JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

脳実質細動脈からの無傷のマウス脳内皮「チューブ」の集中的な調製は、脳血流調節を研究するために例示される。さらに、我々は、細胞内[Ca2+]および膜電位の変化を含む重要な細胞シグナル伝達経路の蛍光イメージングおよび電気生理学的測定のためのこの内皮研究モデルの実験的強みを実証する。

要約

脳血流は、血管抵抗動脈および下流実質細動脈によって搬送される。血流に対する定常状態の血管抵抗は、動脈から細動脈までの直径の減少とともに増加し、最終的に毛細血管に供給される。細動脈は実質におけるサイズと位置が小さいため、比較的研究されておらず、表面の円錐骨動脈よりも所見の再現性が低い。いずれにせよ、慢性変性疾患の生理学および病因に不可欠な動脈内皮細胞の構造および機能は、広範な調査を必要とする。特に、新たな証拠は、侵害された内皮機能が認知障害および認知症に先行し、悪化することを示している。

実質微小循環において、内皮K+チャネル機能は、血管拡張の広がりを細かく制御し、ニューロン活性領域への血流の増加を促進する最も堅牢な刺激である。この論文は、マウス脳実質細動脈から無傷で電気的に結合された内皮「チューブ」(直径、〜25μm)を新たに単離するための洗練された方法を示す。動脈内皮チューブは、生理学的条件(37°C、pH7.4)中に固定され、細胞内Ca2+ダイナミクス、膜電位の変化、膜脂質調節など、K+チャネル機能とその調節を包含する実験変数を解く。動脈内皮に対する明確な技術的利点は、細胞および細胞小器官(例えば、ミトコンドリア)次元の形態学的分解能の増強であり、これはこの技術の有用性を拡大する。生涯を通じて健康な脳灌流は、実質細動脈における堅牢な内皮機能を伴い、血流を脳の正確な解剖学的領域全体にわたるニューロンおよびグリア活性の燃料供給に直接結びつける。したがって、この方法は、健康な脳と病気の脳に関する血管生理学と神経科学の一般的な知識を著しく進歩させることが期待されます。

概要

実質細動脈は、脳全体に必須の酸素と栄養素を直接供給します1。毛細血管とインターフェースしている間、血管活性の高い細動脈は、特定のニューロン領域2からの代謝シグナルを感知する毛細血管イオンチャネルによって開始される逆行性シグナル伝達に応答する。脳実質が歴史的に多くの研究を受けてきたことから、認知症の根底にある様々な脳血管障害(虚血性脳卒中、アルツハイマー病など)に関連する病理学的メカニズムを明らかにするために、内皮機能障害の役割が浮上しています3,4,5,6 .内皮は、血管セグメント全体にわたる遺伝学、構造、および機能の不均一性に従って、脳の灌流に不可欠である7。膝動脈は、その比較的大きなサイズ、高い分節性血管抵抗、および基礎となる大脳への血流分布における役割のために広範囲に研究されている8,9。したがって、動脈内皮機構のよりよい理解は、新しい治療レジメンの開発に向けて、健康および疾患における脳血流調節の理解を深める可能性が高い。

新たな証拠は、異なるシグナル伝達経路および疾患に関連して実質細動脈を研究することの重要性を強調している8,10。しかしながら、このアプローチは、無傷の加圧細動脈11および/または毛細血管実質細動脈(CaPA)調製物12を使用することに限定されている。新たに単離された、他の細胞型および交絡因子を欠いた天然の大脳動脈内皮細胞は、おそらくそれらの単離における技術的困難のために、検査されていない。本稿は、鰭状動脈内皮13の単離を強調した以前の技術を進化させ、脳実質細動脈の内皮を確実かつ再現性よく単離する(幅:~25μm、長さ:~250μm)。この技術は、個々の配向および細胞ネットワークにおける電気的および化学的に結合された細胞の最適な分解能を達成するのに役立つ。

関心のある主要な経路には、血管拡張16に不可欠な膜電位(Vm)14,15の細胞内Ca2+([Ca2+]i)シグナル伝達および過分極の相互作用が含まれ、血液が毛細血管に入り、酸素および栄養素を活動実質に送達することを可能にする17。これらの調製物は、Ca2+透過性、一過性受容器電位(TRP)およびK+チャネルを含むイオンチャネルのリアルタイム電気生理学的記録および/またはほぼ生理学的条件下での内皮細胞管内の細胞内小器官の蛍光イメージングを可能にする。これは、脳実質への脳血流送達の内皮細胞制御を支配する生理学的細胞機構に関心のある研究者にとって適切な技術である。全体として、この技術は、脳血管生理学および病理学に関連する質問に対処しながら、脳実質に埋め込まれた細動脈の基本的な内皮シグナル伝達経路およびネットワーク通信をよりよく理解するのに役立ちます。

プロトコル

実験者は、動物の指定された使用および関連するプロトコルが、施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国立研究評議会の「実験動物のケアおよび使用のためのガイド」(第 8版、2011年)およびARRIVEガイドラインに従って実施されることを確認する必要があります。ロマリンダ大学とアリゾナ大学のIACUCは、C57BL/6Nおよび 3xTg-AD マウス(雄および雌;年齢範囲:2〜30ヶ月)について、この原稿に使用されるすべてのプロトコルを承認した。マウス実質脳の細動脈から新たに単離された動脈内皮管の単離および検査の概要として 図1 を参照されたい。

1. 材料・設備

メモ: このプロトコルに必要なすべての試薬および材料については、材料 表 を参照してください。さらに、必要に応じて、各ベンダーに関連するマニュアルやWebサイトも参照できます。解剖ステーションおよび実験装置のイラストは、予め提供されている13。

  1. フローチャンバー
    1. ガラスカバースリップを備えたスーパーフュージョンチャンバーを陽極酸化アルミニウムで構成されたプラットフォームに固定します。チャンバーのあるプラットフォームをアルミ顕微鏡ステージに固定します。
    2. プラットフォームの両端にピニングピペットを保持するマイクロマニピュレータをアルミニウム顕微鏡ステージ上にセットする。
      注:必要に応じて、フローチャンバユニットを備えた移送可能なステージ装置を使用して、固定された単離された内皮チューブを実験のためにある顕微鏡装置から別の顕微鏡装置に移動します。
  2. 顕微鏡
    1. 解剖手順には、実体顕微鏡(倍率5倍~50倍)と光ファイバー光源を使用してください。
    2. 内皮チューブを分離するには、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト(DIC)互換の対物レンズ(10x、20x、および40x)とアルミニウムステージを備えた倒立顕微鏡リグを使用してください。
    3. 部分的に消化された血管から内皮管を隔離する専用の装置の隣にマイクロシリンジポンプコントローラを用意してください。
    4. 防振テーブル上に倒立顕微鏡(対物レンズ:4x、10x、20x、40x、60x)と手動アルミステージを配置して実験装置を設置した。
  3. 細胞内VM 記録装置
    1. 電気計を互換性のあるヘッドステージに接続します。ファンクションジェネレータや刺激器などのアクセサリは、電流注入を必要とするプロトコルに使用します。
    2. アンプ出力をデータデジタイザシステム、オシロスコープ、可聴ベースラインモニタに接続します。参照バス電極(Ag/AgClペレット)をフローチャンバ出口近くに固定します。
    3. 蛍光システムインターフェース、高輝度有電極ランプと電源、ハイパースイッチ、光電子増倍管(またはPMT)、およびカメラのコンポーネントを統合した測光システムを組み立て、内皮細胞の[Ca2+]i を測定します。
    4. インラインヒーターを備えた温度コントローラを組み立て、実験を通して生理学的温度(37°C)を上昇および維持する。
    5. インライン流量制御バルブを備えたバルブコントローラに接続されたマルチチャネルプラットフォームを組み立てて、チャンバ内に固定された内皮チューブへの溶液の送達を制御します。
  4. マイクロピペットとシャープな電極
    注:実験者は、粉砕および固定ピペットを準備するための電子ガラスプーラーとマイクロフォージを必要とする。
    1. 内皮チューブを部分的に消化された動脈セグメントから分離するために、ホウケイ酸ガラス毛細血管から熱研磨された摩砕ピペット(内端径:30〜50μm)を調製する。
    2. 内皮チューブをスーパーフュージョンチャンバに固定するには、薄肉ホウケイ酸ガラス毛細血管から調製した鈍い球状端部(外径:50〜70μm)を備えた熱研磨ピニングピペットを調製する。
    3. 内皮細胞のVm を記録するには、ガラスプーラーのみを使用して、ガラス毛細血管から約150±30MΩの先端抵抗を有する鋭い電極を作製する。

