Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Riepilogo

La preparazione intensiva di "tubi" endoteliali cerebrali di topo intatti da arteriole parenchimali cerebrali è illustrata per lo studio della regolazione del flusso sanguigno cerebrale. Inoltre, dimostriamo i punti di forza sperimentali di questo modello di studio endoteliale per l'imaging a fluorescenza e la misurazione elettrofisiologica delle principali vie di segnalazione cellulare, compresi i cambiamenti nel potenziale intracellulare [Ca²⁺] e di membrana.

Abstract

Il flusso sanguigno cerebrale è trasmesso dalle arterie di resistenza vascolare e dalle arteriole parenchimali a valle. La resistenza vascolare allo stato stazionario al flusso sanguigno aumenta con la diminuzione del diametro dalle arterie alle arteriole che alla fine alimentano i capillari. A causa delle loro dimensioni e posizione più piccole nel parenchima, le arteriole sono state relativamente poco studiate e con una minore riproducibilità nei reperti rispetto alle arterie piali superficiali. Indipendentemente da ciò, la struttura e la funzione delle cellule endoteliali arteriolari, parte integrante della fisiologia e dell'eziologia delle malattie degenerative croniche, richiedono un'indagine approfondita. In particolare, prove emergenti dimostrano che la funzione endoteliale compromessa precede ed esacerba il deterioramento cognitivo e la demenza.

Nella microcircolazione parenchimale, la funzione del canale K⁺ endoteliale è lo stimolo più robusto per controllare finemente la diffusione della vasodilatazione per promuovere aumenti del flusso sanguigno verso le aree di attività neuronale. Questo documento illustra un metodo raffinato per isolare di nuovo "tubi" endoteliali intatti ed accoppiati elettricamente (diametro, ~ 25 μm) dalle arteriole parenchimali del cervello di topo. I tubi endoteliali arteriolari sono fissati durante le condizioni fisiologiche (37 °C, pH 7,4) per risolvere le variabili sperimentali che comprendono la funzione del canale K⁺ e la loro regolazione, tra cui la dinamica intracellulare di Ca²⁺ , i cambiamenti nel potenziale di membrana e la regolazione lipidica di membrana. Un netto vantaggio tecnico rispetto all'endotelio arterioso è la maggiore risoluzione morfologica delle dimensioni delle cellule e degli organelli (ad esempio, i mitocondri), che espande l'utilità di questa tecnica. Una sana perfusione cerebrale per tutta la vita comporta una robusta funzione endoteliale nelle arteriole parenchimali, collegando direttamente il flusso sanguigno all'alimentazione dell'attività neuronale e gliale in precise regioni anatomiche del cervello. Pertanto, si prevede che questo metodo farà progredire significativamente la conoscenza generale della fisiologia vascolare e delle neuroscienze riguardanti il cervello sano e malato.

Introduzione

Le arteriole parenchimali forniscono direttamente ossigeno e sostanze nutritive essenziali in tutto il cervello¹. Durante l'interfacciamento con i capillari, le arteriole altamente vasoattive rispondono alla segnalazione retrograda avviata dai canali ionici capillari che rilevano i segnali metabolici provenienti da specifiche regioni neuronali². Con il parenchima cerebrale che ha storicamente ricevuto la maggior parte delle indagini, è ora emerso un ruolo per la disfunzione endoteliale per chiarire i meccanismi patologici associati a vari disturbi cerebrovascolari che sono alla base della demenza (ad esempio, ictus ischemico, morbo di Alzheimer)3,4,5,6 . L'endotelio è parte integrante della perfusione del cervello in accordo con l'eterogeneità della genetica, della struttura e della funzione in tutti i segmenti vascolari⁷. Le arterie piali sono state ampiamente studiate a causa delle loro dimensioni relativamente grandi, dell'elevata resistenza vascolare segmentale e del ruolo nella distribuzione del flusso sanguigno al cervello sottostante ^8,9. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi endoteliali arteriolari probabilmente migliorerà la comprensione della regolazione del flusso sanguigno cerebrale in salute e malattia verso lo sviluppo di nuovi regimi terapeutici.

