Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Zusammenfassung

Die intensive Vorbereitung intakter zerebraler endothelialer "Röhrchen" der Maus aus den zerebralen parenchymalen Arteriolen wird für die Untersuchung der zerebralen Blutflussregulation veranschaulicht. Darüber hinaus demonstrieren wir die experimentellen Stärken dieses endothelialen Studienmodells für die Fluoreszenzbildgebung und die elektrophysiologische Messung wichtiger zellulärer Signalwege, einschließlich Änderungen des intrazellulären [Ca²⁺] und des Membranpotentials.

Zusammenfassung

Der zerebrale Blutfluss wird durch vaskuläre Widerstandsarterien und nachgeschaltete parenchymale Arteriolen gefördert. Der stationäre Gefäßwiderstand gegen den Blutfluss nimmt mit abnehmendem Durchmesser von den Arterien zu den Arteriolen zu, die letztendlich in die Kapillaren münden. Aufgrund ihrer geringeren Größe und Lage im Parenchym wurden Arteriolen relativ wenig untersucht und mit geringerer Reproduzierbarkeit der Befunde als oberflächliche Piialarterien. Unabhängig davon erfordert die Struktur und Funktion der arteriolaren Endothelzellen - integraler Bestandteil der Physiologie und Ätiologie chronischer degenerativer Erkrankungen - umfangreiche Untersuchungen. Insbesondere zeigen neue Erkenntnisse, dass eine beeinträchtigte Endothelfunktion kognitiven Beeinträchtigungen und Demenz vorausgeht und diese verschlimmert.

In der parenchymalen Mikrozirkulation ist die endotheliale K ^{+ -} Kanalfunktion der robusteste Reiz, um die Ausbreitung der Vasodilatation fein zu kontrollieren, um die Erhöhung des Blutflusses in Bereiche der neuronalen Aktivität zu fördern. Diese Arbeit veranschaulicht eine verfeinerte Methode zur frischen Isolierung intakter und elektrisch gekoppelter endothelialer "Röhren" (Durchmesser, ~ 25 μm) aus parenchymalen Arteriolen des Mausgehirns. Arterioläre Endothelröhren werden unter physiologischen Bedingungen (37 °C, pH 7,4) gesichert, um experimentelle Variablen aufzulösen, die die K+^- Kanalfunktion und deren Regulation umfassen, einschließlich intrazellulärer Ca2^+- Dynamik, Veränderungen des Membranpotentials und Membranlipidregulation. Ein deutlicher technischer Vorteil gegenüber dem arteriellen Endothel ist die verbesserte morphologische Auflösung der Zell- und Organellendimensionen (z. B. Mitochondrien), was die Nützlichkeit dieser Technik erweitert. Eine gesunde zerebrale Perfusion während des gesamten Lebens beinhaltet eine robuste Endothelfunktion in parenchymalen Arteriolen, die den Blutfluss direkt mit der Förderung der neuronalen und glialen Aktivität in präzisen anatomischen Regionen des Gehirns verbindet. Es wird daher erwartet, dass diese Methode das allgemeine Wissen über Gefäßphysiologie und Neurowissenschaften in Bezug auf das gesunde und kranke Gehirn erheblich voranbringen wird.

Einleitung

Parenchymale Arteriolen liefern direkt essentiellen Sauerstoff und Nährstoffe im gesamten Gehirn¹. Während der Verbindung mit Kapillaren reagieren hochvasoaktive Arteriolen auf retrograde Signale, die von Kapillarionenkanälen initiiert werden, die Stoffwechselsignale aus bestimmten neuronalen Regionen wahrnehmen². Da das Gehirnparenchym in der Vergangenheit den Großteil der Untersuchungen erhalten hat, hat sich nun eine Rolle für die endotheliale Dysfunktion für die Klärung pathologischer Mechanismen im Zusammenhang mit verschiedenen zerebrovaskulären Erkrankungen ergeben, die Demenz zugrunde liegen (z. B. ischämischer Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit⁾3,4,5,6 . Das Endothel ist ein integraler Bestandteil der Perfusion des Gehirns in Übereinstimmung mit der Heterogenität von Genetik, Struktur und Funktion in den Gefäßsegmenten⁷. Pialarterien wurden aufgrund ihrer relativ großen Größe, ihres hohen segmentalen Gefäßwiderstands und ihrer Rolle bei der Blutflussverteilung zum darunter liegenden Großhirn^{umfassend untersucht 8,9}. Daher wird ein besseres Verständnis der arteriolaren Endothelmechanismen wahrscheinlich das Verständnis der Blutflussregulation des Gehirns in Gesundheit und Krankheit im Hinblick auf die Entwicklung neuartiger therapeutischer Regime verbessern.

Neue Erkenntnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, parenchymale Arteriolen in Bezug auf verschiedene Signalwege und Krankheiten zu untersuchen ^8,10. Dieser Ansatz beschränkte sich jedoch auf die Verwendung intakter druckbeaufschlagter Arteriolen-11- und/oder Kapillar-Parenchymal-Arteriolen-Präparate (CaPA)¹². Frisch isolierte, native zerebrale arterioläre Endothelzellen, die frei von anderen Zelltypen und Störfaktoren sind, wurden nicht untersucht, wahrscheinlich aufgrund technischer Schwierigkeiten bei ihrer Isolierung. Diese Arbeit bringt eine frühere Technik voran, die die Isolierung des arteriellen Endothels¹³ hervorhebt, um nun das Endothel der parenchymalen Arteriolen des Gehirns zuverlässig und reproduzierbar zu isolieren (Breite: ~ 25 μm, Länge: ~ 250 μm). Diese Technik hilft, eine optimale Auflösung von elektrisch und chemisch gekoppelten Zellen in ihrer individuellen Orientierung und ihren zellulären Netzwerken zu erreichen.

Zu den wichtigsten interessanten Signalwegen gehörten die Wechselwirkung der intrazellulären Ca 2 + ([Ca^{2 +}]_i) -Signalgebung und die Hyperpolarisation des Membranpotentials (V_m) ^14,15 - integraler Bestandteil der Vasodilatation 16 -^, damit Blut in die Kapillaren eindringen und Sauerstoff und Nährstoffe an aktives Parenchym ¹⁷ abgeben^kann. Diese Präparate ermöglichen elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnungen von Ionenkanälen, einschließlich Ca² +-permeant, transientem Rezeptorpotential (TRP) und K ^{+ -}Kanälen und/oder fluoreszierender Bildgebung von intrazellulären Organellen in Endothelzellröhren unter nahezu physiologischen Bedingungen. Dies ist eine geeignete Technik für Forscher, die sich für physiologische zelluläre Mechanismen interessieren, die die Endothelzellkontrolle der zerebralen Blutflusslieferung an das Gehirnparenchym steuern. Insgesamt wird diese Technik den Forschern helfen, grundlegende endotheliale Signalwege und die Netzwerkkommunikation von Arteriolen, die in das Parenchym des Gehirns eingebettet sind, besser zu verstehen und gleichzeitig Fragen im Zusammenhang mit der zerebrovaskulären Physiologie und Pathologie zu beantworten.

Protokoll

Experimentatoren sollten sicherstellen, dass die vorgesehene Verwendung von Tieren und die damit verbundenen Protokolle von ihrem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" des National Research Council (8^. Auflage, 2011) und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt werden. Die IACUC der Loma Linda University und der University of Arizona hat alle Protokolle, die für dieses Manuskript verwendet werden, für C57BL/6N - und 3xTg-AD-Mäuse (Männer und Frauen; Altersspanne: 2-30 Monate) genehmigt. Siehe Abbildung 1 als Überblick über die Isolierung und Untersuchung von arteriolären Endothelröhren, die frisch aus den parenchymalen Arteriolen der Maus des Gehirns isoliert wurden.

1. Materialien und Ausrüstung

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie alle Reagenzien und Materialien, die für dieses Protokoll erforderlich sind. Darüber hinaus können bei Bedarf auch Handbücher und Websites zu den jeweiligen Anbietern konsultiert werden. Abbildungen von Sezierstationen und Versuchsapparaturen wurden bisher zur Verfügung gestellt¹³.

1. Durchflusskammer
   1. Befestigen Sie eine Superfusionskammer mit einem Glasdeckel auf einer Plattform aus eloxiertem Aluminium. Befestigen Sie die Plattform mit der Kammer auf einem Aluminiummikroskoptisch.
   2. Stellen Sie einen Mikromanipulator ein, der an jedem Ende der Plattform eine Pinning-Pipette auf dem Aluminiummikroskoptisch hält.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine übertragbare Tischapparatur mit einer Durchflusskammereinheit, um einen gesicherten, isolierten Endothelschlauch von einer Mikroskopvorrichtung zur anderen zu bewegen.
2. Mikroskope
   1. Verwenden Sie Stereomikroskope (5x bis 50x Vergrößerungsbereich) und faseroptische Lichtquellen für Dissektionsverfahren.
   2. Zur Isolierung von Endothelröhren verwenden Sie ein inverses Mikroskop-Rig, das mit Phasenkontrast- oder DIC-kompatiblen Objektiven (DIC) (10x, 20x und 40x) und einem Aluminiumtisch ausgestattet ist.
   3. Halten Sie neben dem Gerät einen Mikrospritzenpumpenregler bereit, der zur Isolierung von Endothelröhren aus teilweise verdauten Blutgefäßen bestimmt ist.
   4. Richten Sie die experimentelle Vorrichtung ein, indem Sie ein inverses Mikroskop (Objektive: 4x, 10x, 20x, 40x und 60x) und einen manuellen Aluminiumtisch auf einem Schwingungsisolationstisch anordnen.
3. Intrazelluläres V_m Aufzeichnungsgerät
   1. Schließen Sie das Elektrometer an eine kompatible Kopfstufe an. Verwenden Sie Zubehör wie einen Funktionsgenerator und einen Stimulator für Protokolle, die eine Strominjektion erfordern.
   2. Schließen Sie die Verstärkerausgänge an ein Datendigitalisierungssystem, ein Oszilloskop und akustische Basislinienmonitore an. Befestigen Sie die Referenzbadelektrode (Ag/AgCl-Pellet) in der Nähe des Durchflusskammerausgangs.
   3. Stellen Sie ein photometrisches System mit integrierten Komponenten einer Fluoreszenzsystemschnittstelle, einer hochintensiven Bogenlampe und Stromversorgung, einem Hyperschalter, einer Photomultiplierröhre (oder PMT) und einer Kamera zusammen, um [Ca^{2 +}]_i in Endothelzellen zu messen.
   4. Montieren Sie einen Temperaturregler, der mit einer Inline-Heizung ausgestattet ist, um eine physiologische Temperatur (37 ° C) während des gesamten Experiments zu erhöhen und aufrechtzuerhalten.
   5. Montieren Sie eine Mehrkanalplattform, die mit einer Ventilsteuerung mit einem Inline-Durchflussregelventil verbunden ist, um die Lieferung von Lösungen an Endothelrohre zu steuern, die in der Kammer gesichert sind.
4. Mikropipetten und scharfe Elektroden
   HINWEIS: Der Experimentator benötigt einen elektronischen Glasabzieher und eine Mikroschmiede zur Vorbereitung von Verreibungs- und Pinning Pipetten.
   1. Um das Endothelrohr vom teilweise verdauten Arteriolsegment zu trennen, bereiten Sie aus Borosilikatglaskapillaren wärmepolierte Verreibungspipetten (Innenspitzendurchmesser: 30-50 μm) vor.
   2. Um das Endothelrohr in der Superfusionskammer zu sichern, bereiten Sie wärmepolierte Pinning-Pipetten mit einem abgestumpften, kugelförmigen Ende (Außendurchmesser: 50-70 μm) vor, die aus dünnwandigen Borosilikatglaskapillaren hergestellt werden.
   3. Um V_m einer Endothelzelle aufzuzeichnen, bereiten Sie scharfe Elektroden mit einem Spitzenwiderstand von ~ 150 ± 30 MΩ aus Glaskapillaren nur mit dem Glasabzieher vor.

2. Lösungen und Medikamente

1. Physiologische Salzlösung (PSS)
   1. Bereiten Sie mindestens 1 l PSS mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-_{2-ethansulfonsäure} (HEPES) und 10 mM Glukose vor.
   2. Bereiten Sie notwendige Lösungen ohne CaCl 2 (null Ca^{2 +} PSS) für die Dissektion der Hirnarteriolen und die Isolierung des Endothelrohrs vor.
      HINWEIS: Bereiten Sie alle Lösungen in hochreinem deionisiertem H2 O vor, gefolgt von einer Filtration (0,22 μm). Stellen Sie sicher, dass das Endprodukt einen pH-Wert von 7,4 mit einer Osmolalität zwischen 290 und 300 mOsm enthält.
2. Rinderserumalbumin (BSA, 10%)
   1. 1 g des lyophilisierten BSA-Pulvers in einem Becherglas von 10 ml Ca²⁺ PSS auflösen. Bedecken Sie das Becherglas und lassen Sie mindestens 2 h mit langsamem Rühren das BSA auflösen.
   2. Filtern Sie die Lösung mit einer 10-ml-Spritze und einem 0,22-μm-Filter und bereiten Sie 1 ml-Aliquots vor, die bei -20 °C gelagert werden sollen.
3. Dissektionslösung
   1. Fügen Sie 500 μL BSA (10%) zu 49,5 ml Null Ca²⁺ PSS für ein Gesamtvolumen von 50 mL hinzu.
   2. Transferlösung auf eine Petrischale für arterioläre Dissektionen.
4. Dissoziationslösung
   1. 5 μL_{CaCl2-Lösung} (1 M) und 500 μL BSA (10 %) zu 49,5 ml Null Ca2⁺ PSS für ein Gesamtvolumen von 50 mL hinzufügen. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.
5. Enzyme
   1. Bereiten Sie 1 ml Aufschlusslösung mit 100 μg/ml Papain, 170 μg/ml Dithioerythritol, 250 μg/ml Kollagenase (Typ-H-Mischung) und 40 μg/ml Elastase vor.
      HINWEIS: Enzymaktivitäten können variieren, obwohl erfolgreiche Protokolle wahrscheinlich die folgenden enzymatischen Aktivitäten erfordern: ≥ 10 Einheiten / mg für Papain, ≥ 1 Einheit / mg für Kollagenase und ≥ 5 Einheiten / mg für Elastase.
6. Fura-2 und pharmakologische Wirkstoffe
   1. Fura-2 AM-Vorrat in Dimethylsulfoxid (DMSO; 1 mM) herstellen. Bereiten Sie 500 μL Arbeitskonzentration (10 μM) vor, indem Sie 5 μL des Materials zu 495 μL PSS für die Beladung hinzufügen.
   2. Bereiten Sie mindestens 50 ml Arbeitskonzentrationen pharmakologischer Wirkstoffe in PSS oder DMSO vor.
7. Durchführende Lösung
   1. Es werden 2 Mio. KCl durch Auflösen von KCl in deionisiertem_H2O(7,455 g KCl in 50 ml_H2O) hergestellt. Führen Sie die Lösung durch eine Spritze mit einem 0,22-μm-Filter, bevor Sie die scharfen Elektroden verfüllen.
8. Fluoreszierende Organellen-Tracker und Antikörper
   1. Bereiten Sie Plasmamembran- oder Organellar-Tracker (z. B. Kern, endoplasmatisches Retikulum) in der entsprechenden physiologischen Kochsalzlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   2. Bereiten Sie primäre und sekundäre Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers in der entsprechenden physiologischen Salzlösung vor.

3. Dissektion und Isolierung von Maus-Hirnarteriolen

HINWEIS: Bei all diesen Sezierverfahren müssen Stereomikroskope und geschärfte Mikrodissektionswerkzeuge (z. B. fein bestückte Pinzetten, Sezierscheren im Vannas-Stil) zur Vergrößerung der Proben (bis zu 50-fach) verwendet werden.

1. Isolierung des Mausgehirns
   1. Anästhesien einer Standard-Labormaus (z. B. C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 Monate alt, männlich oder weiblich) mit Isofluran-Inhalation (3% für 2-3 min), gefolgt von sofortiger Enthauptung mit scharfer Schere oder Guillotine gemäß IACUC-Zulassung. Legen Sie den Mauskopf in eine Petrischale (Durchmesser 10 cm, Tiefe 1,5 cm), die kalte (4 °C) Sezierlösung enthält.
   2. Entfernen Sie während der Betrachtung unter einem Stereomikroskop Haut und Haare über dem Schädel und waschen Sie überschüssiges Blut mit kalter Dissektionslösung ab. Machen Sie mit den Spitzen von Standard-Dissektionsscheren (z. B. 24-mm-Klingen) einen Einschnitt, der mit dem Hinterhauptbein beginnt und sich durch das Nasenbein des Schädels erstreckt. Verwenden Sie eine grob bestückte Pinzette, um den Schädel entlang des Einschnitts vorsichtig zu öffnen, und trennen Sie das Bindegewebe (Meningealmembran), um das Gehirn zu isolieren, das einen intakten Kreis von Willis enthält.
   3. Waschen Sie das isolierte Gehirn mit kalter Dissektionslösung in einem Becherglas oder einer Petrischale, um das restliche Blut von der Oberfläche des Gehirns zu entfernen. Platzieren Sie die ventrale Gehirnseite nach oben in einer Kammer, die kalte Dissektionslösung zur Isolierung der parenchymalen Arteriolen enthält (Abbildung 2A).
2. Isolierung der parenchymalen Arteriolen
   HINWEIS: Für dieses Protokoll werden Arteriolen ausgewählt, die aus den mittleren Hirnarterien (MCAs) stammen und in das Hirnparenchym eingebettet sind. Die Arteriolen werden wie zuvor beschrieben^{isoliert 11}, mit Modifikation.
   1. Verwenden Sie Stahlstifte (Durchmesser: 0,2 mm, Länge: 11 bis 12 mm), um das isolierte Gehirn in kalter Dissektionslösung in einer Petrischale mit einer mit Holzkohle angereicherten Siliziumpolymerbeschichtung (Tiefe ≥ 50 cm) zu sichern.
   2. Schneiden Sie mit einer scharfen und ausgerichteten Sezierschere ein Rechteck aus Hirngewebe (Länge: 5 mm, Breite: 3 mm) (Abbildung 2B) um die MCA und stellen Sie sicher, dass der obere Teil des Gewebesegments hinter dem Verzweigungspunkt des Willis-Kreises liegt. Schneiden Sie ein weiteres Rechteck aus Hirngewebe aus der anderen Hemisphäre des Gehirns, um bei Bedarf auf weitere Arteriolen zuzugreifen.
   3. Befestigen Sie das abgetrennte Hirngewebesegment in der Schale mit dem MCA nach oben (distal vom Kreis von Willis) mit Stahlstiften (Durchmesser: 0,1 mm, Länge: 13 bis 14 mm). Machen Sie vorsichtig einen flachen Schnitt in der Nähe der Stifte, um die Pia mit einer kleinen Pinzette zu entfernen, die sich vorsichtig von einem Ende zum anderen ablöst (Abbildung 2C). Entfernen Sie die Pia aus dem anderen Gewebesegment, um bei Bedarf auf weitere Arteriolen zuzugreifen. Sichern Sie vorsichtig die isolierte Pia mit parenchymalen Arteriolen, die von MCA verzweigt sind, in der Schale mit den Stiften und sezieren Sie die parenchymalen Arteriolen (Abbildung 2D), um sicherzustellen, dass die Arteriolen nicht beschädigt werden.
      HINWEIS: Wenn die Arteriolen nicht leicht mit der Pia aus dem Parenchym herausgezogen werden können, verwenden Sie eine feine Pinzette und graben Sie sich in das Gehirn, beginnend am MCA-Zweigpunkt vom Kreis von Willis. Lokalisieren Sie die Arteriole, lockern Sie vorsichtig das Gewebe um die Arteriolen (Abbildung 2E) und ziehen Sie die Arteriole vorsichtig aus dem Parenchym, wobei Sie das obere Ende der Arteriole halten (Abbildung 2F). Mehrere Arteriolen (Länge: ~1,5-2 mm) können aus einem Rechteck des Hirngewebes isoliert werden.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Arteriole sauber ist und kein Gewebe daran befestigt ist, und schneiden Sie alle verbleibenden distalen Äste ab (Abbildung 3A). Verwenden Sie diese saubere, intakte Arteriole für die enzymatische Verdauung. Alternativ wird jede Arteriole in zwei Stücke geschnitten (Länge: 0,75-1 mm) für den enzymatischen Aufschluss zur Herstellung von Endothelröhren, falls gewünscht.

4. Verdauung der parenchymalen Arteriolen und Vorbereitung der Endothelröhren

1. Anordnung von Geräten und Pipetten
   HINWEIS: Die Isolierung von arteriellen Endothelröhren aus dem Gehirn wurde zuvor^{beschrieben 13,18}. Das aktuelle Protokoll enthält Modifikationen zur Isolierung von Endothel aus parenchymalen (intrazerebralen) Arteriolen. Mehrere Arteriolen und/oder Teile von Arteriolen können zusammen für die enzymatische Verdauung verwendet werden.
   1. Montieren Sie die Verreibungsvorrichtung¹³ zur Vorbereitung von Endothelrohren mit einem Aluminiumtisch, der eine Kammer und Mikromanipulatoren trägt. Stellen Sie ein Mikroskop zusammen, das mit Objektiven (5x-60x) und einer an einen Computermonitor angeschlossenen Kamera ausgestattet ist. Befestigen Sie eine Mikrospritze mit einer Pumpensteuerung neben dem Tisch und der Probe.
   2. Befestigen Sie eine mit Mineralöl hinterlegte Verreibungspipette über dem Mikrospritzenkolben. Verwenden Sie die Mikrospritze mit der Pumpensteuerung, um die Dissoziationslösung in die Verreibungspipette (~ 130 nL) auf dem Mineralöl zu entnehmen, wobei darauf zu achten ist, dass Luftblasen in der Pipette vermieden werden.
2. Teilverdauung von Arteriolsegmenten
   1. Legen Sie intakte Arteriolsegmente in 1 ml Dissoziationslösung in einem 10 ml Glasröhrchen, das 100 μg/ml Papain, 170 μg/ml Dithioerythrit, 250 μg/ml Kollagenase und 40 μg/ml Elastase enthält. Arteriolare Segmente bei 34 °C für 10-12 min inkubieren.
   2. Ersetzen Sie nach dem Aufschluss die Enzymlösung durch 3-4 ml frische Dissoziationslösung bei Raumtemperatur.
3. Isolierung des arteriolaren Endothelrohrs
   HINWEIS: Nach dem Aufschluss und dem Ersatz der Enzymlösung ein oder mehrere teilweise verdaute Segmente in die Dissoziationslösung in einer an eine mobile Plattform angeschlossenen Superfusionskammer übertragen. Wählen Sie beim Betrachten mit 100- bis 200-facher Vergrößerung ein teilweise verdautes, aber ununterbrochenes Gefäßsegment aus und konzentrieren Sie sich unter dem Mikroskop darauf.
   1. Legen Sie die mit dem Mikrospritzeninjektor befestigte Verreibungspipette in die Dissoziationslösung in der Kammer und positionieren Sie sie nahe an einem Ende des verdauten Gefäßsegments. Stellen Sie eine Rate im Bereich von 1-3 nL/s an der Pumpensteuerung für eine sanfte Verreibung ein.
   2. Unter Beibehaltung der 100- bis 200-fachen Vergrößerung ziehen Sie das Arteriolärsegment in die Pipette zurück und werfen Sie es dann aus, um die Adventitia- und glatten Muskelzellen zu dissoziieren (Abbildung 3B). Trituieren Sie das Gefäßsegment, bis alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und nur noch Endothelzellen als intaktes "Rohr" erhalten bleiben.
      HINWEIS: Falls während der Verreibung erforderlich, verwenden Sie vorsichtig eine fein bestückte Pinzette, um die dissoziierten Adventitien und die innere elastische Lamina aus dem Endothelrohr zu entfernen. Typischerweise ergeben nur wenige Verreibungszyklen eine intakte Endothelröhre.
   3. Verwenden Sie Mikromanipulatoren, um jedes Ende des Endothelrohrs auf dem Glasdeckglas in der Kammer mit Borosilikatglas-Pinning-Pipetten zu befestigen (Abbildung 3C, D).
4. Sicherung der arteriolaren Endothelröhre
   1. Ersetzen Sie die Dissoziationslösung durch eine Superfusionslösung (PSS mit 2 mM CaCl₂) und stellen Sie sicher, dass nichtendotheliales Material aus der Kammer ausgewaschen wird.
   2. Übertragen Sie gesicherte Endothelröhren in der mobilen Plattform auf das Mikroskopgerät, das für kontinuierliche Superfusion und intrazelluläre oder fluoreszierende Aufnahmen / Bildgebung ausgelegt ist.
   3. Wenden Sie während des Experiments die kontinuierliche Bereitstellung von PSS an. Stellen Sie die Durchflussrate (5-7 ml/min) während des gesamten Experiments manuell mit dem Inline-Durchflussregelventil ein, das mit dem laminaren Durchfluss übereinstimmt, während der Zulauf des Lösungsflusses an das Ausmaß der Vakuumabsaugung angepasst wird. Lassen Sie ≥5 Minuten PSS zur Kammer fließen, um das Endothelrohr zu überfusionieren, bevor Sie Hintergrunddaten erfassen und / oder Farbstoff einfüllen.

5. Nutzung der arteriolaren Endothelröhren zur Untersuchung der zellulären Physiologie

HINWEIS: Isolierte und gesicherte arteriolare Endothelröhren können für intrazelluläre Aufnahmen von [Ca²⁺]_i Dynamik und V_m unter Verwendung von Photometrie bzw. scharfer Elektrodenelektrophysiologie verwendet werden, wie zuvor^{dargestellt 13} (Abbildung 4). [Ca²⁺] _i und V_m können je nach Bedarf als separate oder kombinierte experimentelle Größen gemessen werden¹³ (Abbildung 4). Arterioläre Endothelröhren sind jedoch empfindlicher als das arterielle Endothel, und die Experimentierzeit sollte 1 h nicht überschreiten.

1. Messung von [Ca²⁺_]i
   1. Schalten Sie das Gerät und die Software für [Ca²⁺]_i-Aufnahmen ein, während Sie die kontinuierliche Superfusion bei einer Durchflussrate von 5-7 ml/min beibehalten.
   2. Beladen Sie das Endothelrohr mit dem Ca²⁺ Farbstoff Fura-2 AM für 30 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit Superfusionslösung für weitere 20-30 Minuten, während Sie die Badtemperatur schrittweise auf 37 ° C erhöhen. Halten Sie die Temperatur während des gesamten Experiments bei 37 ° C.
   3. Passen Sie das Bildgebungsfenster manuell mit Photometriesoftware an, um sich auf ~ 20 Endothelzellen zu konzentrieren (Abbildung 4A). In Abwesenheit von Licht schalten Sie die PMT auf die Fluoreszenzschnittstelle und beginnen Sie mit der Aufnahme von [Ca²⁺]_i , indem Sie Fura-2 abwechselnd (≥10 Hz) bei 340 nm und 380 nm anregen, während Sie die Fluoreszenzemission bei 510 nm sammeln. Sobald eine stabile Baseline-Aufzeichnung von [Ca²⁺]_i etabliert ist, wenden pharmakologische Wirkstoffe (z. B. purinerge Rezeptoragonisten) pro experimentellem Ziel an (Abbildung 4B).
2. Messung von V_m
   1. Schalten Sie das Gerät und die Software für V m-Aufnahmen ein und stellen Sie die Datenerfassungsrate (≥10 Hz) ein, während die kontinuierliche Superfusion bei einer Durchflussrate von 5-7 ml / min beibehalten wird. Erhöhen Sie die Badtemperatur schrittweise auf 37 °C und halten Sie sie bis zum Ende des Experiments aufrecht.
   2. Ziehen Sie eine scharfe Elektrode mit einer Borosilikatglaskapillare, füllen Sie sie mit 2 M KCl und befestigen Sie sie über einem mit Chlorid beschichteten Silberdraht in dem Pipettenhalter, der an einem Elektrometer befestigt ist, der wiederum von einem Mikromanipulator gehalten wird.
   3. Während Sie durch das 4x-Objektiv schauen, verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die scharfe Elektrodenspitze vorsichtig über einer Zelle des arteriolaren Endothelrohrs in das fließende PSS in der Kammer zu positionieren.
   4. Erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise auf das 400-fache und positionieren Sie die Elektrodenspitze nach Bedarf neu.
   5. Führen Sie mit dem Mikromanipulator vorsichtig die Spitze einer scharfen Elektrode in eine der Zellen des Endothelrohrs ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung von V_{m mit} einem Elektrometer (Abbildung 4A).
   6. Sobald das endotheliale Ruhe-V_{m stabil} ist (−30 bis −40 mV), wenden Sie die gewünschten pharmakologischen Wirkstoffe pro Versuchsziel an (Abbildung 4C).

6. Zellbildgebung

HINWEIS: Endothelröhren, die in der Kammer der mobilen Plattform gesichert sind, können auch für die mikroskopische Bildgebung unter lebenden und festen Bedingungen^{verwendet werden 19} unter Verwendung der Standardfluoreszenz- oder konfokalen Mikroskopie. Auch die Immunhistochemie mit verschiedenen Antikörpern für Rezeptoren und Ionenkanäle kann wie zuvor beschrieben^{angewendet werden 20}.

1. Laden Sie das Endothelrohr mit dem Fluoreszenz-Tracker für die Plasmamembran oder die gewünschte Organelle (z. B. Kern, endoplasmatisches Retikulum) bei 37 °C für 15-30 min.
2. Waschen Sie die Zellen mit frischem Superfusions-PSS und stellen Sie lebende Zellen unter dem Mikroskop bei der Anregungswellenlänge der jeweiligen Farbstoffe dar (Abbildung 4D, E).
   HINWEIS: Die Immunhistochemie kann an diesem Röhrenmodell mit interessanten Antikörpern durchgeführt werden.

Ergebnisse

Eine Demonstration des Protokolls ist in Abbildung 1 mit arteriolaren Dissektions- und Endothelröhrenisolationsschritten als Abbildung 2 bzw. Abbildung 3 dargestellt. Hier wurde die Endothelfunktion durch Messung von [Ca²⁺]_i und V_m mittels Fura-2-Photometrie und Elektrophysiologie der scharfen Elektrode (Abbildung 4A) als Reaktion auf einen pharmakologischen Wirkstoff [...

Diskussion

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass zerebrovaskuläre Erkrankungen (CVD), Altern und Alzheimer-Krankheit stark korreliert sind und ein aktuelles Thema der Demenzforschung^sind 4,8,14,21. Daher ist es offensichtlich, dass Studien des zerebrovaskulären Netzwerks einen breiten Einfluss auf die Gesundheit haben würden, während sie eine fortgesetzte umfassende Untersuchung während der Kran...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (porcine pancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potassium Chloride	Sigma	P9541
MgCl2: Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscope objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pump Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibration Isolation Table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g