JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Проиллюстрирована интенсивная подготовка интактных эндотелиальных «трубок» головного мозга мыши из церебральных паренхиматозных артериол для изучения регуляции мозгового кровотока. Кроме того, мы демонстрируем экспериментальные сильные стороны этой модели эндотелиального исследования для флуоресцентной визуализации и электрофизиологического измерения ключевых клеточных сигнальных путей, включая изменения внутриклеточного [Ca2+] и мембранного потенциала.

Аннотация

Мозговой кровоток передается сосудистыми артериями сопротивления и ниже по течению паренхиматозными артериолами. Устойчивое сосудистое сопротивление кровотоку увеличивается с уменьшением диаметра от артерий до артериол, которые в конечном итоге питаются капиллярами. Из-за их меньшего размера и расположения в паренхиме артериолы были относительно недостаточно изучены и с меньшей воспроизводимостью в результатах, чем поверхностные пиальные артерии. Несмотря на это, структура и функция артериолярных эндотелиальных клеток, неотъемлемая часть физиологии и этиологии хронических дегенеративных заболеваний, требует обширного исследования. В частности, новые данные демонстрируют, что нарушенная функция эндотелия предшествует и усугубляет когнитивные нарушения и деменцию.

В паренхиматозной микроциркуляции функция эндотелиального канала K+ является наиболее надежным стимулом для тонкого контроля распространения вазодилатации, чтобы способствовать увеличению притока крови к областям нейрональной активности. Эта статья иллюстрирует усовершенствованный метод свежеизолирования интактных и электрически связанных эндотелиальных «трубок» (диаметр, ~25 мкм) из паренхиматозных артериол мозга мыши. Артериолярные эндотелиальные трубки обеспечиваются в физиологических условиях (37 °C, рН 7,4) для разрешения экспериментальных переменных, которые охватывают функцию канала K+ и их регуляцию, включая внутриклеточную динамику Ca2+ , изменения мембранного потенциала и мембранную липидную регуляцию. Явным техническим преимуществом по сравнению с артериальным эндотелием является улучшенное морфологическое разрешение размеров клеток и органелл (например, митохондрий), что расширяет полезность этого метода. Здоровая церебральная перфузия на протяжении всей жизни влечет за собой надежную функцию эндотелия в паренхиматозных артериолах, напрямую связывая кровоток с подпиткой нейронной и глиальной активности в точных анатомических областях мозга. Таким образом, ожидается, что этот метод значительно расширит общие знания сосудистой физиологии и неврологии относительно здорового и больного мозга.

Введение

Паренхиматозные артериолы непосредственно доставляют необходимый кислород и питательные вещества по всему мозгу1. Взаимодействуя с капиллярами, высоковазоактивные артериолы реагируют на ретроградную передачу сигналов, инициированную капиллярными ионными каналами, которые воспринимают метаболические сигналы от определенных нейронныхобластей 2. Поскольку паренхима головного мозга исторически получила основную часть исследований, в настоящее время появилась роль эндотелиальной дисфункции для прояснения патологических механизмов, связанных с различными цереброваскулярными нарушениями, лежащими в основе деменции (например, ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера)3,4,5,6 . Эндотелий является неотъемлемой частью перфузии мозга в соответствии с неоднородностью генетики, структуры и функции во всех сосудистых сегментах7. Пиальные артерии были широко изучены из-за их относительно большого размера, высокого сегментарного сосудистого сопротивления и роли в распределении кровотока к подлежащему церебру 8,9. Таким образом, лучшее понимание артериолярных эндотелиальных механизмов, вероятно, улучшит понимание регуляции мозгового кровотока в здоровье и болезнях в направлении разработки новых терапевтических схем.

Новые данные подчеркивают важность изучения паренхиматозных артериол в отношении различных сигнальных путей и заболеваний 8,10. Однако этот подход был ограничен использованием интактных артериол под давлением11 и/или препаратов12 капиллярно-паренхиматозной артериолы (CaPA). Свежеизолированные, нативные артериолярные эндотелиальные клетки головного мозга, лишенные других типов клеток и смешивающих факторов, не были исследованы, вероятно, из-за технических трудностей в их изоляции. В этой статье продвигается предыдущая методика, подчеркивающая выделение эндотелия пиальной артерии13, чтобы теперь надежно и воспроизводимо изолировать эндотелий паренхиматозных артериол головного мозга (ширина: ~ 25 мкм, длина: ~ 250 мкм). Этот метод помогает достичь оптимального разрешения электрически и химически связанных клеток в их индивидуальной ориентации и сотовых сетях.

Ключевые пути, представляющие интерес, включали взаимодействие внутриклеточной передачи сигналов Ca2+ ([Ca2+]i) и гиперполяризацию мембранного потенциала (Vm)14,15 — неотъемлемого элемента вазодилатации16 — чтобы позволить крови проникать в капилляры и доставлять кислород и питательные вещества в активную паренхиму17. Эти препараты позволяют проводить электрофизиологические записи ионных каналов в режиме реального времени, включая Ca2+-пермеантные, переходные рецепторные потенциалы (TRP) и K+ каналы и / или флуоресцентную визуализацию внутриклеточных органелл в эндотелиальных клеточных трубках в почти физиологических условиях. Это подходящий метод для исследователей, заинтересованных в физиологических клеточных механизмах, которые управляют эндотелиальным клеточным контролем мозгового кровотока до паренхимы мозга. В целом, этот метод поможет исследователям лучше понять фундаментальные эндотелиальные сигнальные пути и сетевую связь артериол, встроенных в паренхиму головного мозга, при решении вопросов, связанных с цереброваскулярной физиологией и патологией.

протокол

Экспериментаторы должны обеспечить, чтобы назначенное использование животных и связанные с ними протоколы были одобрены их Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) и выполнялись в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального исследовательского совета (8-е издание, 2011 год) и руководящими принципами ARRIVE. IACUC Университета Лома Линда и Университета Аризоны одобрили все протоколы, используемые для этой рукописи для мышей C57BL/6N и 3xTg-AD (самцы и самки; возрастной диапазон: 2-30 месяцев). См. Рисунок 1 в качестве обзора выделения и исследования артериолярных эндотелиальных трубок, недавно выделенных из паренхиматозных артериол головного мозга мышей.

1. Материалы и оборудование

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для всех реагентов и материалов, необходимых для этого протокола. Кроме того, по мере необходимости можно обращаться к руководствам и веб-сайтам, связанным с соответствующими поставщиками. Иллюстрации станций вскрытия и экспериментальных аппаратов были ранее предоставлены13.

  1. Проточная камера
    1. Прикрепите камеру суперфузии со стеклянной крышкой к платформе, состоящей из анодированного алюминия. Закрепите платформу камерой на алюминиевой ступени микроскопа.
    2. Установите микроманипулятор, держащий закрепляющую пипетку на каждом конце платформы на сцене алюминиевого микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте переносной ступенчатый аппарат с блоком проточной камеры для перемещения защищенной, изолированной эндотелиальной трубки из одного микроскопического аппарата в другой для экспериментов.
  2. Микроскопы
    1. Используйте стереомикроскопы (диапазон увеличения от 5x до 50x) и волоконно-оптические источники света для процедур рассечения.
    2. Для изоляции эндотелиальных трубок используйте инвертированный микроскоп, оснащенный фазовым контрастом или дифференциальным интерференционным контрастом (DIC)-совместимыми объективами (10x, 20x и 40x) и алюминиевой ступенью.
    3. Имейте контроллер насоса микрошрица рядом с аппаратом, предназначенным для изоляции эндотелиальных трубок от частично переваренных кровеносных сосудов.
    4. Настройте экспериментальный аппарат, расположив на столе виброизоляции перевернутый микроскоп (объективы: 4x, 10x, 20x, 40x и 60x) и ручную алюминиевую ступень.
  3. ВнутриклеточноеV-м записывающее оборудование
    1. Подключите электрометр к совместимой головной станции. Используйте аксессуары, такие как генератор функций и стимулятор, для протоколов, требующих впрыска тока.
    2. Подключите выходы усилителя к системе дигитайзера данных, осциллографу и звуковым базовым мониторам. Закрепите электрод опорной ванны (гранула Ag/AgCl) рядом с выходом из проточной камеры.
    3. Соберите фотометрическую систему со встроенными компонентами интерфейса флуоресцентной системы, дуговой лампой высокой интенсивности и источником питания, гиперпереключателем, фотоумножительной трубкой (или PMT) и камерой для измерения [Ca2+]i в эндотелиальных ячейках.
    4. Соберите регулятор температуры, оснащенный встроенным нагревателем для повышения и поддержания физиологической температуры (37 °C) на протяжении всего эксперимента.
    5. Смонтируйте многоканальную платформу, соединенную с контроллером клапана с поточным клапаном регулирования потока, для управления доставкой решений в эндотелиальные трубки, закрепленные в камере.
  4. Микропипетты и острые электроды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментатору понадобится электронный съемник стекла и микрокварка для приготовления тритурации и закрепления пипеток.
    1. Чтобы отделить эндотелиальную трубку от частично переваренного артериолярного сегмента, готовят термополированные тритурационные пипетки (диаметр внутреннего наконечника: 30-50 мкм) из боросиликатных стеклянных капилляров.
    2. Для закрепления эндотелиальной трубки в камере суперфузии готовят термополированные пипетки с затупленным сферическим концом (наружный диаметр: 50-70 мкм), приготовленные из тонкостенных боросиликатных стеклянных капилляров.
    3. Чтобы записать Vm эндотелиальной ячейки, подготовьте острые электроды с сопротивлением наконечника ~150 ± 30 МОм из стеклянных капилляров, используя только стеклянный съемник.

2. Растворы и препараты

  1. Физиологический раствор соли (PSS)
    1. Приготовьте минимум 1 л PSS, используя 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этанесульфоновую кислоту (HEPES) и 10 мМ глюкозы.
    2. Готовят необходимые растворы без CaCl2 (ноль Ca2+ PSS) для рассечения артериол головного мозга и выделения эндотелиальной трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят все растворы в сверхчистом деионизированномH2Oс последующей фильтрацией (0,22 мкм). Убедитесь, что конечный продукт содержит рН 7,4 с осмоляльностью от 290 до 300 мОсм.
  2. Сывороточный альбумин крупного рогатого скота (BSA, 10%)
    1. Растворить 1 г лиофилизированного порошка BSA в стакане объемом 10 мл с нулевым Ca2+ PSS. Накройте стакан крышкой и подождите не менее 2 ч при медленном перемешивании, чтобы BSA растворился.
    2. Фильтруйте раствор с помощью шприца 10 мл плюс фильтр 0,22 мкм и подготовьте 1 мл аликвоты для хранения при -20 °C.
  3. Раствор для рассечения
    1. Добавьте 500 мкл BSA (10%) до 49,5 мл нуля Ca2+ PSS для общего объема 50 мл.
    2. Переложите раствор на чашку Петри для артериолярных рассечений.
  4. Решение для диссоциации
    1. Добавьте 5 мкл раствораCaCl2 (1 M) и 500 мкл BSA (10%) до 49,5 мл нуля Ca2+ PSS для общего объема 50 мл. Инкубировать раствор при комнатной температуре не менее 1 ч.
  5. Ферментов
    1. Приготовьте 1 мл раствора для пищеварения со 100 мкг/мл папаина, 170 мкг/мл дитиоэритритола, 250 мкг/мл коллагеназы (смесь типа H) и 40 мкг/мл эластазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Активность ферментов может варьироваться, хотя успешные протоколы, вероятно, потребуют следующей ферментативной активности: ≥ 10 единиц / мг для папаина, ≥ 1 единица / мг для коллагеназы и ≥ 5 единиц / мг для эластазы.
  6. Фура-2 и фармакологические средства
    1. Готовят Фуру-2 АМ в виде диметилсульфоксида (ДМСО; 1 мМ). Подготовьте 500 мкл рабочей концентрации (10 мкМ), добавив 5 мкл запаса к 495 мкл PSS для загрузки.
    2. Приготовьте не менее 50 мл рабочих концентраций фармакологических агентов в PSS или DMSO в зависимости от обстоятельств.
  7. Проводящее решение
    1. Получают 2 M KCl путем растворения KCl в деионизированномH2O(7,455 г KCl в 50 млH2O). Пропустите раствор через шприц с фильтром 0,22 мкм перед засыпкой острых электродов.
  8. Флуоресцентные органеллы и антитела
    1. Готовят плазматическую мембрану или органелларные (например, ядро, эндоплазматический ретикулум) трекеры в соответствующем физиологическом солевом растворе в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Готовят первичные и вторичные антитела согласно инструкции производителя в соответствующем физиологическом растворе соли.

