 조절을 지배하는 생리적 세포 메커니즘에 관심이있는 연구자들에게 적합한 기술입니다. 전체적으로,이 기술은 연구자가 뇌 혈관 생리학 및 병리학과 관련된 질문을 해결하면서 뇌 실질에 내장 된 세동맥의 근본적인 내피 신호 전달 경로 및 네트워크 통신을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

프로토콜

실험자는 동물 및 관련 프로토콜의 지정된 사용이 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받고 국가 연구위원회의 "실험실 동물의 관리 및 사용 가이드"(8^th Edition, 2011) 및 ARRIVE 지침에 따라 수행되도록해야합니다. Loma Linda University와 University of Arizona의 IACUC는 C57BL / 6N 및 3xTg-AD 마우스 (남성과 여성, 연령대 : 2-30 개월)에 대한이 원고에 사용되는 모든 프로토콜을 승인했습니다. 뇌의 마우스 실질 세동맥으로부터 갓 분리된 동맥 내피 튜브의 분리 및 검사에 대한 개요로서 도 1 을 참조한다.

1. 재료 및 장비

참고: 이 프로토콜에 필요한 모든 시약 및 재료에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. 또한 필요에 따라 각 공급 업체와 관련된 매뉴얼 및 웹 사이트도 참조 할 수 있습니다. 해부 스테이션 및 실험 장치의 예시는 이전에 제공되었다¹³.

1. 교류 약실
   1. 유리 커버슬립이 있는 수퍼퓨전 챔버를 양극 산화 처리된 알루미늄으로 구성된 플랫폼에 고정합니다. 챔버로 플랫폼을 알루미늄 현미경 스테이지에 고정하십시오.
   2. 알루미늄 현미경 단계에서 플랫폼의 양쪽 끝에 핀 피펫을 고정하는 마이크로 조작기를 설정하십시오.
      참고: 필요한 경우, 유동 챔버 유닛이 있는 이송 가능한 스테이지 장치를 사용하여 고정되고 격리된 내피 튜브를 한 현미경 장치에서 다른 현미경 장치로 이동시켜 실험을 진행하십시오.
2. 현미경
   1. 해부 절차를 위해 입체 현미경 (5x ~ 50x 배율 범위)과 광섬유 광원을 사용하십시오.
   2. 내피 튜브를 분리하려면 위상 대비 또는 차동 간섭 대비(DIC) 호환 목표(10x, 20x 및 40x)와 알루미늄 스테이지가 장착된 반전 현미경 장비를 사용하십시오.
   3. 부분적으로 소화 된 혈관에서 내피 튜브를 분리하는 데 전념하는 장치 옆에 미세주사기 펌프 컨트롤러를 준비하십시오.
   4. 진동 격리 테이블에 반전 현미경 (목표 : 4x, 10x, 20x, 40x 및 60x)과 수동 알루미늄 스테이지를 배치하여 실험 장치를 설정하십시오.
3. 세포 내 V_m 녹음 장비
   1. 전자계를 호환 가능한 헤드 스테이지에 연결하십시오. 전류 주입이 필요한 프로토콜에 대해 함수 생성기 및 자극기와 같은 액세서리를 사용하십시오.
   2. 증폭기 출력을 데이터 디지타이저 시스템, 오실로스코프 및 가청 기준 모니터에 연결합니다. 기준 배스 전극(Ag/AgCl 펠릿)을 유동 챔버 출구 근처에 고정시킵니다.
   3. 형광 시스템 인터페이스, 고강도 아크 램프 및 전원 공급 장치, 하이퍼 스위치, 광승수 튜브 (또는 PMT) 및 카메라의 통합 구성 요소로 광도 측정 시스템을 조립하여 내피 세포에서 [^Ca2+]_i 를 측정하십시오.
   4. 인라인 히터가 장착된 온도 컨트롤러를 조립하여 실험 전반에 걸쳐 생리적 온도(37°C)를 상승시키고 유지한다.
   5. 인라인 유량 제어 밸브가있는 밸브 컨트롤러에 연결된 다중 채널 플랫폼을 조립하여 챔버에 고정 된 내피 튜브에 대한 솔루션 전달을 제어하십시오.
4. 마이크로 피펫 및 날카로운 전극
   참고 : 실험자는 분쇄 및 고정 피펫을 준비하기위한 전자 유리 풀러와 마이크로 단조가 필요합니다.
   1. 부분적으로 소화된 동맥 세그먼트로부터 내피 튜브를 분리하려면, 붕규산염 유리 모세관으로부터 열 연마된 분쇄 피펫(내부 팁 직경: 30-50 μm)을 준비한다.
   2. 내피 튜브를 과융합 챔버에 고정시키기 위해, 얇은 벽 붕규산염 유리 모세관으로부터 제조된 둔탁한 구형 단부(외경: 50-70 μm)를 갖는 열 연마된 피펫을 준비한다.
   3. 내피 세포의_Vm 을 기록하려면 유리 풀러만을 사용하여 유리 모세 혈관에서 ~ 150 ± 30MΩ의 팁 저항을 가진 날카로운 전극을 준비하십시오.