Le evidenze emergenti evidenziano l'importanza di studiare le arteriole parenchimali in relazione a diverse vie di segnalazione e malattie ^8,10. Tuttavia, questo approccio è stato limitato all'uso di arteriola¹¹ pressurizzata intatta e / o preparazioni di arteriola capillare-parenchimale (CaPA)¹². Le cellule endoteliali arteriolari cerebrali native appena isolate, prive di altri tipi di cellule e fattori confondenti non sono state esaminate, probabilmente a causa di difficoltà tecniche nel loro isolamento. Questo documento avanza una tecnica precedente che evidenzia l'isolamento dell'endotelio arterioso¹³ per isolare in modo affidabile e riproducibile l'endotelio delle arteriole parenchimali cerebrali (larghezza: ~ 25 μm, lunghezza: ~ 250 μm). Questa tecnica aiuta a raggiungere una risoluzione ottimale delle cellule accoppiate elettricamente e chimicamente nel loro orientamento individuale e nelle reti cellulari.

Le principali vie di interesse hanno incluso l'interazione della segnalazione intracellulare di Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) e l'iperpolarizzazione del potenziale di membrana (V_m)^14,15 - parte integrante della vasodilatazione¹⁶ - per consentire al sangue di entrare nei capillari e fornire ossigeno e sostanze nutritive al parenchima attivo¹⁷. Questi preparati consentono registrazioni elettrofisiologiche in tempo reale dei canali ionici, inclusi i canali Ca²⁺-permeant, transient receptor potential (TRP) e K⁺ e/o l'imaging fluorescente di organelli intracellulari all'interno di tubi cellulari endoteliali in condizioni quasi fisiologiche. Questa è una tecnica adatta per i ricercatori interessati ai meccanismi cellulari fisiologici che governano il controllo delle cellule endoteliali della consegna del flusso sanguigno cerebrale al parenchima cerebrale. Complessivamente, questa tecnica aiuterà i ricercatori a comprendere meglio le vie di segnalazione endoteliali fondamentali e la comunicazione di rete delle arteriole incorporate nel parenchima cerebrale, affrontando al contempo le domande relative alla fisiologia e alla patologia cerebrovascolare.

Protocollo

Gli sperimentatori dovrebbero garantire che l'uso designato degli animali e dei protocolli associati sia approvato dal loro Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) ed eseguito in conformità con la "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" del Consiglio nazionale delle ricerche (^8a edizione, 2011) e le linee guida ARRIVE. La IACUC della Loma Linda University e dell'Università dell'Arizona ha approvato tutti i protocolli utilizzati per questo manoscritto per topi C57BL/6N e 3xTg-AD (maschi e femmine; fascia di età: 2-30 mesi). Vedere la Figura 1 come panoramica dell'isolamento e dell'esame dei tubi endoteliali arteriolari appena isolati dalle arteriole parenchimali del topo del cervello.

1. Materiali e attrezzature

NOTA: vedere la tabella dei materiali per tutti i reagenti e i materiali necessari per questo protocollo. Inoltre, se necessario, è possibile consultare manuali e siti Web associati ai rispettivi fornitori. Illustrazioni di stazioni di dissezione e apparati sperimentali sono state precedentemente fornite¹³.