3. Рассечение и выделение артериол головного мозга мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Стереомикроскопы и заточенные инструменты микродиссекции (например, щипцы с тонкими наконечниками, ножницы для рассечения в стиле Ваннас) должны использоваться для увеличения образца (до 50 раз) во всех этих процедурах рассечения.

  1. Изоляция мозга мыши
    1. Обезболить стандартную лабораторную мышь (например, C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 месяцев, самец или самка) с помощью ингаляции изофлурана (3% в течение 2-3 мин), с последующим немедленным обезглавливанием с использованием острых ножниц или гильотины по одобрению IACUC. Поместите голову мыши в чашку Петри (диаметр 10 см, глубина 1,5 см), содержащую холодный (4 °C) раствор для рассечения.
    2. Во время просмотра под стереомикроскопом удалите кожу и волосы над черепом и смойте излишки крови холодным рассеченным раствором. Используя кончики стандартных ножниц для рассечения (например, лезвия 24 мм), сделайте разрез, начиная с затылочной кости и простираясь вверх через носовую кость черепа. Используйте грубые щипцы, чтобы осторожно открыть череп вдоль разреза, и отделить соединительную ткань (менингеальную мембрану), чтобы изолировать мозг, содержащий неповрежденный круг Виллиса.
    3. Промыть изолированный мозг холодным раствором для рассечения в стакане или чашке Петри, чтобы удалить оставшуюся кровь с поверхности мозга. Поместите вентральную сторону мозга лицом вверх в камеру, содержащую холодный расслоительный раствор для выделения паренхиматозных артериол (рисунок 2А).
  2. Выделение паренхиматозных артериол
    ПРИМЕЧАНИЕ: Артериолы, возникающие из средних мозговых артерий (MCAs) и встроенные в паренхиму головного мозга, выбраны для этого протокола. Артериолы выделяют, какописано ранее 11, с модификацией.
    1. Используйте стальные штифты (диаметр: 0,2 мм, длина: от 11 до 12 мм) для закрепления изолированного мозга в холодном растворе для рассечения в чашке Петри, содержащей кремниевое полимерное покрытие, наполненное древесным углем (глубина ≥ 50 см).
    2. Используя острые и выровненные ножницы для рассечения, вырежьте прямоугольник мозговой ткани (длина: 5 мм, ширина: 3 мм) (рисунок 2B) вокруг MCA, убедившись, что верхняя часть сегмента ткани находится за пределами точки ветвления от Круга Уиллиса. Отрежьте еще один прямоугольник мозговой ткани из другого полушария мозга, чтобы получить доступ к большему количеству артериол, если это необходимо.
    3. Закрепите отделенный сегмент мозговой ткани в чашке с помощью MCA, обращенного вверх (дистально от Круга Уиллиса) с помощью стальных штифтов (диаметр: 0,1 мм, длина: от 13 до 14 мм). Осторожно сделайте неглубокий разрез возле штифтов, чтобы удалить пиа небольшими щипцами, аккуратно отслаиваясь от одного конца к другому (рисунок 2С). Удалите пиа из другого сегмента ткани, чтобы получить доступ к большему количеству артериол, если это необходимо. Тщательно закрепите изолированную пиа паренхиматозными артериолами, разветвленными от MCA, в блюде с помощью булавок и рассекните паренхиматозные артериолы (рисунок 2D), гарантируя, что артериолы не повреждены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если артериолы нелегко вытащить пиа из паренхимы, используйте тонкие щипцы и копайтесь в мозге, начиная с точки ветви MCA от Круга Виллиса. Найдите артериолу, осторожно разрыхлите ткань вокруг артериол (рисунок 2E) и осторожно вытащите артериолу из паренхимы, удерживая верхний конец артериолы (рисунок 2F). Множественные артериолы (длина: ~1,5-2 мм) могут быть выделены из одного прямоугольника мозговой ткани.
    4. Убедитесь, что артериола чистая без прикрепленной к ней ткани, и отрежьте все оставшиеся дистальные ветви (рисунок 3A). Используйте этот чистый, неповрежденный артериол для ферментативного пищеварения. Альтернативно, нарежьте каждую артериолу на две части (длина: 0,75-1 мм) для ферментативного пищеварения для приготовления эндотелиальных трубок, если это необходимо.