2. 해결책과 마약

1. 생리 학적 소금 용액 (PSS)
   1. 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM_MgCl2, 10 mM_N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES) 및 10 mM 글루코스를 사용하여 최소 1 L의 PSS를 제조하였다.
   2. 대뇌_{동맥의 해} 부 및 내피 튜브의 분리를 위해 CaCl2 (제로^Ca2 + PSS)가 부족한 필요한 용액을 준비하십시오.
      참고: 모든 용액을 초순수 탈이온화_H2O로 준비한 후 여과(0.22μm)하십시오. 최종 제품에 삼투압이 290 ~ 300 mOsm인 pH 7.4가 포함되어 있는지 확인하십시오.
2. 소 혈청 알부민 (BSA, 10%)
   1. 동결건조된 BSA 분말 1 g을^Ca2+ PSS제로 10 mL의 비이커에 용해시킨다. 비커를 덮고 BSA가 용해되도록 천천히 교반하면서 적어도 2 시간을 허용하십시오.
   2. 필터 용액 10 mL 시린지를 사용하여 0.22 μm 필터를 더하고 -20°C에서 저장되도록 1 mL 분취량을 제조하였다.
3. 해부 용액
   1. 50 mL의 총 부피에 대해 500 μL의 BSA (10%)를 제로^Ca2+ PSS의 49.5 mL에 첨가한다.
   2. 동맥 박리를 위해 페트리 접시에 용액을 옮깁니다.
4. 해리 솔루션
   1. 50 mL의 총 부피에 대해 5 μL의_CaCl2 용액 (1 M) 및 500 μL의 BSA (10%)를 제로^Ca2+ PSS의 49.5 mL에 첨가한다. 용액을 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션한다.
5. 효소
   1. 100 μg/mL 파파인, 170 μg/mL 디티오에리트리톨, 250 μg/mL 콜라게나제(타입 H 블렌드) 및 40 μg/mL 엘라스타제로 소화액 1 mL를 준비하십시오.
      참고: 효소 활성은 다양할 수 있지만, 성공적인 프로토콜에는 다음과 같은 효소 활동이 필요할 수 있습니다: 파파인의 경우 ≥ 10 unit/mg, 콜라게나제의 경우 ≥ 1 unit/mg, 엘라스타제의 경우 ≥ 5 unit/mg.
6. Fura-2 및 약리학 적 제제
   1. Fura-2 AM 스톡을 디메틸설폭사이드(DMSO; 1 mM)로 준비한다. 로딩을 위해 495 μL의 PSS에 스톡 5 μL를 첨가하여 500 μL의 작동 농도 (10 μM)를 준비한다.
   2. PSS 또는 DMSO에 적어도 50 mL의 작동 농도의 약리학 제제를 적절하게 준비하십시오.
7. 전도 솔루션
   1. KCl을 탈이온화 H2O (50 mL의_H2O중 7.455 g의 KCl)에 용해시켜₂M KCl을 제조하였다. 날카로운 전극을 백필하기 전에 0.22 μm 필터로 주사기를 통해 용액을 통과시킵니다.
8. 형광 소기관 추적기 및 항체
   1. 제조업체의 지시에 따라 적절한 생리 식염수 용액에서 원형질막 또는 오르가넬라 (예를 들어, 핵, 소포체) 추적기를 준비하십시오.
   2. 적절한 생리 소금 용액에서 제조업체의 지시에 따라 일차 및 이차 항체를 준비하십시오.

3. 마우스 대뇌 세동맥의 해부와 분리

참고: 입체 현미경 및 선명한 미세 해부 도구(예: 미세 팁이 달린 포셉, Vannas 스타일 해부 가위)는 이러한 모든 해부 절차에서 시편 확대(최대 50배)에 사용해야 합니다.

