בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

Summary

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca²⁺] ופוטנציאל הממברנה.

Abstract

זרימת הדם המוחית מועברת על ידי עורקי התנגדות כלי דם ועורקים פרנצ'ימליים במורד הזרם. עמידות כלי דם במצב יציב לזרימת הדם עולה עם קוטר פוחת מעורקים לעורקים שבסופו של דבר ניזונים לנימים. בשל גודלם הקטן יותר ומיקומם בפרנצ'ימה, arterioles כבר understudied יחסית עם פחות רבייה בממצאים מאשר עורקי pial פני השטח. כך או כך, מבנה ותפקוד תאי אנדותל אנדותל עורקיים – חלק בלתי נפרד מהפיזיולוגיה והאטיולוגיה של מחלות ניווניות כרוניות – דורשים חקירה מקיפה. בפרט, ראיות המתעוררות מדגימות כי תפקוד אנדותל נפגע מקדים ומחריף פגיעה קוגניטיבית ודמנציה.

במיקרו-סירקולציה parenchymal, פונקציית ערוץ K ⁺ אנדותל הוא הגירוי החזק ביותר כדי לשלוט דק על התפשטות vasodilation כדי לקדם את העליות בזרימת הדם לאזורים של פעילות עצבית. מאמר זה ממחיש שיטה מעודנת לבידוד טרי של "צינורות" אנדותל שלמים ומצמידים חשמלית (קוטר, ~ 25 מיקרומטר) מעורקי מפרקי מוח העכבר. צינורות אנדותל Arteriolar מאובטחים במהלך תנאים פיזיולוגיים (37 °C, pH 7.4) כדי לפתור משתנים ניסיוניים המקיפים פונקציית ערוץ K ⁺ ואת הרגולציה שלהם, כולל דינמיקה Ca^{2 +} תאיים, שינויים בפוטנציאל הממברנה, ויסות השומנים הממברנה. יתרון טכני מובהק לעומת אנדותל עורקי הוא הרזולוציה המורפולוגית המשופרת של ממדי התא והאברונל (למשל, המיטוכונדריה), המרחיבה את התועלת של טכניקה זו. זלוף מוחי בריא לאורך החיים כרוך בתפקוד אנדותל חזק בעורקים פרנצ'ימליים, המקשר ישירות את זרימת הדם לתדלוק של פעילות עצבית וגליאלית בכל האזורים האנטומיים המדויקים של המוח. לכן, צפוי כי שיטה זו תקדם באופן משמעותי את הידע הכללי של פיזיולוגיה של כלי הדם ומדעי המוח לגבי המוח הבריא והחולני.

Introduction

עורקי Parenchymal ישירות לספק חמצן חיוני וחומרים מזינים ברחבי המוח¹. תוך כדי התממשקות עם נימים, arterioles vasoactive מאוד להגיב איתות מדרדר ביוזמת ערוצי יון נימי לחוש אותות מטבוליים מאזורים עצביים ספציפיים². עם parenchyma המוח לאחר שקיבלה היסטורית את עיקר החקירה, תפקיד לתפקוד לקוי של אנדותל התפתח כעת להבהרת מנגנונים פתולוגיים הקשורים להפרעות שונות בכלי הדם במוח שבבסיס דמנציה (למשל, שבץ איסכמי, מחלת אלצהיימר)^3,4,5,5,6 . האנדותל הוא חלק בלתי נפרד מהזלוף של המוח בהתאם להטרוגניות של גנטיקה, מבנה ותפקוד בכל מגזרי כלי הדם⁷. עורקי פיאל נחקרו בהרחבה בשל גודלם הגדול יחסית, עמידות גבוהה של כלי דם מגזריים, ותפקידם בהתפלגות זרימת הדם למוח המוח הבסיסי ^8,9. לכן, הבנה טובה יותר של מנגנוני אנדותל arteriolar סביר להניח לשפר את ההבנה של ויסות זרימת הדם במוח בבריאות ומחלות לקראת התפתחות של משטרים טיפוליים חדשניים.