4. Переваривание паренхиматозных артериол и подготовка эндотелиальных трубок

  1. Компоновка оборудования и пипеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение артериальных эндотелиальных трубок из головного мозга было описано ранее13,18. Текущий протокол включает модификации для выделения эндотелия из паренхиматозных (внутримозговых) артериол. Несколько артериол и/или кусочков артериол могут быть использованы вместе для ферментативного пищеварения.
    1. Смонтируйте устройство13 тритурации для подготовки эндотелиальных трубок с использованием алюминиевой ступени, поддерживающей камеру и микроманипуляторы. Соберите микроскоп, оснащенный объективами (5x-60x) и камерой, подключенной к монитору компьютера. Закрепите микрошприц с помощью контроллера насоса рядом со сценой и образцом.
    2. Закрепите тритурационную пипетку, заполненную минеральным маслом, поверх поршня микрошприца. Используйте микрошприц с контроллером насоса, чтобы вывести диссоциационный раствор в тритурационную пипетку (~ 130 нЛ) поверх минерального масла, следя за тем, чтобы избежать пузырьков воздуха в пипетке.
  2. Частичное переваривание артериолярных сегментов
    1. Поместите неповрежденные артериолярные сегменты в 1 мл диссоциационного раствора в стеклянной трубке объемом 10 мл, содержащей папаин 100 мкг/мл, 170 мкг/мл дитиоэритритрита, коллагеназу 250 мкг/мл и эластазу 40 мкг/мл. Инкубировать артериолярные сегменты при 34 °C в течение 10-12 мин.
    2. После переваривания заменить раствор фермента 3-4 мл свежего диссоциационного раствора при комнатной температуре.
  3. Выделение артериолярной эндотелиальной трубки
    ПРИМЕЧАНИЕ: После переваривания и замены раствора фермента переносят один или несколько частично переваренных сегментов в диссоциационный раствор в суперфузионной камере, прикрепленной к подвижной платформе. При просмотре с увеличением от 100x до 200x выберите один частично переваренный, но неразрывный сегмент сосуда и сосредоточьтесь на нем под микроскопом.
    1. Поместите тритурационную пипетку, прикрепленную к инжектору микрошрица, в диссоциационный раствор в камере и расположите ее близко к одному концу сегмента переваренного сосуда. Установите скорость в пределах 1-3 нл/с на контроллере насоса для мягкой тритурации.
    2. Сохраняя увеличение от 100x до 200x, выведите артериолярный сегмент в пипетку, а затем выбросьте для диссоциации адвентиции и гладкомышечных клеток (рисунок 3B). Тритурируйте сегмент сосуда до тех пор, пока все гладкомышечные клетки не будут диссоциированы, и только эндотелиальные клетки останутся в виде неповрежденной «трубки».
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости во время тритурации осторожно используйте мелкоконечные щипцы для удаления диссоциированных адвентиций и внутренней эластичной пластинки из эндотелиальной трубки. Как правило, только несколько циклов тритурации дают неповрежденную эндотелиальную трубку.
    3. Используйте микроманипуляторы для закрепления каждого конца эндотелиальной трубки на стеклянной крышке в камере с помощью боросиликатных стеклянных пипеток (рисунок 3C,D).
  4. Закрепление артериолярной эндотелиальной трубки
    1. Замените диссоциационный раствор суперфузионным раствором (PSS, содержащим 2 мМ CaCl2), обеспечивая при этом, чтобы неэндотелиальный материал вымывался из камеры.
    2. Перенос защищенной эндотелиальной трубки в мобильной платформе на микроскопическую установку, предназначенную для непрерывного суперсмешения и внутриклеточных или флуоресцентных записей/визуализаций.
    3. Применяют непрерывную доставку ПСС во время эксперимента. Вручную устанавливайте скорость потока (5-7 мл/мин) на протяжении всего эксперимента с помощью поточного клапана регулирования потока, соответствующего ламинарному потоку, при этом сопоставляя подачу потока раствора с объемом вакуумного всасывания. Дайте ≥5 мин потока PSS в камеру для суперфузии эндотелиальной трубки перед получением фоновых данных и/или загрузкой красителя.