2. 溶液と薬

  1. 生理食塩溶液(PSS)
    1. 140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、10 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)、および10 mM グルコースを使用して、最低1 LのPSSを調製する。
    2. CaCl2(ゼロCa2+ PSS)を欠く脳細動脈の解剖および内皮管の単離に必要な溶液を調製する。
      注:すべての溶液を超高純度脱イオン化H2Oで調製し、続いて濾過(0.22μm)を行う。最終製品に、オスモル濃度が 290 ~ 300 mOsm の pH 7.4 が含まれていることを確認します。
  2. ウシ血清アルブミン(BSA、10%)
    1. 凍結乾燥BSA粉末1gを、10mLのゼロCa2+ PSSのビーカーに溶解する。ビーカーを覆い、BSAが溶解するまでゆっくりと攪拌しながら少なくとも2時間待ちます。
    2. フィルター溶液に0.22 μmフィルターを加えた10 mLシリンジを使用し、-20°Cで保存する1 mLアリコートを調製する。
  3. 解剖溶液
    1. 500 μL の BSA (10%) を 49.5 mL のゼロ Ca2+ PSS に加え、総容量を 50 mL にします。
    2. 動脈解剖のためのペトリ皿への溶液の移送。
  4. 解離溶液
    1. 5 μL の CaCl2 溶液 (1 M) および 500 μL の BSA (10%) を 49.5 mL のゼロ Ca2+ PSS に加え、総容量を 50 mL にします。溶液を室温で少なくとも1時間インキュベートする。
  5. 酵素
    1. 100 μg/mL パパイン、170 μg/mL ジチオエリスリトール、250 μg/mL コラゲナーゼ(タイプHブレンド)、および 40 μg/mL エラスターゼを含む消化液 1 mL を調製します。
      注:酵素活性はさまざまですが、プロトコルを成功させるには、パパインの場合は≥10単位/ mg、コラゲナーゼの場合は≥1単位/ mg、エラスターゼの場合は≥5単位/ mgの酵素活性が必要になる可能性があります。
  6. Fura-2および薬理学的薬剤
    1. ジメチルスルホキシド(DMSO;1mM)中のFura-2 AMストックを調製する。負荷のために495 μLのPSSに5 μLのストックを加えて、500 μLの作業濃度(10 μM)を調製する。
    2. PSSまたはDMSO中の薬理学的薬剤の作用濃度の少なくとも50mLを適宜調製する。
  7. 導電性ソリューション
    1. KClを脱イオン化したH2O(50 mLのH2O中の7.455 gのKCl)に溶解して2M KClを調製する。鋭利な電極をバックフィルする前に、0.22μmフィルターを備えたシリンジに溶液を通す。
  8. 蛍光オルガネラトラッカーおよび抗体
    1. 原形質膜またはオルガネラー(例えば、核、小胞体)トラッカーを適切な生理食塩水に調製し、製造業者の指示に従ってください。
    2. 一次抗体および二次抗体は、製造者の指示に従って、適切な生理塩溶液中に調製する。

3. マウス大脳細動脈の解剖と単離

注:実体顕微鏡および鋭利な微小解剖ツール(例えば、先端の細かい鉗子、Vannasスタイルの解剖はさみ)は、これらすべての解剖手順において試料倍率(最大50倍)に使用する必要があります。