1. 마우스 뇌의 분리
   1. 이소플루란 흡입 (2-3 분 동안 3 %)을 사용하여 표준 실험실 마우스 (예 : C57BL / 6, 3xTg-AD; 2-30 개월, 남성 또는 여성)를 마취 한 다음 IACUC 승인에 따라 날카로운 가위 또는 단두대를 사용하여 즉시 탈구하십시오. 마우스 머리를 차가운 (4°C) 해부 용액이 들어있는 페트리 접시 (직경 10 cm, 깊이 1.5 cm)에 놓는다.
   2. 입체 현미경으로 보면서 두개골 위의 피부와 머리카락을 제거하고 차가운 해부 용액으로 과도한 혈액을 씻어 내십시오. 표준 해부 가위 (예 : 24mm 블레이드)의 팁을 사용하여 후두골부터 시작하여 두개골의 비강 뼈를 통해 확장되는 절개를하십시오. 굵은 팁이 달린 포셉을 사용하여 절개를 따라 두개골을 조심스럽게 열고 결합 조직 (수막)을 분리하여 손상되지 않은 윌리스 서클을 포함하는 뇌를 분리하십시오.
   3. 고립 된 뇌를 비커 또는 페트리 접시에 차가운 해부 용액으로 씻어 뇌 표면에서 남아있는 혈액을 제거하십시오. 뇌 복부 쪽을 위로 향하게 하여 실질 세동맥을 분리하기 위해 차가운 해부 용액이 들어있는 챔버에 놓습니다(그림 2A).
2. 실질 세동맥의 분리
   참고 : 중간 대뇌 동맥 (MCA)에서 발생하고 뇌 실질에 내장 된 동맥은이 프로토콜을 위해 선택됩니다. 세동맥은 앞서 기술한^{바와 같이 단}리되고, 변형된다.
   1. 강철 핀(직경: 0.2mm, 길이: 11 ~ 12mm)을 사용하여 숯이 주입된 실리콘 폴리머 코팅(깊이 ≥ 50cm)이 들어있는 페트리 접시의 냉간 해부 용액에 분리된 뇌를 고정시킵니다.
   2. 날카롭고 정렬된 해부 가위를 사용하여 MCA 주위의 뇌 조직의 직사각형(길이: 5mm, 너비: 3mm)(그림 2B)을 자르고 조직 세그먼트의 윗부분이 윌리스 원의 분기점을 지나도록 합니다. 필요한 경우 뇌의 다른 반구에서 뇌 조직의 다른 직사각형을 잘라 더 많은 세동맥에 접근하십시오.
   3. 분리 된 뇌 조직 세그먼트를 강철 핀 (직경 : 0.1mm, 길이 : 13 ~ 14mm)을 사용하여 MCA가 위쪽을 향하게하여 접시에 고정하십시오 (윌리스 원에서 원위). 핀 근처에서 조심스럽게 얕은 절개를 만들어 작은 집게로 피아를 제거하고 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 부드럽게 벗겨냅니다 (그림 2C). 필요한 경우 다른 조직 세그먼트에서 피아를 제거하여 더 많은 세동맥에 접근하십시오. MCA에서 분기된 실질 세동맥으로 분리된 피아를 핀으로 접시에 조심스럽게 고정시키고, 실질 세동맥을 해부하여(그림 2D), 세동맥이 손상되지 않도록 한다.
      참고 : 세동맥이 실질에서 피아로 쉽게 빠져 나오지 않으면 미세한 포셉을 사용하고 윌리스 서클의 MCA 분기점에서 시작하여 뇌를 파헤 치십시오. 세동맥을 찾아 세동맥 주위의 조직을 조심스럽게 느슨하게 한 다음(그림 2E), 세동맥을 실질에서 부드럽게 잡아당겨 세동맥의 위쪽 끝을 잡습니다(그림 2F). 여러 세동맥 (길이 : ~ 1.5-2mm)은 뇌 조직의 한 직사각형에서 분리 될 수 있습니다.
   4. 세동맥이 부착된 조직이 없어도 깨끗한지 확인하고 남아있는 원위 가지를 잘라냅니다(그림 3A). 이 깨끗하고 손상되지 않은 세동맥을 효소 소화에 사용하십시오. 또는 원하는 경우 내피 튜브를 준비하기위한 효소 소화를 위해 각 세동맥을 두 조각 (길이 : 0.75-1mm)으로 자릅니다.

4. 실질 세동맥의 소화 및 내피 튜브의 준비

1. 장비 및 피펫 배치
   참고 : 뇌에서 동맥 내피 튜브의 분리는 이전에^13,18에 기술되었습니다. 현재의 프로토콜은 실질 (대뇌 내) 세동맥에서 내피를 분리하기위한 변형을 통합합니다. 여러 세동맥 또는 / 및 세동맥 조각을 효소 소화를 위해 함께 사용할 수 있습니다.
   1. 챔버 및 미세 조작기를 지지하는 알루미늄 스테이지를 사용하여 내피 튜브를 제조하기 위한 분쇄 장치(¹³ )를 조립한다. 목표물 (5x-60x)이 장착 된 현미경과 컴퓨터 모니터에 연결된 카메라를 조립하십시오. 스테이지와 시편 옆에 펌프 컨트롤러가 있는 미세주사기를 고정합니다.
   2. 미네랄 오일로 채워진 분쇄 피펫을 미세주사기 피스톤 위에 고정시킨다. 펌프 컨트롤러와 함께 미세 주사기를 사용하여 해리 용액을 미네랄 오일 상단의 분쇄 피펫 (~ 130 nL)으로 인출하면서 피펫의 기포를 피하십시오.
2. 동맥 세그먼트의 부분 소화
   1. 손상되지 않은 동맥 세그먼트를 100 μg/mL 파파인, 170 μg/mL 디티오에리트리톨, 250 μg/mL 콜라게나제 및 40 μg/mL 엘라스타제가 포함된 10 mL 유리 튜브에 해리 용액 1 mL에 넣으십시오. 동맥 절편을 34°C에서 10-12분 동안 인큐베이션한다.
   2. 소화 후, 효소 용액을 실온에서 3-4 mL의 신선한 해리 용액으로 교체하십시오.
3. 동맥 내피 튜브의 분리
   참고: 효소 용액의 소화 및 교체 후, 하나 또는 여러 개의 부분적으로 소화된 세그먼트를 모바일 플랫폼에 부착된 수퍼퓨전 챔버의 해리 용액으로 옮깁니다. 100x ~ 200x 배율로 보는 동안 부분적으로 소화되었지만 깨지지 않은 용기 세그먼트를 선택하고 현미경으로 초점을 맞춥니다.
   1. 미세주사기 주입기와 부착된 분쇄 피펫을 챔버 내의 해리 용액에 놓고 소화된 용기 세그먼트의 한쪽 끝 가까이에 위치시킨다. 부드러운 분쇄를 위해 펌프 컨트롤러에서 1-3nL/s 범위 내의 속도를 설정하십시오.
   2. 100x 내지 200x 배율을 유지하면서 동맥 세그먼트를 피펫으로 인출한 다음 배출하여 재림 및 평활근 세포를 해리시킨다(그림 3B). 모든 평활근 세포가 해리 될 때까지 혈관 세그먼트를 트리튜레이트하고 내피 세포 만 손상되지 않은 "튜브"로 남아 있습니다.
      참고: 분쇄 중에 필요한 경우, 조심스럽게 미세한 팁이 달린 포셉을 사용하여 내피 튜브에서 해리 된 재림 및 내부 탄성 라미나를 제거하십시오. 전형적으로, 단지 몇 번의 사이클의 분쇄만이 손상되지 않은 내피 튜브를 산출한다.
   3. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 챔버의 유리 커버슬립에 있는 내피 튜브의 양쪽 끝을 보로실리케이트 유리 핀닝 피펫으로 고정합니다(그림 3C,D).
4. 동맥 내피관 확보
   1. 해리 용액을 비내피 물질이 챔버 밖으로 세척되도록 하면서 과융합 용액 (_{2 mM CaCl2}를 함유하는 PSS)으로 교체한다.
   2. 모바일 플랫폼의 보안 내피 튜브를 연속 과융합 및 세포 내 또는 형광 기록 / 이미징을 위해 설계된 현미경 장비로 옮깁니다.
   3. 실험 중에 PSS의 지속적인 전달을 적용하십시오. 인라인 유량 제어 밸브를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 유량 (5-7 mL / min)을 수동으로 설정하고, 층류와 일치하면서 용액 흐름의 공급을 진공 흡입 정도까지 일치시킵니다. 배경 데이터 및/또는 염료 로딩을 획득하기 전에 내피 튜브의 과융합을 위해 챔버로 PSS 유동의 ≥5분을 허용하십시오.

5. 세포 생리학 검사를위한 동맥 내피 튜브의 활용

참고: 분리되고 확보된 동맥 내피관은 앞서 예시된^바와 같이 각각 광도계 및 예리전극 전기생리학_{을 사용하여 [}^Ca2+]_i 역학 및 Vm의 세포내 기록에 사용될 수 있다(그림 4). [카²⁺] _i 및_Vm은 필요에 따라 별도의 또는 조합된 실험 변수(¹³)로서 측정될 수 있다(그림 4). 그러나 동맥 내피 튜브는 동맥 내피보다 섬세하며 실험 시간은 1 시간을 초과해서는 안됩니다.