1. Camera di flusso
   1. Fissare una camera di superfusione con un coperchio di vetro su una piattaforma composta da alluminio anodizzato. Fissare la piattaforma con la camera su uno stadio di microscopio in alluminio.
   2. Impostare un micromanipolatore che tiene una pipetta di bloccaggio a ciascuna estremità della piattaforma sul palco del microscopio in alluminio.
      NOTA: Se necessario, utilizzare un apparecchio a stadio trasferibile con un'unità a camera di flusso per spostare un tubo endoteliale isolato e protetto da un apparecchio per microscopio a un altro per la sperimentazione.
2. Microscopi
   1. Utilizzare stereomicroscopi (intervallo di ingrandimento da 5x a 50x) e sorgenti luminose in fibra ottica per le procedure di dissezione.
   2. Per l'isolamento dei tubi endoteliali, utilizzare un carro per microscopio invertito dotato di obiettivi compatibili con il contrasto di fase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC) (10x, 20x e 40x) e uno stadio in alluminio.
   3. Avere un controller della pompa a microsiringa pronto accanto all'apparecchio dedicato all'isolamento dei tubi endoteliali dai vasi sanguigni parzialmente digeriti.
   4. Impostare l'apparato sperimentale disponendo un microscopio invertito (obiettivi: 4x, 10x, 20x, 40x e 60x) e uno stadio manuale in alluminio su una tavola di isolamento dalle vibrazioni.
3. Apparecchio di registrazione intracellulare V_m
   1. Collegare l'elettrometro a un headstage compatibile. Utilizzare accessori, come un generatore di funzioni e uno stimolatore, per i protocolli che richiedono l'iniezione di corrente.
   2. Collegare le uscite dell'amplificatore a un sistema di digitalizzazione dei dati, oscilloscopio e monitor di base udibili. Fissare l'elettrodo del bagno di riferimento (pellet Ag/AgCl) vicino all'uscita della camera di flusso.
   3. Assemblare un sistema fotometrico con componenti integrati di un'interfaccia del sistema di fluorescenza, lampada ad arco ad alta intensità e alimentatore, iperinterruttore, tubo fotomoltiplicatore (o PMT) e telecamera per misurare [Ca²⁺]_i in celle endoteliali.
   4. Assemblare un regolatore di temperatura dotato di un riscaldatore in linea per aumentare e mantenere una temperatura fisiologica (37 °C) durante l'esperimento.
   5. Assemblare una piattaforma multicanale collegata a un controller della valvola con una valvola di controllo del flusso in linea per controllare l'erogazione di soluzioni ai tubi endoteliali fissati nella camera.
4. Micropipette ed elettrodi affilati
   NOTA: Lo sperimentatore avrà bisogno di un estrattore di vetro elettronico e di una microforgia per preparare pipette di triturazione e pinning.
   1. Per separare il tubo endoteliale dal segmento arteriolare parzialmente digerito, preparare pipette di triturazione lucidate a caldo (diametro interno della punta: 30-50 μm) da capillari di vetro borosilicato.
   2. Per fissare il tubo endoteliale nella camera di superfusione, preparare pipette di bloccaggio lucidate a caldo con un'estremità sferica smussata (diametro esterno: 50-70 μm) preparata da capillari di vetro borosilicato a parete sottile.
   3. Per registrare V_m di una cella endoteliale, preparare elettrodi affilati con una resistenza della punta di ~ 150 ± 30 MΩ dai capillari di vetro utilizzando solo l'estrattore di vetro.

2. Soluzioni e farmaci

1. Soluzione salina fisiologica (PSS)
   1. Preparare un minimo di 1 L di PSS utilizzando 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico acido (HEPES) e 10 mM di glucosio.
   2. Preparare le soluzioni necessarie prive di CaCl₂ (zero Ca²⁺ PSS) per la dissezione delle arteriole cerebrali e l'isolamento del tubo endoteliale.
      NOTA: Preparare tutte le soluzioni in H₂O deionizzato ultrapuro, seguito da filtrazione (0,22 μm). Assicurarsi che il prodotto finale contenga un pH 7,4 con osmolalità compresa tra 290 e 300 mOsm.
2. Albumina sierica bovina (BSA, 10%)
   1. Sciogliere 1 g di polvere di BSA liofilizzata in un becher da 10 ml di zero Ca²⁺ PSS. Coprire il becher e lasciare almeno 2 ore con agitazione lenta affinché il BSA si dissolva.
   2. Soluzione filtrante utilizzando una siringa da 10 mL più un filtro da 0,22 μm e preparare aliquote da 1 mL da conservare a -20 °C.
3. Soluzione di dissezione
   1. Aggiungere 500 μL di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca²⁺ PSS per un volume totale di 50 mL.
   2. Trasferire la soluzione in una capsula di Petri per dissezioni arteriolari.
4. Soluzione di dissociazione
   1. Aggiungere 5 μL di soluzione di CaCl₂ (1 M) e 500 μL di BSA (10%) a 49,5 mL di zero Ca²⁺ PSS per un volume totale di 50 mL. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
5. Enzimi
   1. Preparare 1 mL di soluzione digestiva con 100 μg/mL di papaina, 170 μg/mL ditioeritritolo, 250 μg/mL di collagenasi (miscela di tipo H) e 40 μg/mL di elastasi.
      NOTA: Le attività enzimatiche possono variare, anche se i protocolli di successo richiederanno probabilmente le seguenti attività enzimatiche: ≥ 10 unità / mg per la papaina, ≥ 1 unità / mg per la collagenasi e ≥ 5 unità / mg per l'elastasi.
6. Fura-2 e agenti farmacologici
   1. Preparare lo stock di Fura-2 AM in dimetilsolfossido (DMSO; 1 mM). Preparare 500 μL di concentrazione di lavoro (10 μM) aggiungendo 5 μL di stock a 495 μL di PSS per il carico.
   2. Preparare almeno 50 ml di concentrazioni di lavoro di agenti farmacologici in PSS o DMSO a seconda dei casi.
7. Soluzione conduttrice
   1. Preparare 2 M KCl sciogliendo KCl in H₂O deionizzato (7.455 g di KCl in 50 mL di H₂O). Passare la soluzione attraverso una siringa con un filtro da 0,22 μm prima di riempire gli elettrodi affilati.
8. Inseguitori di organelli fluorescenti e anticorpi
   1. Preparare i tracker a membrana plasmatica o organellare (ad es. nucleo, reticolo endoplasmatico) nella soluzione salina fisiologica appropriata secondo le istruzioni del produttore.
   2. Preparare gli anticorpi primari e secondari secondo le istruzioni del produttore nella soluzione salina fisiologica appropriata.

3. Dissezione e isolamento delle arteriole cerebrali del topo

NOTA: gli stereomicroscopi e gli strumenti di microdissezione affilati (ad esempio, pinze a punta fine, forbici di dissezione in stile Vannas) devono essere utilizzati per l'ingrandimento del campione (fino a 50x) in tutte queste procedure di dissezione.