  1. マウス脳の単離
    1. 標準的な実験用マウス(例えば、C57BL/6、 3xTg-AD;生後2〜30ヶ月、雄または雌)をイソフルラン吸入(3%、2〜3分間)を用いて麻酔し、続いてIACUCの承認に従って鋭いはさみまたはギロチンを用いて即時断頭する。マウスヘッドを、冷たい(4°C)解剖溶液を含むペトリ皿(直径10cm、深さ1.5cm)に入れる。
    2. 実体顕微鏡で見ながら、頭蓋骨の上の皮膚や毛髪を取り除き、冷たい解剖液で余分な血液を洗い流してください。標準的な解剖ハサミ(例えば、24mmの刃)の先端を使用して、後頭骨から始まり、頭蓋骨の鼻骨まで伸びる切開を行う。粗い先端の鉗子を使用して切開部に沿って頭蓋骨を慎重に開き、結合組織(髄膜)を分離して、無傷の円オブウィリスを含む脳を隔離します。
    3. ビーカーまたはペトリ皿に入れた冷たい解剖溶液で孤立した脳を洗浄し、脳の表面から残りの血液を除去する。実質細動脈を単離するための冷間解剖溶液を含むチャンバー内に脳腹側を上向きに配置する(図2A)。
  2. 実質細動脈の単離
    注:中大脳動脈(MCA)から生じ、脳実質に埋め込まれた細動脈が、このプロトコルのために選択される。細動脈は、先に記載した11のように単離され、改変を伴う。
    1. スチールピン(直径:0.2mm、長さ:11〜12mm)を使用して、木炭を注入したシリコンポリマーコーティング(深さ≥50cm)を含むペトリ皿の冷たい解剖溶液で単離された脳を固定する。
    2. 鋭く整列した解剖ハサミを使用して、組織セグメントの上部がウィリスの円からの分岐点を過ぎていることを確認しながら、MCAの周りの脳組織の長方形(長さ:5mm、幅:3mm)(図2B)を切断する。必要に応じて、脳の他の半球から脳組織の別の長方形を切断して、より多くの細動脈にアクセスします。
    3. 分離した脳組織セグメントを、MCAを上向き(ウィリスの円から遠位)にスチールピン(直径:0.1mm、長さ:13〜14mm)で皿に固定します。ピンの近くに浅い切開を慎重に行い、小さな鉗子でピアを取り除き、一方の端から他方の端に向かって静かに剥がします(図2C)。必要に応じて、他の組織セグメントからピアを取り外して、より多くの細動脈にアクセスします。MCAから分岐した実質細動脈を有する孤立したピアをピン付き皿に注意深く固定し、実質細動脈を解剖し(図2D)、細動脈が損傷していないことを確認する。
      注:細動脈が実質からピアで簡単に引き抜かれない場合は、細かい鉗子を使用して、ウィリスのサークルからのMCA分岐点から始めて脳を掘り下げてください。細動脈の位置を特定し、細動脈の周りの組織を慎重に緩め(図2E)、細動脈の上端を保持して実質から細動脈を静かに引き出します(図2F)。複数の細動脈(長さ:〜1.5〜2mm)を脳組織の1つの長方形から単離することができる。
    4. 細動脈が清潔で、組織が付着していないことを確認し、残りの遠位枝を切り取ります(図3A)。酵素消化のためにこの清潔で無傷の細動脈を使用してください。あるいは、必要に応じて内皮チューブを調製するための酵素消化のために、各細動脈を2個(長さ:0.75〜1mm)に切断する。

実質細動脈の消化と内皮チューブの調製

  1. 機器・ピペットの配置
    注:脳からの動脈内皮管の単離は、以前に記載されている13、18。現在のプロトコルは、実質(脳内)細動脈からの内皮の単離のための修正を組み込んでいる。複数の細動脈または細動脈の断片を酵素消化のために一緒に使用することができる。
    1. チャンバーとマイクロマニピュレータを支持するアルミニウムステージを用いて内皮チューブを調製するための摩砕装置13 を組み立てる。対物レンズ(5x-60x)を搭載した顕微鏡と、コンピュータモニタに接続されたカメラを組み立てます。ステージと試料の隣にポンプコントローラを備えたマイクロシリンジを固定します。
    2. 鉱物油を詰めた粉砕ピペットをマイクロシリンジピストンの上に固定します。ポンプコントローラ付きのマイクロシリンジを使用して、ピペット内の気泡を避けるように注意しながら、鉱物油の上にある摩砕ピペット(〜130nL)に解離溶液を引き出します。
  2. 動脈セグメントの部分消化
    1. 100 μg/mL のパパイン、170 μg/mL のジチオエリスリトール、250 μg/mL のコラゲナーゼ、および 40 μg/mL のエラスターゼを含む 10 mL のガラス管に、無傷の動脈セグメントを 1 mL の解離溶液に入れます。動脈セグメントを34°Cで10〜12分間インキュベートする。
    2. 消化後、酵素溶液を室温で3〜4mLの新鮮な解離溶液と交換する。
  3. 動脈内皮管の単離
    注:酵素溶液の消化および置換に続いて、1つまたは複数の部分的に消化されたセグメントを、モバイルプラットフォームに取り付けられたスーパーフュージョンチャンバ内の解離溶液に移す。100倍から200倍の倍率で見ながら、部分的に消化されたが壊れていない血管セグメントを1つ選択し、顕微鏡下でそれに焦点を合わせる。
    1. マイクロシリンジインジェクタに取り付けられた摩砕ピペットをチャンバ内の解離溶液中に置き、それを消化容器セグメントの一端の近くに配置する。ポンプコントローラで1〜3 nL/sの範囲内で速度を設定し、穏やかな摩砕を実現します。
    2. 100倍〜200倍の倍率を維持しながら、動脈セグメントをピペットに引き抜き、次いで排出して外膜細胞および平滑筋細胞を解離させる(図3B)。すべての平滑筋細胞が解離するまで血管セグメントを粉砕し、内皮細胞のみが無傷の「チューブ」として残る。
      注:粉砕中に必要に応じて、先端の細かい鉗子を慎重に使用して、解離した外膜および内部弾性薄板を内皮管から除去する。典型的には、粉砕のほんの数サイクルのみが無傷の内皮管を生じる。
    3. マイクロマニピュレーターを使用して、ホウケイ酸ガラスピニングピペットでチャンバー内のガラスカバースリップに内皮チューブの両端を固定します(図3C、D)。
  4. 動脈内皮管の固定
    1. 解離溶液をスーパーフュージョン溶液(2mM CaCl2を含むPSS)と交換しながら、非内皮物質がチャンバーから洗い流されるようにする。
    2. モバイルプラットフォームで固定された内皮チューブを、連続スーパーフュージョンおよび細胞内または蛍光記録/イメージング用に設計された顕微鏡リグに移します。
    3. 実験中に PSS の継続的配信を適用します。インライン流量制御バルブを使用して実験全体を通して流量(5-7 mL/分)を手動で設定し、層流と一致しながら、溶液流の供給を真空吸引の程度に一致させます。バックグラウンドデータおよび/または色素負荷を取得する前に、内皮チューブのスーパーフュージョンのためにチャンバにPSSを≥5分間流します。

5. 細胞生理学検査のための動脈内皮管の活用

注:単離および固定された動脈内皮管は、前述のように、それぞれ測光およびシャープな電極電気生理学を用いて[Ca2+]i ダイナミクスおよびVm の細胞内記録に使用することができる13 (図4)。[Ca2+]i およびVm は、必要に応じて別個のまたは組み合わせた実験変数として測定することができる13 (図4)。しかし、動脈内皮管は動脈内皮よりも繊細であり、実験時間は1時間を超えてはならない。

  1. [Ca2+]iの測定
    1. [Ca2+]i 録音用の機器とソフトウェアの電源を入れ、5~7mL/minの流量で連続スーパーフュージョンを維持します。
    2. 内皮チューブにCa2+ 色素Fura-2 AMを室温で30分間ロードする。浴温を徐々に37°Cまで上昇させながら、さらに20〜30分間、細胞をスーパーフュージョン溶液で洗浄する。 実験中、温度を37°Cに維持する。
    3. 測光ソフトウェアを使用してイメージングウィンドウを手動で調整し、約20個の内皮細胞に焦点を合わせます(図4A)。光がない場合は、蛍光界面のPMTを回し、510nmで蛍光発光を収集しながら、340nmと380nmで交互にFura-2を励起(≥10Hz)して[Ca2+]i の取得を開始します。[Ca2+]i の安定したベースライン記録が確立されたら、薬理学的薬剤(例えば、プリン作動性受容体アゴニスト)を実験目的ごとに適用する(図4B)。
  2. Vmの測定
    1. Vm 録音用の機器とソフトウェアの電源を入れ、5-7 mL/minの流量で連続スーパーフュージョンを維持しながら、データ収集速度(≥10 Hz)を設定します。浴温を徐々に37°Cまで上げ、実験が終わるまで維持する。
    2. ホウケイ酸ガラスキャピラリーを使用して鋭利な電極を引っ張り、2 M KClで埋め戻し、電気計に取り付けられたピペットホルダー内の塩化物でコーティングされた銀線の上に固定し、マイクロマニピュレータによって保持される。
    3. 4倍の対物レンズを通して見ながら、マイクロマニピュレータを使用して、動脈内皮チューブのセルのすぐ上の鋭い電極先端をチャンバ内の流れるPSSに慎重に配置します。
    4. 倍率を徐々に400倍に上げ、必要に応じて電極先端の位置を変えます。
    5. マイクロマニピュレータを使用して、鋭利な電極の先端を内皮管のセルの1つに静かに挿入し、電気計を使用してVm の記録を開始します(図4A)。
    6. 内皮安静時Vm が安定(−30〜−40mV)になったら、実験目的ごとに所望の薬理学的薬剤を適用する(図4C)。