1. [^Ca2+]_i의 측정
   1. 5-7 mL/min의 유속으로 연속 과융합을 유지하면서 [^Ca2+]_i 레코딩용 장비 및 소프트웨어를 켭니다.
   2. 상온에서 30분 동안^Ca2+ 염료 Fura-2 AM으로 내피 튜브를 로딩하십시오. 세포를 또 다른 20-30분 동안 과융합 용액으로 세척하면서 욕조 온도를 37°C로 서서히 상승시킨다. 실험 내내 온도를 37°C로 유지한다.
   3. 광도계 소프트웨어를 사용하여 이미징 창을 수동으로 조정하여 ~20개의 내피 세포에 초점을 맞춥니다(그림 4A). 빛이 없을 때, 형광 계면에서 PMT를 돌리고 510nm에서 형광 방출을 수집하면서 340nm 및 380nm에서 교대로 (≥10Hz) 흥미 진진한 Fura-2에 의해 [Ca2⁺]_i 의 획득을 시작하십시오. 일단 [^Ca2+]_i 의 안정한 기준선 기록이 확립되면, 실험 목적에 따라 약리학적 제제(예를 들어, 퓨리너성 수용체 작용제)를 적용한다(도 4B).
2. Vm의 측정
   1. V_m 레코딩용 장비 및 소프트웨어를 켜고 5-7mL/min의 유속으로 연속 과융합을 유지하면서 데이터 수집 속도(≥10Hz)를 설정합니다. 욕조 온도를 37°C로 서서히 올리고 실험이 끝날 때까지 유지한다.
   2. 붕규산염 유리 모세관, 2 M KCl로 백필을 사용하여 날카로운 전극을 당기고 전자계에 부착 된 피펫 홀더의 염화물로 코팅 된은 와이어 위에 고정하고, 차례로 마이크로 매니퓰레이터에 의해 고정됩니다.
   3. 4x 목표를 통해 보는 동안 미세 조작기를 사용하여 동맥 내피 튜브의 셀 바로 위에 날카로운 전극 팁을 챔버의 흐르는 PSS로 조심스럽게 배치하십시오.
   4. 점차적으로 배율을 400x로 늘리고 필요에 따라 전극 팁을 재배치합니다.
   5. 미세 조작기를 사용하여 날카로운 전극의 끝을 내피 튜브의 셀 중 하나에 부드럽게 삽입하고 전자_{계를 사용하여} Vm을 기록하기 시작합니다 (그림 4A).
   6. 일단 내피 휴지_Vm 이 안정하면(-30 내지 -40 mV), 실험 목적에 따라 원하는 약리학적 제제를 적용한다(도 4C).

6. 세포 영상

참고: 모바일 플랫폼의 챔버에 고정된 내피 튜브는 표준 형광 또는 공초점 현미경을 사용하여 라이브 및 고정 조건⁽¹⁹ ) 모두에서 현미경 이미징에도 사용할 수 있습니다. 수용체 및 이온 채널에 대한 상이한 항체를 갖는 면역조직화학은 또한 앞서 기술된 바와 같이 적용될 수 있다⁽²⁰).

1. 내피 튜브를 원형질막 또는 원하는 소기관(예를 들어, 핵, 소포체)에 대한 형광 추적기로 로딩하여 37°C에서 15-30분 동안 로딩한다.
2. 세포를 신선한 과융합 PSS로 세척하고 각 염료의 여기 파장에서 현미경으로 살아있는 세포를 이미지화하십시오 (그림 4D, E).
   참고: 면역조직화학은 관심있는 항체를 사용하여 이 튜브 모델에서 수행될 수 있다.

결과

프로토콜의 데모는 각각 도 2 및 도 3과 같이 동맥 박리 및 내피관 분리 단계를 갖는 도 1에 도시되어 있다. 여기서, 내피 기능은 37°C에서 약리학적 제제[2-메틸티오아데노신 디포스페이트(MTA), 강력한 퓨리네르성 수용체(P2YR) 작용제]에 반응하여 Fura-2 광도계 및 샤프 전극 전기생리학(도 4A)_{을 사용하여 [}

토론

성장하는 증거는 뇌 혈관 질환 (CVD), 노화 및 알츠하이머 병이 강하게 상관 관계가 있으며 치매 연구^4,8,14,21의 현재 주제임을 시사합니다. 따라서 뇌 혈관 네트워크에 대한 연구가 건강에 광범위한 영향을 미치면서 질병 상태 동안 지속적인 광범위한 조사가 필요하다는 것은 분명합니다. 뇌 관류에 대...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (porcine pancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potassium Chloride	Sigma	P9541
MgCl2: Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscope objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pump Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibration Isolation Table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g