5. Использование артериолярных эндотелиальных трубок для исследования клеточной физиологии

ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные и защищенные артериолярные эндотелиальные трубки могут быть использованы для внутриклеточной записи динамики [Ca2+]i и Vm с использованием фотометрии и электрофизиологии острых электродов, соответственно, как показано ранее13 (фиг.4). [Около2+] i и Vm могут быть измерены как отдельные или комбинированные экспериментальные переменные по мере необходимости13 (рисунок 4). Однако артериолярные эндотелиальные трубки более деликатны, чем артериальный эндотелий, и время экспериментирования не должно превышать 1 ч.

  1. Измерение [Ca2+]i
    1. Включите оборудование и программное обеспечение для записи [Ca2+]i , сохраняя непрерывную суперфрезью при скорости потока 5-7 мл/мин.
    2. Загрузите эндотелиальную трубку красителем Ca2+ Fura-2 AM в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть клетки суперфузионным раствором еще 20-30 мин, постепенно повышая температуру ванны до 37 °C. Поддерживайте температуру на уровне 37 °C на протяжении всего эксперимента.
    3. Вручную отрегулируйте окно визуализации с помощью программного обеспечения фотометрии, чтобы сфокусироваться на ~ 20 эндотелиальных клетках (рисунок 4A). При отсутствии света включите PMT на флуоресцентном интерфейсе и начните получение [Ca2+]i , возбуждая Fura-2 попеременно (≥10 Гц) при 340 нм и 380 нм при сборе флуоресцентного излучения при 510 нм. Как только установлена стабильная базовая запись [Ca2+]i , применяют фармакологические агенты (например, агонисты пуринергических рецепторов) на экспериментальную цель (рисунок 4B).
  2. Измерение Вм
    1. Включите оборудование и программное обеспечение для записи Vm и установите скорость сбора данных (≥10 Гц) при сохранении непрерывного переливания при расходе 5-7 мл/мин. Постепенно поднимайте температуру ванны до 37 °C и поддерживайте ее до конца эксперимента.
    2. Потяните острый электрод с помощью боросиликатного стеклянного капилляра, засыпьте его 2 M KCl и закрепите его на серебряной проволоке, покрытой хлоридом, в держателе пипетки, прикрепленном к электрометру, который, в свою очередь, удерживается микроманипулятором.
    3. При просмотре через объектив 4x используйте микроманипулятор, чтобы аккуратно расположить острый кончик электрода прямо над ячейкой артериолярной эндотелиальной трубки в протекающем PSS в камере.
    4. Постепенно увеличивайте увеличение до 400x и перепозиционируйте наконечник электрода по мере необходимости.
    5. С помощью микроманипулятора аккуратно вставьте кончик острого электрода в одну из ячеек эндотелиальной трубки и начните запись Vm с помощью электрометра (рисунок 4А).
    6. Как только эндотелиальный остаток Vm стабилен (от −30 до −40 мВ), применяют желаемые фармакологические средства на экспериментальный объект (рисунок 4С).