ראיות המתעוררות מדגיש את החשיבות של לימוד עורקים parenchymal ביחס מסלולי איתות שונים ומחלות ^8,10. עם זאת, גישה זו הוגבלה לשימוש בעורק בלחץ שלם¹¹ ו/או נימי-parenchymal arteriole (CaPA)^{הכנות 12}. מבודדים טריים, תאי אנדותל מוחיים מקומיים נטולי סוגי תאים אחרים וגורמים מבלבלים לא נבדקו, ככל הנראה בשל קשיים טכניים בבידודם. נייר זה מקדם טכניקה קודמת המדגישה את הבידוד של אנדותל עורקי פיאלי¹³ כדי כעת לבודד באופן אמין ורבייה את האנדותל של עורקי פרנצ'ימל במוח (רוחב: ~ 25 מיקרומטר, אורך: ~ 250 מיקרומטר). טכניקה זו מסייעת להשיג רזולוציה אופטימלית של תאים מצמידים חשמלית וכימית באוריינטציה האישית שלהם וברשתות הסלולריות שלהם.

נתיבים מרכזיים של עניין כללו את האינטראקציה של Ca²⁺ תאיים ([Ca²⁺]_i) איתות והיפר-קוטביזציה של פוטנציאל הממברנה (V_m)^14,15 – אינטגרלי להתרחבות כלי דם¹⁶ – כדי לאפשר לדם להיכנס לנימים ולספק חמצן וחומרים מזינים לפרנצ'ימה^{פעילה 17}. תכשירים אלה מאפשרים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בזמן אמת של ערוצי יונים, כולל Ca^{2 +} -permeant, פוטנציאל קולטן חולף (TRP) ו- K ⁺ ערוצים ו / או הדמיה פלואורסצנטית של אברונים תאיים בתוך צינורות תא אנדותל בתנאים כמעט פיזיולוגיים. זוהי טכניקה מתאימה לחוקרים המעוניינים במנגנונים תאיים פיזיולוגיים השולטים בשליטה בתאי אנדותל על אספקת זרימת הדם המוחית לפרנצ'ימה במוח. בסך הכל, טכניקה זו תסייע לחוקרים להבין טוב יותר מסלולי איתות אנדותל בסיסיים ותקשורת רשת של עורקים המוטמעים בפרנצ'ימה במוח תוך התייחסות לשאלות הקשורות לפיזיולוגיה ופתולוגיה של כלי הדם במוח.

Protocol

על הנסיינים לוודא כי שימוש ייעודי בבעלי חיים ובפרוטוקולים הקשורים אליהם יאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) ויבוצע בהתאם ל"מדריך הטיפול והשימוש בחיות מעבדה" של מועצת המחקר^{הלאומית (} מהדורה 8, 2011) והנחיות ARRIVE. IACUC של אוניברסיטת לומה לינדה ואוניברסיטת אריזונה אישר את כל הפרוטוקולים המשמשים עבור כתב יד זה עבור C57BL / 6N ו 3xTg-AD עכברים (זכרים ונקבות; טווח גילאים: 2-30 חודשים). ראו איור 1 בסקירה כללית של הבידוד והבדיקה של צינורות אנדותל עורקיים המבודדים זה עתה מעורקי הפרנצ'ימליה של המוח.

1. חומרים וציוד

הערה: עיין בטבלת החומרים עבור כל הריאגנטים והחומרים הדרושים לפרוטוקול זה. בנוסף, ניתן להתייעץ גם עם מדריכים ואתרי אינטרנט המשויכים לספקים המתאימים לפי הצורך. איורים של תחנות ניתוח ומנגנוני ניסוי סופקו בעבר¹³.

1. תא זרימה
   1. הדקו תא על עם כיסוי זכוכית על פלטפורמה המורכבת מאלומיניום אנודייז. אבטחו את הפלטפורמה עם התא על במת מיקרוסקופ אלומיניום.
   2. הגדר מיקרו-מניפולטור המחזיק פיפטה מצמידה בכל קצה של הפלטפורמה על במת מיקרוסקופ האלומיניום.
      הערה: במידת הצורך, השתמש במנגנון שלב הניתן להעברה עם יחידת תא זרימה כדי להעביר צינור אנדותל מאובטח ומבודד ממנגנון מיקרוסקופ אחד למשנהו לצורך ניסויים.
2. מיקרוסקופים
   1. השתמשו בסטריומימיקרוסקופים (טווח הגדלה של פי 5 עד פי 50) ובמקורות אור סיבים אופטיים להליכי ניתוח.
   2. לבידוד צינורות אנדותל, השתמש באסדת מיקרוסקופ הפוכה המצוידת במטרות תואמות ניגודיות פאזה או הפרעות דיפרנציאליות (DIC) (10x, 20x ו- 40x) ושלב אלומיניום.
   3. יש בקר משאבת מיקרו מזרק מוכן ליד המנגנון המוקדש בידוד צינורות אנדותל מכלי דם מתעכלים חלקית.
   4. הגדר את המנגנון הניסיוני על ידי סידור מיקרוסקופ הפוך (מטרות: 4x, 10x, 20x, 40x ו- 60x) ושלב אלומיניום ידני על שולחן בידוד רטט.
3. ציוד הקלטה V_m תאי
   1. חבר את האלקטרומטר לבמה תואמת. השתמש באביזרים, כגון מחולל פונקציות וממריץ, עבור פרוטוקולים הדורשים הזרקה נוכחית.
   2. חבר יציאות מגבר למערכת דיגיטציה של נתונים, אוסצילוסקופ וצגים בסיסיים נשמעים. אבטחו את אלקטרודת אמבט הייחוס (גלולה Ag/AgCl) ליד היציאה מתא הזרימה.
   3. להרכיב מערכת פוטומטרית עם רכיבים משולבים של ממשק מערכת פלואורסצנטיות, מנורת קשת בעוצמה גבוהה ואספקת חשמל, hyperswitch, צינור פוטומולטיפלייר (או PMT), ומצלמה כדי למדוד [Ca^{2 +}]_i בתאי אנדותל.
   4. להרכיב בקר טמפרטורה מצויד תנור מוטבע כדי להעלות ולשמור על טמפרטורה פיזיולוגית (37 °F) לאורך כל הניסוי.
   5. להרכיב פלטפורמה רב ערוצית מחובר בקר שסתום עם שסתום בקרת זרימה מוטבעת כדי לשלוט באספקת פתרונות צינורות אנדותל מאובטח בתא.
4. מיקרופיפטיות ואלקטרודות חדות
   הערה: הנסיין יזדקק למושך זכוכית אלקטרוני ולמיקרו-פורג' להכנת טריטוריה והצמדת פיפטות.
   1. כדי להפריד את צינור האנדותל ממקטע arteriolar מתעכל חלקית, להכין פיפטות trituration מלוטשות חום (קוטר קצה פנימי: 30-50 מיקרומטר) מן נימי זכוכית borosilicate.
   2. כדי לאבטח את צינור האנדותל בתא superfusion, להכין פיפטות הצמדה מלוטשות בחום עם קצה כדורי קהה (קוטר חיצוני: 50-70 מיקרומטר) מוכן נימי זכוכית בורוסיליקט קיר דק.
   3. כדי להקליט V_m של תא אנדותל, להכין אלקטרודות חדות עם התנגדות קצה של ~ 150 ± 30 MΩ מנימי זכוכית באמצעות מושך זכוכית בלבד.

2. פתרונות ותרופות

1. תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS)
   1. הכן מינימום של 1 L של PSS באמצעות 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N'-2-חומצה אתנולפית (HEPES), ו 10 מ"מ גלוקוז.
   2. הכן פתרונות הכרחיים חסר CaCl₂ (אפס Ca^{2 +} PSS) עבור ניתוח של arterioles המוחי ובידוד של צינור אנדותל.
      הערה: הכן את כל הפתרונות ב- H₂O שעבר אולטרה-רפוי, ולאחר מכן סינון (0.22 מיקרומטר). ודא שהמוצר הסופי מכיל pH 7.4 עם osmolality בין 290 ל 300 mOsm.
2. אלבומין סרום בקר (BSA, 10%)
   1. להמיס 1 גרם של אבקת BSA lyophilized בכוס של 10 מ"ל של אפס Ca^{2 +} PSS. מכסים את הכוס ולאפשר לפחות 2 שעות עם ערבוב איטי עבור BSA להתמוסס.
   2. פתרון סינון באמצעות מזרק 10 מ"ל בתוספת מסנן 0.22 מיקרומטר ולהכין aliquots 1 מ"ל לאחסן ב -20 °C (60 °F).
3. פתרון ביתור
   1. הוסף 500 μL של BSA (10%) ל 49.5 מ"ל של אפס Ca^{2 +} PSS עבור נפח כולל של 50 מ"ל.
   2. מעבירים את התמיסה לצלחת פטרי לניתוחים עורקיים.
4. פתרון דיסוציאציה
   1. הוסף 5 μL של פתרון CaCl₂ (1 M) ו 500 μL של BSA (10%) ל 49.5 מ"ל של אפס Ca^{2 +} PSS עבור נפח כולל של 50 מ"ל. פתרון דגירה בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעות.
5. אנזימים
   1. הכינו 1 מ"ל של פתרון עיכול עם 100 מיקרוגרם / מ"ל פפאין, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל קולגנאז (תערובת סוג H), ו 40 מיקרוגרם / מ"ל אלסטאז.
      הערה: פעילויות אנזימים יכולות להשתנות, אם כי פרוטוקולים מוצלחים עשויים לדרוש את הפעילויות אנזימטיות הבאות: ≥ 10 יחידות / מ"ג עבור פפאין, ≥ 1 יחידה / מ"ג עבור collagenase, ו ≥ 5 יחידות / מ"ג עבור אלסטאז.
6. פורה-2 וסוכנים פרמקולוגיים
   1. הכינו מלאי פורה-2 AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO; 1 מ"מ). הכן 500 μL של ריכוז עבודה (10 μM) על ידי הוספת 5 μL של המניה ל 495 μL של PSS לטעינה.
   2. הכן לפחות 50 מ"ל של ריכוזי עבודה של סוכנים פרמקולוגיים ב- PSS או DMSO לפי הצורך.
7. פתרון ניהול
   1. הכן 2 M KCl על ידי המסת KCl ב H₂O deionized (7.455 גרם של KCl ב 50 מ"ל של H₂O). העבירו את הפתרון דרך מזרק עם מסנן של 0.22 מיקרומטר לפני מילוי האלקטרודות החדות.
8. גששי אברונים פלואורסצנטיים ונוגדנים
   1. הכן קרום פלזמה או organellar (למשל, גרעין, reticulum אנדופלסמי) גששים בתמיסת המלח הפיזיולוגית המתאימה על פי הוראות היצרן.
   2. הכן נוגדנים ראשוניים ומשניים בהתאם להוראות היצרן בתמיסת המלח הפיזיולוגית המתאימה.

3. ביתור ובידוד של עורקים מוחיים של עכבר

הערה: סטריאומיקרוסקופים וכלי מיקרודיסקציה מחודדים (לדוגמה, מלקחיים בעלי קצה דק, מספריים לחיתוך בסגנון ואנה) חייבים לשמש להגדלת דגימה (עד פי 50) בכל הליכי הניתוח האלה.

1. בידוד של מוח העכבר
   1. להרדים עכבר מעבדה סטנדרטי (למשל, C57BL/6, 3xTg-AD; בן 2-30 חודשים, זכר או נקבה) באמצעות שאיפת איזופלוראן (3% במשך 2-3 דקות), ואחריו עריפת ראש מיידית באמצעות מספריים חדים או גיליוטינה לכל אישור IACUC. מניחים את ראש העכבר בצלחת פטרי (קוטר 10 ס"מ, עומק 1.5 ס"מ) המכילה פתרון ביתור קר (4 °C (6 °F).
   2. בעת צפייה תחת סטריאומיקרוסקופ, להסיר את העור והשיער מעל הגולגולת ולשטוף דם מוגזם עם פתרון ביתור קר. באמצעות קצות מספריים ביתור סטנדרטיים (למשל, להבי 24 מ"מ), לעשות חתך החל מהעצם העורפית ולהשתרע למעלה דרך עצם האף של הגולגולת. השתמש במלקחיים גסים כדי לפתוח בזהירות את הגולגולת לאורך החתך, ולהפריד רקמת חיבור (קרום המוח) כדי לבודד את המוח המכיל מעגל שלם של ויליס.
   3. לשטוף את המוח המבודד עם פתרון ביתור קר בכוס או צלחת פטרי כדי להסיר את הדם הנותר מפני השטח של המוח. מניחים את צד הגחן של המוח פונה כלפי מעלה בתא המכיל תמיסת כריתה קרה לבידוד של עורקים פרנצימליים (איור 2A).
2. בידוד של עורקים פרנצ'ימליים
   הערה: Arterioles הנובעים מהעורקים המוחיים האמצעיים (MCAs) ומוטמעים בפרנצ'ימה במוח נבחרים עבור פרוטוקול זה. העורקים מבודדים כפי שתואר בעבר¹¹, עם שינוי.
   1. השתמש סיכות פלדה (קוטר: 0.2 מ"מ, אורך: 11 עד 12 מ"מ) כדי לאבטח את המוח המבודד בתמיסת כריתה קרה בצלחת פטרי המכילה ציפוי סיליקון פולימר חדורי פחם (עומק ≥ 50 ס"מ).
   2. בעזרת מספריים חדים ומיושרים, חותכים מלבן של רקמת המוח (אורך: 5 מ"מ, רוחב: 3 מ"מ) (איור 2B) סביב ה-MCA תוך הבטחה שהחלק העליון של מקטע הרקמה נמצא מעבר לנקודת ההסתעפות ממעגל וויליס. חותכים מלבן נוסף של רקמת המוח מחצי הכדור האחר של המוח כדי לגשת לעורקיים נוספים במידת הצורך.
   3. אבטחו את מקטע רקמת המוח המופרדת לתוך המנה כאשר ה- MCA פונה כלפי מעלה (דיסטלי ממעגל ויליס) באמצעות סיכות פלדה (קוטר: 0.1 מ"מ, אורך: 13 עד 14 מ"מ). בצעו בזהירות חתך רדוד ליד הפינים כדי להסיר את הפיה עם מלקחיים קטנים, תוך קילוף עדין מקצה אחד לכיוון השני (איור 2C). הסר את הפיה ממקטע הרקמה האחר כדי לגשת לעורקים נוספים במידת הצורך. אבטחו בקפידה את הפיה המבודדת עם עורקים פרנצ'ימליים המסתעפים מ-MCA בצלחת עם הסיכות, וניתחו את העורקים הפרנצ'ימליים (איור 2D), כדי להבטיח שהעורקים לא ייפגעו.
      הערה: אם העורקים אינם נשלפים בקלות עם הפיה מהפרנצ'ימה, השתמשו במלקחיים עדינים וחפרו במוח, החל בנקודת הסניף של MCA ממעגל וויליס. אתר את העורקים, שחרר בזהירות את הרקמה סביב עורקים (איור 2E), ומשוך בעדינות את העורקים מהפרנצ'ימה, תוך החזקת הקצה העליון של העורקים (איור 2F). עורקים מרובים (אורך: ~ 1.5-2 מ"מ) ניתן לבודד מלבן אחד של רקמת המוח.
   4. ודאו שהעורקים נקיים ללא רקמות מחוברות אליו, וחתכו את כל הענפים הדיסטליים הנותרים (איור 3A). השתמש בעורק העורקים הנקי והשלם הזה לעיכול אנזימטי. לחלופין, לחתוך כל arteriole לשני חלקים (אורך: 0.75-1 מ"מ) לעיכול אנזימטי להכנת צינורות אנדותל אם תרצה.

4. עיכול של עורקי parenchymal והכנת צינורות אנדותל

1. סידור ציוד ופיפטות
   הערה: בידוד של צינורות אנדותל עורקיים מהמוח תואר בעבר^13,18. הפרוטוקול הנוכחי משלב שינויים לבידוד של אנדותל מעורקי פרנצ'ימלי (תוך מוחי). עורקים מרובים או /וחתיכות של arterioles ניתן להשתמש יחד לעיכול אנזימטי.
   1. להרכיב את מנגנון trituration¹³ להכנת צינורות אנדותל באמצעות שלב אלומיניום התומך תא micromanipulators. הרכב מיקרוסקופ המצויד במטרות (5x-60x) ומצלמה המחוברת לצג מחשב. אבטחו מיקרו-מזרק עם בקר משאבה ליד הבמה והדגימה.
   2. אבטחו פיפטה משולשת ממולאת בשמן מינרלי מעל בוכנה מיקרו-מזרקית. השתמש במיקרו-מזרק עם בקר המשאבה כדי למשוך את פתרון הדיסוציאציה לפיפטה trituration (~ 130 nL) על גבי השמן המינרלי תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר בפיפטה.
2. עיכול חלקי של מקטעי עורקים
   1. מניחים מקטעי arteriolar שלמים לתוך 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה בצינור זכוכית 10 מ"ל המכיל פפאין 100 מיקרוגרם / מ"ל, 170 מיקרוגרם / מ"ל dithioerythritol, 250 מיקרוגרם / מ"ל קולגנאז, ו 40 מיקרוגרם / מ"ל אלסטאז. אינגרה מקטעים arteriolar ב 34 °C (50 °F) במשך 10-12 דקות.
   2. לאחר העיכול, החליפו את תמיסת האנזים ב-3-4 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה טרייה בטמפרטורת החדר.
3. בידוד של צינור אנדותל עורקי
   הערה: לאחר עיכול והחלפת תמיסת האנזים, העבר מקטע אחד או יותר מתעכל חלקית לפתרון הניתוק בתא superfusion המחובר לפלטפורמה ניידת. בעת צפייה בהגדלה של פי 100 עד 200, בחר מקטע כלי אחד מתעכל חלקית אך לא שבור והתמקד בו מתחת למיקרוסקופ.
   1. מניחים את פיפטת הטריטורציה המחוברת למזרק המיקרו-מזרק בתמיסת הדיסוציאציה בתא ומקם אותה קרוב לקצה אחד של קטע כלי השיט המעוכל. הגדר קצב בטווח של 1-3 nL/s בבקר המשאבה לטריטורציה עדינה.
   2. תוך שמירה על הגדלה של פי 100 עד פי 200, משכו את מקטע העורקים לתוך הפיפטה ולאחר מכן הוציאו כדי לנתק את ההמצאה ואת תאי השריר החלקים (איור 3B). בצע טריטורציה של מקטע כלי הדם עד שכל תאי השריר החלקים יתנתקו, ורק תאי אנדותל יישארו כ"צינור" שלם.
      הערה: במידת הצורך במהלך הטריטורציה, יש להשתמש בזהירות במלקחיים עדינים כדי להסיר את ההרפתנטיה המנותקת ואת הלמינה האלסטית הפנימית מצינור האנדותל. בדרך כלל, רק כמה מחזורים של טריטורציה מניבים צינור אנדותל שלם.
   3. השתמשו במיקרו-מניפולטורים כדי לאבטח כל קצה של צינור האנדותל על כיסוי הזכוכית בתא עם פיפטות מצמידות זכוכית בורוסיליקט (איור 3C,D).
4. אבטחת צינור האנדותל העורקים
   1. החלף את פתרון הפירוק בתמיסת superfusion (PSS המכיל 2 mM CaCl₂) תוך הקפדה על כך שחומר לא נדלי נשטף מהתא.
   2. העבר צינור אנדותל מאובטח בפלטפורמה הניידת לאסדת המיקרוסקופ המיועדת לתוספת-על רציפה ולהקלטות/הדמיה תאיות או פלואורסצנטיות.
   3. החל אספקה רציפה של PSS במהלך הניסוי. הגדר באופן ידני את קצב הזרימה (5-7 מ"ל / דקה) לאורך כל הניסוי באמצעות שסתום בקרת הזרימה המוטבעת, בקנה אחד עם זרימת למינאר, תוך התאמת ההזנה של זרימת הפתרון למידת יניקת ואקום. אפשר ≥5 דקות של זרימת PSS לתא לציפוי-על של צינור האנדותל לפני רכישת נתוני רקע ו/או טעינת צבע.

5. ניצול צינורות אנדותל עורקיים לבדיקת פיזיולוגיה תאית

הערה: צינורות אנדותל עורקיים מבודדים ומאובטחים יכולים לשמש להקלטות תאיות של [Ca²⁺]_i dynamics ו- V_m באמצעות פוטומטריה ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה, בהתאמה, כפי שהודגם בעבר¹³ (איור 4). [Ca²⁺] i ו-V_m ניתנים למדידה כמשתנים ניסיוניים נפרדים או משולבים לפי הצורך¹³ (איור 4). עם זאת, צינורות אנדותל arteriolar הם עדינים יותר מאשר אנדותל עורקי, וזמן הניסויים לא יעלה על 1 h.

1. מדידה של [Ca²⁺]_i
   1. הפעל את הציוד והתוכנה להקלטות [Ca²⁺]_i תוך שמירה על עירוך-על רציף בקצב זרימה של 5-7 מ"ל/דקה.
   2. טען את צינור האנדותל עם Ca^{2 +} צבע Fura - 2 AM במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם פתרון superfusion עוד 20-30 דקות תוך העלאת טמפרטורת האמבטיה בהדרגה ל 37 °C (50 °F). שמור על הטמפרטורה ב 37 °C (50 °F) לאורך כל הניסוי.
   3. התאם ידנית את חלון ההדמיה באמצעות תוכנת פוטומטריה כדי להתמקד בכ-20 תאי אנדותל (איור 4A). בהיעדר אור, הפעל את ה- PMT בממשק הפלואורסצנטיות ולהתחיל ברכישת [Ca²⁺]_i על ידי Fura-2 מרגש לסירוגין (≥10 הרץ) ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר תוך איסוף פליטת פלואורסצנטיות ב 510 ננומטר. לאחר שהוקמה הקלטה בסיסית יציבה של [Ca²⁺]_i , יש למרוח חומרים פרמקולוגיים (למשל, אגוניסטים של קולטן פורינרגי) לכל מטרה ניסיונית (איור 4B).
2. מדידה של V_m
   1. הפעל את הציוד והתוכנה עבור הקלטות V_m והגדר את קצב רכישת הנתונים (≥10 הרץ) תוך שמירה על superfusion מתמשך בקצב זרימה של 5-7 מ"ל / דקה. בהדרגה להעלות את טמפרטורת האמבטיה ל 37 °C (50 °F) ולשמור אותו עד סוף הניסוי.
   2. משוך אלקטרודה חדה באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט, מילוי אחורי עם 2 M KCl, ואבטח אותו מעל חוט כסף מצופה כלוריד במחזיק פיפטה המחובר אלקטרומטר, כי בתורו, מוחזק על ידי micromanipulator.
   3. בעת צפייה דרך המטרה 4x, להשתמש micromanipulator כדי למקם בזהירות את קצה האלקטרודה החד רק מעל תא של צינור אנדותל arteriolar לתוך PSS זורם בתא.
   4. הגדל בהדרגה את ההגדלה ל-400x ומקם מחדש את קצה האלקטרודה לפי הצורך.
   5. בעזרת המיקרו-מניפולטור, הכנס בעדינות את קצה האלקטרודה החדה לאחד מתאי צינור האנדותל והתחל להקליט V_m באמצעות אלקטרומטר (איור 4A).
   6. לאחר שה-V_m במנוחה של האנדותל יציב (−30 עד −40 mV), החל את הסוכנים הפרמקולוגיים הרצויים לפי יעד ניסיוני (איור 4C).

6. הדמיה תאית

הערה: צינורות אנדותל המאובטחים בחדר של הפלטפורמה הניידת יכולים לשמש גם להדמיה מיקרוסקופית הן בתנאים חיים והן בתנאים קבועים¹⁹ באמצעות פלואורסצנטיות סטנדרטית או מיקרוסקופיה קונפוקלית. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים שונים עבור קולטנים וערוצי יונים ניתן ליישם גם כפי שתואר בעבר²⁰.

1. טען את צינור אנדותל עם גשש פלואורסצנטיות עבור קרום הפלזמה או אברון הרצוי (למשל, גרעין, רשתית אנדופלסמית) ב 37 °C (65 °F) במשך 15-30 דקות.
2. שטפו את התאים עם PSS טרי של עירוי-על ותאים חיים של תמונה מתחת למיקרוסקופ באורך הגל של העירור של הצבעים המתאימים (איור 4D,E).
   הערה: אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע במודל צינור זה באמצעות נוגדנים מעניינים.

תוצאות

הדגמה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1 עם ניתוח עורקי וצעדי בידוד צינור אנדותל כאיור 2 ואיור 3, בהתאמה. כאן, תפקוד אנדותל הוערך על ידי מדידה [Ca²⁺]_i ו- V_m באמצעות פוטומטריה Fura-2 ואלקטרופיזיולוגיה אלקטרודה חדה (איור 4A) בת?...

Discussion

ראיות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמחלות כלי דם במוח (CVD), הזדקנות ומחלת אלצהיימר קשורות קשר הדוק והן נושא נוכחי של מחקר דמנציה 4,8,14,21. לכן, ברור כי מחקרים של רשת כלי הדם במוח תהיה השפעה רחבה על הבריאות תוך דרישת המשך חקירה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (porcine pancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potassium Chloride	Sigma	P9541
MgCl2: Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscope objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pump Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibration Isolation Table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g