1. Isolamento del cervello del topo
   1. Anestetizzare un topo da laboratorio standard (ad esempio, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 mesi, maschio o femmina) utilizzando l'inalazione di isoflurano (3% per 2-3 minuti), seguita da decapitazione immediata con forbici affilate o ghigliottina per approvazione IACUC. Posizionare la testa del topo in una capsula di Petri (diametro 10 cm, profondità 1,5 cm) contenente una soluzione di dissezione fredda (4 °C).
   2. Durante la visualizzazione sotto uno stereomicroscopio, rimuovere la pelle e i capelli sul cranio e lavare via il sangue in eccesso con una soluzione di dissezione fredda. Usando le punte delle forbici di dissezione standard (ad esempio, lame da 24 mm), fai un'incisione che inizia con l'osso occipitale e si estende attraverso l'osso nasale del cranio. Utilizzare pinze a punta grossa per aprire con cura il cranio lungo l'incisione e separare il tessuto connettivo (membrana meningea) per isolare il cervello contenente un cerchio di Willis intatto.
   3. Lavare il cervello isolato con una soluzione di dissezione a freddo in un becher o in una capsula di Petri per rimuovere il sangue rimanente dalla superficie del cervello. Posizionare il lato ventrale del cervello rivolto verso l'alto in una camera contenente soluzione di dissezione a freddo per l'isolamento delle arteriole parenchimali (Figura 2A).
2. Isolamento delle arteriole parenchimali
   NOTA: Le arteriole derivanti dalle arterie cerebrali medie (ICM) e incorporate nel parenchima cerebrale sono scelte per questo protocollo. Le arteriole sono isolate come precedentemente descritto¹¹, con modificazione.
   1. Utilizzare perni in acciaio (diametro: 0,2 mm, lunghezza: da 11 a 12 mm) per fissare il cervello isolato in una soluzione di dissezione fredda in una capsula di Petri contenente un rivestimento polimerico di silicio infuso di carbone (profondità ≥ 50 cm).
   2. Usando forbici di dissezione affilate e allineate, taglia un rettangolo di tessuto cerebrale (lunghezza: 5 mm, larghezza: 3 mm) (Figura 2B) attorno all'MCA assicurandoti che la parte superiore del segmento tissutale sia oltre il punto di ramificazione dal Cerchio di Willis. Taglia un altro rettangolo di tessuto cerebrale dall'altro emisfero del cervello per accedere a più arteriole, se necessario.
   3. Fissare il segmento di tessuto cerebrale separato nel piatto con l'MCA rivolto verso l'alto (distale dal Cerchio di Willis) usando perni di acciaio (diametro: 0,1 mm, lunghezza: da 13 a 14 mm). Fare con attenzione un'incisione poco profonda vicino ai perni per rimuovere la pia con una piccola pinza, sbucciando delicatamente da un'estremità verso l'altra (Figura 2C). Rimuovere la pia dall'altro segmento tissutale per accedere a più arteriole, se necessario. Fissare con cura la pia isolata con arteriole parenchimali ramificate da MCA nel piatto con gli spilli e sezionare le arteriole parenchimali (Figura 2D), assicurandosi che le arteriole non siano danneggiate.
      NOTA: Se le arteriole non sono facilmente estraibili con la pia dal parenchima, utilizzare una pinza fine e scavare nel cervello, a partire dal punto di diramazione MCA dal Cerchio di Willis. Individuare l'arteriola, allentare con cura il tessuto intorno alle arteriole (Figura 2E) e estrarre delicatamente l'arteriola dal parenchima, tenendo l'estremità superiore dell'arteriola (Figura 2F). Arteriole multiple (lunghezza: ~ 1,5-2 mm) possono essere isolate da un rettangolo di tessuto cerebrale.
   4. Assicurarsi che l'arteriola sia pulita senza tessuto attaccato ad essa e tagliare eventuali rami distali rimanenti (Figura 3A). Utilizzare questa arteriola pulita e intatta per la digestione enzimatica. In alternativa, tagliare ogni arteriola in due pezzi (lunghezza: 0,75-1 mm) per la digestione enzimatica per la preparazione di tubi endoteliali, se lo si desidera.

4. Digestione delle arteriole parenchimali e preparazione dei tubi endoteliali

1. Disposizione di attrezzature e pipette
   NOTA: L'isolamento dei tubi endoteliali arteriosi dal cervello è stato descritto in precedenza^13,18. L'attuale protocollo incorpora modifiche per l'isolamento dell'endotelio dalle arteriole parenchimali (intracerebrali). Arteriole multiple o / e pezzi di arteriole possono essere utilizzati insieme per la digestione enzimatica.
   1. Assemblare l'apparato di triturazione¹³ per la preparazione di tubi endoteliali utilizzando uno stadio in alluminio che supporta una camera e micromanipolatori. Assemblare un microscopio dotato di obiettivi (5x-60x) e una telecamera collegata al monitor di un computer. Fissare una microsiringa con un controller della pompa accanto al palco e al campione.
   2. Fissare una pipetta di triturazione riempita con olio minerale sul pistone della microsiringa. Utilizzare la microsiringa con il controller della pompa per prelevare la soluzione di dissociazione nella pipetta di triturazione (~ 130 nL) sopra l'olio minerale, facendo attenzione a evitare bolle d'aria nella pipetta.
2. Digestione parziale dei segmenti arteriolari
   1. Posizionare i segmenti arteriolari intatti in 1 mL di soluzione di dissociazione in un tubo di vetro da 10 mL contenente 100 μg/mL di papaina, 170 μg/mL ditioeritritolo, 250 μg/mL collagenasi e 40 μg/mL di elastasi. Incubare i segmenti arteriolari a 34 °C per 10-12 min.
   2. Dopo la digestione, sostituire la soluzione enzimatica con 3-4 ml di soluzione di dissociazione fresca a temperatura ambiente.
3. Isolamento del tubo endoteliale arteriolare
   NOTA: Dopo la digestione e la sostituzione della soluzione enzimatica, trasferire uno o più segmenti parzialmente digeriti nella soluzione di dissociazione in una camera di superfusione collegata a una piattaforma mobile. Durante la visualizzazione con ingrandimento da 100x a 200x, selezionare un segmento di vaso parzialmente digerito ma ininterrotto e concentrarsi su di esso al microscopio.
   1. Posizionare la pipetta di triturazione attaccata con l'iniettore della microsiringa nella soluzione di dissociazione nella camera e posizionarla vicino a un'estremità del segmento del recipiente digerito. Impostare una velocità compresa tra 1 e 3 nL/s sul controller della pompa per una triturazione delicata.
   2. Pur mantenendo un ingrandimento da 100x a 200x, prelevare il segmento arteriolare nella pipetta e quindi espellere per dissociare l'avventizia e le cellule muscolari lisce (Figura 3B). Triturare il segmento del vaso fino a quando tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate e solo le cellule endoteliali rimangono come un "tubo" intatto.
      NOTA: Se necessario durante la triturazione, utilizzare con attenzione pinze a punta fine per rimuovere l'avventizia dissociata e la lamina elastica interna dal tubo endoteliale. In genere, solo pochi cicli di triturazione producono un tubo endoteliale intatto.
   3. Utilizzare micromanipolatori per fissare ciascuna estremità del tubo endoteliale sul coperchio di vetro nella camera con pipette di bloccaggio in vetro borosilicato (Figura 3C, D).
4. Fissaggio del tubo endoteliale arteriolare
   1. Sostituire la soluzione di dissociazione con una soluzione di superfusione (PSS contenente 2 mM CaCl₂) assicurandosi che il materiale non evitaliale venga lavato fuori dalla camera.
   2. Trasferisci il tubo endoteliale protetto nella piattaforma mobile al carro per microscopio progettato per la superfusione continua e le registrazioni/imaging intracellulari o fluorescenti.
   3. Applicare la distribuzione continua di PSS durante l'esperimento. Impostare manualmente la portata (5-7 ml / min) durante l'esperimento utilizzando la valvola di controllo del flusso in linea, coerente con il flusso laminare, abbinando l'alimentazione del flusso della soluzione all'entità dell'aspirazione del vuoto. Consentire ≥5 minuti di flusso PSS alla camera per la superfusione del tubo endoteliale prima di acquisire dati di base e / o carico del colorante.

5. Utilizzo di tubi endoteliali arteriolari per l'esame della fisiologia cellulare

NOTA: I tubi endoteliali arteriolari isolati e fissati possono essere utilizzati per registrazioni intracellulari della dinamica [Ca²⁺]_i e V_m utilizzando rispettivamente la fotometria e l'elettrofisiologia degli elettrodi affilati, come precedentemente illustrato¹³ (Figura 4). [Ca²⁺] _i e V_m possono essere misurati come variabili sperimentali separate o combinate secondo necessit๳ (Figura 4). Tuttavia, i tubi endoteliali arteriolari sono più delicati dell'endotelio arterioso e il tempo di sperimentazione non deve superare 1 ora.

1. Misurazione di [Ca²⁺]_i
   1. Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni [Ca²⁺]_i mantenendo una superfusione continua a una portata di 5-7 ml/min.
   2. Caricare il tubo endoteliale con il colorante Ca²⁺ Fura-2 AM per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule con soluzione di superfusione per altri 20-30 minuti aumentando gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C. Mantenere la temperatura a 37 °C per tutto l'esperimento.
   3. Regolare manualmente la finestra di imaging utilizzando il software di fotometria per concentrarsi su ~ 20 cellule endoteliali (Figura 4A). In assenza di luce, ruotare il PMT sull'interfaccia di fluorescenza e iniziare l'acquisizione di [Ca²⁺]_i eccitando Fura-2 alternativamente (≥10 Hz) a 340 nm e 380 nm mentre si raccoglie l'emissione di fluorescenza a 510 nm. Una volta stabilita una registrazione basale stabile di [Ca²⁺]_i , applicare agenti farmacologici (ad esempio, agonisti del recettore purinergico) per obiettivo sperimentale (Figura 4B).
2. Misura di V_m
   1. Accendere l'apparecchiatura e il software per le registrazioni V_m e impostare la velocità di acquisizione dati (≥10 Hz) mantenendo la superfusione continua a una portata di 5-7 ml/min. Aumentare gradualmente la temperatura del bagno a 37 °C e mantenerla fino alla fine dell'esperimento.
   2. Tirare un elettrodo affilato usando un capillare di vetro borosilicato, riempirlo con 2 M KCl e fissarlo su un filo d'argento rivestito di cloruro nel supporto della pipetta collegato a un elettrometro, che a sua volta è tenuto da un micromanipolatore.
   3. Durante la visualizzazione attraverso l'obiettivo 4x, utilizzare un micromanipolatore per posizionare con attenzione la punta dell'elettrodo affilato appena sopra una cellula del tubo endoteliale arteriolare nel PSS che scorre nella camera.
   4. Aumentare gradualmente l'ingrandimento a 400x e riposizionare la punta dell'elettrodo secondo necessità.
   5. Utilizzando il micromanipolatore, inserire delicatamente la punta di un elettrodo affilato in una delle celle del tubo endoteliale e iniziare a registrare V_m utilizzando un elettrometro (Figura 4A).
   6. Una volta che il riposo endoteliale V_m è stabile (da -30 a -40 mV), applicare gli agenti farmacologici desiderati per obiettivo sperimentale (Figura 4C).

6. Imaging cellulare

NOTA: i tubi endoteliali fissati nella camera della piattaforma mobile possono essere utilizzati anche per l'imaging microscopico in condizioni sia vive che fisse¹⁹ utilizzando la fluorescenza standard o la microscopia confocale. L'immunoistochimica con anticorpi diversi per recettori e canali ionici può anche essere applicata come descritto in precedenza²⁰.

1. Caricare il tubo endoteliale con il tracker di fluorescenza per la membrana plasmatica o l'organello desiderato (ad esempio, nucleo, reticolo endoplasmatico) a 37 °C per 15-30 min.
2. Lavare le cellule con PSS di superfusione fresca e visualizzare le cellule vive al microscopio alla lunghezza d'onda di eccitazione dei rispettivi coloranti (Figura 4D, E).
   NOTA: L'immunoistochimica può essere eseguita su questo modello di tubo utilizzando anticorpi di interesse.

Risultati

Una dimostrazione del protocollo è mostrata in Figura 1 con le fasi di dissezione arteriolare e isolamento del tubo endoteliale come Figura 2 e Figura 3, rispettivamente. Qui, la funzione endoteliale è stata valutata misurando [Ca²⁺]_i e V_m utilizzando la fotometria Fura-2 e l'elettrofisiologia con elettrodi affilati (Figura 4A) in risposta a un agente farmacologico [2-...

Discussione

Prove crescenti suggeriscono che la malattia cerebrovascolare (CVD), l'invecchiamento e il morbo di Alzheimer sono fortemente correlati e sono un argomento attuale della ricerca sulla demenza 4,8,14,21. Pertanto, è ovvio che gli studi sulla rete cerebrovascolare avrebbero un ampio impatto sulla salute, pur richiedendo un'indagine approfondita continua durante le condizioni di malattia. Come pu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (porcine pancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potassium Chloride	Sigma	P9541
MgCl2: Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscope objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pump Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibration Isolation Table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g