6. Клеточная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Эндотелиальные трубки, закрепленные в камере мобильной платформы, также могут быть использованы для микроскопической визуализации как в живых, так и в фиксированных условиях19 с использованием стандартной флуоресценции или конфокальной микроскопии. Иммуногистохимия с различными антителами к рецепторам и ионным каналам также может быть применена, какописано ранее 20.

  1. Нагрузите эндотелиальную трубку флуоресцентным трекером плазматической мембраны или желаемой органеллы (например, ядра, эндоплазматического ретикулума) при 37 °C в течение 15-30 мин.
  2. Промыть клетки свежей суперфузией PSS и изобразить живые клетки под микроскопом на длине волны возбуждения соответствующих красителей (рисунок 4D,E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуногистохимия может быть выполнена на этой модели трубки с использованием интересующих антител.

Результаты

Демонстрация протокола показана на фиг.1 с этапами рассечения артериолярных артерий и изоляции эндотелиальной трубки, как показано на фиг.2 и фиг.3 соответственно. Здесь эндотелиальную функцию оценивали путем измерения [Ca2+]i и ...

Обсуждение

Растущие данные свидетельствуют о том, что цереброваскулярные заболевания (ССЗ), старение и болезнь Альцгеймера сильно коррелируют и являются актуальной темой исследований деменции 4,8,14,21. Таким образом, очевидно, ч?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (R00AG047198 & R56AG062169 для EJB; R00HL140106 к PWP) и Ассоциации Альцгеймера (AZRGD-21-805835 к PWP). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Ассоциации Альцгеймера.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifiersMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitorsAmpol US LLC, Sarasota, FL, USA BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)Warner InstrumentsG150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)Warner InstrumentsGC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
BSA: Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
CaCl2: Calcium ChlorideSigma223506
Collagenase (Type H Blend)SigmaC8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Data Acquision DigitizerMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USADigidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USADD-90-S-BLK
DithioerythritolSigmaD8255
DMSO: Dimethyl SulfoxideSigmaD8418
Elastase (porcine pancreas)SigmaE7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)ThermoFisher ScientificE34250
Fiber optic light sources Schott, Mainz, Germany & KL200, ZeissFostec 8375
Flow Control ValveWarner Instruments FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMTMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAIonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)FSTDumont #5 & Dumont #55
Function GeneratorEZ Digital, Seoul, South KoreaFG-8002
Fura-2 AM dyeInvitrogen, Carlsbad, CA, USAF14185
GlucoseSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)G7021
HCl: Hydrochloric AcidThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)A466250
HeadstagesMolecular DevicesHS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)SigmaH4034
Inline Solution HeaterWarner InstrumentsSH-27B
KCl: Potassium ChlorideSigmaP9541
MgCl2: Magnesium ChlorideSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, USA MF-900
MicromanipulatorSiskiyou MX10
Micropipette puller (digital)Sutter Instruments, Novato, CA, USAP-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USATs2
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments IncEclipse TS100
Microscope objectivesNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)Warner InstrumentsPM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)Siskiyou, Grants Pass, OR, USA8090P
Microsyringe Pump ControllerWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium saltTocris1624
NaCl: Sodium ChlorideSigmaS7653
NaOH: Sodium HydroxideSigmaS8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)ThermoFisher ScientificR37605
OscilloscopeTektronix, Beaverton, Oregon, USA TDS 2024B
PapainSigmaP4762
Phase contrast objectivesNikon Instruments Inc (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)ThermoFisher ScientificC10046
Plexiglas superfusion chamberWarner Instruments, Camden, CT, USARC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USAMoria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)World Precision Instruments555640S, 14364
StereomicroscopesZeiss, NY, USAStemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)ThermoFisher Scientific722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)Warner InstrumentsTC-344B or C
Valve Control SystemWarner InstrumentsVC-6
Vibration Isolation TableTechnical Manufacturing, Peabody, MA, USA Micro-g

Ссылки

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181Ca2K

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены