Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Zusammenfassung

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca²⁺] und des Membranpotentials.

Zusammenfassung

Der zerebrale Blutfluss wird durch vaskuläre Widerstandsarterien und nachgeschaltete parenchymale Arteriolen gefördert. Der stationäre Gefäßwiderstand gegen den Blutfluss nimmt mit abnehmendem Durchmesser von den Arterien zu den Arteriolen zu, die letztendlich in die Kapillaren münden. Aufgrund ihrer geringeren Größe und Lage im Parenchym wurden Arteriolen relativ wenig untersucht und mit geringerer Reproduzierbarkeit der Befunde als oberflächliche Piialarterien. Unabhängig davon erfordert die Struktur und Funktion der arteriolaren Endothelzellen - integraler Bestandteil der Physiologie und Ätiologie chronischer degenerativer Erkrankungen - umfangreiche Untersuchungen. Insbesondere zeigen neue Erkenntnisse, dass eine beeinträchtigte Endothelfunktion kognitiven Beeinträchtigungen und Demenz vorausgeht und diese verschlimmert.

In der parenchymalen Mikrozirkulation ist die endotheliale K ^{+ -} Kanalfunktion der robusteste Reiz, um die Ausbreitung der Vasodilatation fein zu kontrollieren, um die Erhöhung des Blutflusses in Bereiche der neuronalen Aktivität zu fördern. Diese Arbeit veranschaulicht eine verfeinerte Methode zur frischen Isolierung intakter und elektrisch gekoppelter endothelialer "Röhren" (Durchmesser, ~ 25 μm) aus parenchymalen Arteriolen des Mausgehirns. Arterioläre Endothelröhren werden unter physiologischen Bedingungen (37 °C, pH 7,4) gesichert, um experimentelle Variablen aufzulösen, die die K+^- Kanalfunktion und deren Regulation umfassen, einschließlich intrazellulärer Ca2^+- Dynamik, Veränderungen des Membranpotentials und Membranlipidregulation. Ein deutlicher technischer Vorteil gegenüber dem arteriellen Endothel ist die verbesserte morphologische Auflösung der Zell- und Organellendimensionen (z. B. Mitochondrien), was die Nützlichkeit dieser Technik erweitert. Eine gesunde zerebrale Perfusion während des gesamten Lebens beinhaltet eine robuste Endothelfunktion in parenchymalen Arteriolen, die den Blutfluss direkt mit der Förderung der neuronalen und glialen Aktivität in präzisen anatomischen Regionen des Gehirns verbindet. Es wird daher erwartet, dass diese Methode das allgemeine Wissen über Gefäßphysiologie und Neurowissenschaften in Bezug auf das gesunde und kranke Gehirn erheblich voranbringen wird.

Einleitung

Parenchymale Arteriolen liefern direkt essentiellen Sauerstoff und Nährstoffe im gesamten Gehirn¹. Während der Verbindung mit Kapillaren reagieren hochvasoaktive Arteriolen auf retrograde Signale, die von Kapillarionenkanälen initiiert werden, die Stoffwechselsignale aus bestimmten neuronalen Regionen wahrnehmen². Da das Gehirnparenchym in der Vergangenheit den Großteil der Untersuchungen erhalten hat, hat sich nun eine Rolle für die endotheliale Dysfunktion für die Klärung pathologischer Mechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen zerebrovaskulären Erkrankungen ergeben, die Demenz zugrunde liegen (z. B. ischämischer S....

Protokoll

Experimentatoren sollten sicherstellen, dass die vorgesehene Verwendung von Tieren und die damit verbundenen Protokolle von ihrem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" des National Research Council (8^. Auflage, 2011) und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt werden. Die IACUC der Loma Linda University und der University of Arizona hat alle Protokolle, die für dieses Manuskript verwendet werden, für C57BL/6N - und 3xTg-AD-Mäuse (Männer und Frauen; Altersspanne: 2-30 Monate) genehmigt. Siehe Abbildung 1 als Überblick ü....

Ergebnisse

Eine Demonstration des Protokolls ist in Abbildung 1 mit arteriolaren Dissektions- und Endothelröhrenisolationsschritten als Abbildung 2 bzw. Abbildung 3 dargestellt. Hier wurde die Endothelfunktion durch Messung von [Ca²⁺]_i und V_m mittels Fura-2-Photometrie und Elektrophysiologie der scharfen Elektrode (Abbildung 4A) als Reaktion auf einen pharmakologischen Wirkstoff [.......

Diskussion

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass zerebrovaskuläre Erkrankungen (CVD), Altern und Alzheimer-Krankheit stark korreliert sind und ein aktuelles Thema der Demenzforschung^sind 4,8,14,21. Daher ist es offensichtlich, dass Studien des zerebrovaskulären Netzwerks einen breiten Einfluss auf die Gesundheit haben würden, während sie eine fortgesetzte umfassende Untersuchung während der Kran.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (porcine pancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potassium Chloride	Sigma	P9541
MgCl2: Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscope objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pump Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibration Isolation Table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g