6. 細胞イメージング

注:モバイルプラットフォームのチャンバー内に固定された内皮チューブは、標準的な蛍光または共焦点顕微鏡を用いて、ライブ条件および固定条件19 の両方における顕微鏡イメージングにも使用することができる。受容体およびイオンチャネルに対する異なる抗体を用いた免疫組織化学もまた、前述のように適用することができる20。

  1. 内皮チューブに原形質膜または所望の細胞小器官(例えば、核、小胞体)用の蛍光トラッカーを37°Cで15〜30分間ロードする。
  2. 新鮮なスーパーフュージョンPSSで細胞を洗浄し、それぞれの色素の励起波長で顕微鏡下で生細胞を画像化する(図4D、E)。
    注:免疫組織化学は、目的の抗体を使用してこのチューブモデルに対して行うことができる。

結果

プロトコルのデモンストレーションを図1に示し、動脈解剖および内皮管単離ステップをそれぞれ図2および図3として示す。ここで、内皮機能は、薬理学的物質[2−メチルチオアデノシン二リン酸(MTA)、強力なプリン作動性受容体(P2YR)アゴニスト]に応答して、Fura−2測光法およびシャープ電極電気生理学(...

ディスカッション

増え続ける証拠は、脳血管疾患(CVD)、老化、およびアルツハイマー病が強く相関しており、認知症研究の現在のトピックであることを示唆している4,8,14,21。したがって、脳血管網の研究は健康に広範な影響を与える一方で、疾患の状態の間、継続的な広範な調査を必要とすることは明らかである?...

開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

この研究は、米国国立衛生研究所(R00AG047198 & R56AG062169からEJBへの助成金)によって支援されています。R00HL140106からPWP)およびアルツハイマー病協会(AZRGD-21-805835からPWP)が挙げられる。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所またはアルツハイマー病協会の公式見解を表すものではありません。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifiersMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitorsAmpol US LLC, Sarasota, FL, USA BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)Warner InstrumentsG150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)Warner InstrumentsGC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
BSA: Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
CaCl2: Calcium ChlorideSigma223506
Collagenase (Type H Blend)SigmaC8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Data Acquision DigitizerMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USADigidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USADD-90-S-BLK
DithioerythritolSigmaD8255
DMSO: Dimethyl SulfoxideSigmaD8418
Elastase (porcine pancreas)SigmaE7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)ThermoFisher ScientificE34250
Fiber optic light sources Schott, Mainz, Germany & KL200, ZeissFostec 8375
Flow Control ValveWarner Instruments FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMTMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAIonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)FSTDumont #5 & Dumont #55
Function GeneratorEZ Digital, Seoul, South KoreaFG-8002
Fura-2 AM dyeInvitrogen, Carlsbad, CA, USAF14185
GlucoseSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)G7021
HCl: Hydrochloric AcidThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)A466250
HeadstagesMolecular DevicesHS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)SigmaH4034
Inline Solution HeaterWarner InstrumentsSH-27B
KCl: Potassium ChlorideSigmaP9541
MgCl2: Magnesium ChlorideSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, USA MF-900
MicromanipulatorSiskiyou MX10
Micropipette puller (digital)Sutter Instruments, Novato, CA, USAP-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USATs2
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments IncEclipse TS100
Microscope objectivesNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)Warner InstrumentsPM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)Siskiyou, Grants Pass, OR, USA8090P
Microsyringe Pump ControllerWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium saltTocris1624
NaCl: Sodium ChlorideSigmaS7653
NaOH: Sodium HydroxideSigmaS8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)ThermoFisher ScientificR37605
OscilloscopeTektronix, Beaverton, Oregon, USA TDS 2024B
PapainSigmaP4762
Phase contrast objectivesNikon Instruments Inc (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)ThermoFisher ScientificC10046
Plexiglas superfusion chamberWarner Instruments, Camden, CT, USARC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USAMoria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)World Precision Instruments555640S, 14364
StereomicroscopesZeiss, NY, USAStemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)ThermoFisher Scientific722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)Warner InstrumentsTC-344B or C
Valve Control SystemWarner InstrumentsVC-6
Vibration Isolation TableTechnical Manufacturing, Peabody, MA, USA Micro-g

参考文献

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

181 Ca2 K

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved