JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Özet

Serebral kan akımı vasküler direnç arterleri ve aşağı akış parankimal arteriolleri ile iletilir. Kan akışına karşı kararlı durum vasküler direnci, arterlerden sonuçta kılcal damarlara beslenen arteriollere kadar azalan çapla artar. Parankimdeki daha küçük boyutları ve konumları nedeniyle, arterioller nispeten az çalışılmış ve bulgularda yüzey pial arterlerine göre daha az tekrarlanabilirliğe sahiptir. Ne olursa olsun, arteriyolar endotel hücre yapısı ve fonksiyonu - kronik dejeneratif hastalıkların fizyolojisi ve etiyolojisinin ayrılmaz bir parçası - kapsamlı bir araştırma gerektirir. Özellikle, ortaya çıkan kanıtlar, tehlikeye giren endotel fonksiyonunun bilişsel bozukluk ve demanstan önce geldiğini ve şiddetlendirdiğini göstermektedir.

Parankimal mikrosirkülasyonda, endotel K + kanal fonksiyonu, nöronal aktivite alanlarına kan akışındaki artışları teşvik etmek için vazodilatasyonun yayılmasını hassas bir şekilde kontrol etmek için en sağlam uyarandır. Bu yazıda, sağlam ve elektriksel olarak eşleşmiş endotel "tüplerinin" (çap, ~ 25 μm) fare beyni parankimal arteriollerinden taze izole edilmesi için rafine bir yöntem gösterilmektedir. Arteriyolar endotel tüpleri, hücre içi Ca2+ dinamikleri, membran potansiyelindeki değişiklikler ve membran lipid regülasyonu dahil olmak üzere K + kanal fonksiyonunu ve regülasyonunu kapsayan deneysel değişkenleri çözmek için fizyolojik koşullar (37 ° C, pH 7.4) sırasında sabitlenir. Arteriyel endotele karşı belirgin bir teknik avantaj, hücre ve organel (örneğin, mitokondri) boyutlarının artmış morfolojik çözünürlüğüdür ve bu da bu tekniğin kullanışlılığını arttırır. Yaşam boyunca sağlıklı serebral perfüzyon, parankimal arteriollerde sağlam endotel fonksiyonu gerektirir ve kan akışını beynin kesin anatomik bölgeleri boyunca nöronal ve glial aktivitenin körüklenmesine doğrudan bağlar. Bu nedenle, bu yöntemin sağlıklı ve hastalıklı beyin ile ilgili vasküler fizyoloji ve sinirbilim hakkındaki genel bilgileri önemli ölçüde ilerletmesi beklenmektedir.

Giriş

Parankimal arterioller doğrudan beyin boyunca gerekli oksijen ve besinleri sağlar1. Kılcal damarlarla arayüz oluştururken, yüksek vazoaktif arterioller, spesifik nöronal bölgelerden metabolik sinyalleri algılayan kılcal iyon kanalları tarafından başlatılan retrograd sinyalizasyona yanıt verir2. Beyin parankimi tarihsel olarak araştırmanın büyük kısmını almış olmakla birlikte, endotel disfonksiyonunun rolü, demansın altında yatan çeşitli serebrovasküler bozukluklarla ilişkili patolojik mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için ortaya çıkmıştır (örneğin, iskemik inme, Alzheimer hastalığı)3,4,5,6 . Endotel, vasküler segmentler boyunca genetiğin, yapının ve fonksiyonun heterojenliği ile uyumlu olarak beynin perfüzyonunun ayrılmaz bir parçasıdır7. Pial arterler nispeten büyük boyutları, yüksek segmental vasküler dirençleri ve altta yatan serebrum 8,9'a kan akımı dağılımındaki rolleri nedeniyle kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu nedenle, arteriyolar endotel mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, yeni terapötik rejimlerin geliştirilmesine yönelik sağlık ve hastalıkta beyin kan akımı düzenlemesinin anlaşılmasını artıracaktır.

Ortaya çıkan kanıtlar, farklı sinyal yolları ve hastalıklarla ilgili olarak parankimal arteriollerin incelenmesinin önemini vurgulamaktadır 8,10. Bununla birlikte, bu yaklaşım sağlam basınçlı arteriol11 ve/veya kılcal-parankimal arteriol (CaPA) preparatları12 kullanımı ile sınırlıdır. Yeni izole edilmiş, diğer hücre tiplerinden yoksun doğal serebral arteriyolar endotel hücreleri ve kafa karıştırıcı faktörler, muhtemelen izolasyonlarındaki teknik zorluklar nedeniyle incelenmemiştir. Bu yazıda, pial arteriyel endotel13'ün izolasyonunu vurgulayan önceki bir teknik, beyin parankimal arteriollerinin endotelini güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde izole etmek için ilerletmektedir (genişlik: ~25 μm, uzunluk: ~250 μm). Bu teknik, elektriksel ve kimyasal olarak bağlanmış hücrelerin bireysel yönelimlerinde ve hücresel ağlarında optimum çözünürlük elde etmelerine yardımcı olur.

İlgilenilen anahtar yollar, hücre içi Ca 2 + ([Ca2 +]i) sinyallemesinin etkileşimini ve membran potansiyelinin hiperpolarizasyonunun (Vm) 14,15 - vazodilatasyonun ayrılmazbir parçası 16 - kanın kılcal damarlara girmesine ve aktif parankim 17'ye oksijen ve besin vermesine izin vermeyi içermektedir. Bu preparatlar, Ca2 + geçirgen, geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve K + kanalları dahil olmak üzere iyon kanallarının gerçek zamanlı elektrofizyolojik kayıtlarına ve / veya endotel hücre tüpleri içindeki hücre içi organellerin floresan görüntülemesine yakın fizyolojik koşullarda izin verir. Bu, beyin parankimine serebral kan akımı iletiminin endotel hücre kontrolünü yöneten fizyolojik hücresel mekanizmalarla ilgilenen araştırmacılar için uygun bir tekniktir. Toplamda, bu teknik, araştırmacıların beyin parankimine gömülü arteriollerin temel endotel sinyal yollarını ve ağ iletişimini daha iyi anlamalarına yardımcı olurken, serebrovasküler fizyoloji ve patoloji ile ilgili soruları ele alacaktır.

Protokol

Deneyciler, belirlenmiş hayvan kullanımının ve ilgili protokollerin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmasını ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" (8. Baskı, 2011) ve ARRIVE kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmesini sağlamalıdır. Loma Linda Üniversitesi IACUC ve Arizona Üniversitesi, C57BL/6N ve 3xTg-AD fareleri (erkekler ve kadınlar; yaş aralığı: 2-30 ay) için bu makale için kullanılan tüm protokolleri onaylamıştır. Beynin fare parankimal arteriollerinden yeni izole edilen arteriyolar endotel tüplerinin izolasyonuna ve muayenesine genel bir bakış olarak Şekil 1'e bakınız.

1. Malzemeler ve ekipmanlar

NOT: Bu protokol için gerekli olan tüm reaktifler ve malzemeler için Malzeme Tablosuna bakınız. Ek olarak, gerektiğinde ilgili satıcılarla ilişkili kılavuzlara ve web sitelerine de danışılabilir. Diseksiyon istasyonlarının ve deney cihazlarının illüstrasyonları daha önce sağlanmıştı13.

  1. Akış odası
    1. Bir süperfüzyon odasını cam kapaklı bir şekilde eloksallı alüminyumdan oluşan bir platforma sabitleyin. Platformu odacıkla alüminyum mikroskop aşamasına sabitleyin.
    2. Alüminyum mikroskop aşamasında platformun her iki ucunda bir iğneleme pipeti tutan bir mikromanipülatör ayarlayın.
      NOT: Gerekirse, güvenli, izole edilmiş bir endotel tüpünü deney için bir mikroskop cihazından diğerine taşımak için akış odası ünitesine sahip aktarılabilir bir sahne aparatı kullanın.
  2. Mikroskoplar
    1. Diseksiyon prosedürleri için stereomikroskoplar (5x ila 50x büyütme aralığı) ve fiber optik ışık kaynakları kullanın.
    2. Endotel tüplerinin izolasyonu için, faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrastı (DIC) uyumlu hedefler (10x, 20x ve 40x) ve bir alüminyum aşama ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop teçhizatı kullanın.
    3. Endotel tüplerini kısmen sindirilmiş kan damarlarından izole etmeye adanmış aparatın yanında bir mikroşırınga pompası kontrol cihazı hazırlayın.
    4. Ters çevrilmiş bir mikroskop (hedefler: 4x, 10x, 20x, 40x ve 60x) ve bir titreşim yalıtım tablosu üzerinde manuel bir alüminyum sahne düzenleyerek deneysel cihazı kurun.
  3. Hücre içi Vm kayıt cihazları
    1. Elektrometreyi uyumlu bir ana merkeze bağlayın. Akım enjeksiyonu gerektiren protokoller için fonksiyon üreteci ve uyarıcı gibi aksesuarlar kullanın.
    2. Amplifikatör çıkışlarını bir veri sayısallaştırıcı sisteme, osiloskop ve sesli taban çizgisi monitörlerine bağlayın. Referans banyosu elektrodunu (Ag/AgCl peleti) akış odası çıkışının yakınına sabitleyin.
    3. Endotel hücrelerinde [Ca2+]i ölçmek için floresan sistemi arayüzünün, yüksek yoğunluklu ark lambasının ve güç kaynağının, hiperswitch'in, fotoçarpan tüpünün (veya PMT) ve kameranın entegre bileşenleri ile bir fotometrik sistem monte edin.
    4. Deney boyunca fizyolojik bir sıcaklığı (37 ° C) yükseltmek ve korumak için sıralı bir ısıtıcı ile donatılmış bir sıcaklık kontrol cihazı monte edin.
    5. Çözeltilerin hazneye sabitlenmiş endotel tüplerine iletilmesini kontrol etmek için bir hat içi akış kontrol vanası ile bir valf kontrolörüne bağlı çok kanallı bir platform monte edin.
  4. Mikropipetler ve keskin elektrotlar
    NOT: Deneycinin tritürasyon hazırlamak ve pipetleri sabitlemek için bir elektronik cam çektirmeye ve bir mikrodövmeye ihtiyacı olacaktır.
    1. Endotel tüpünü kısmen sindirilmiş arteriyolar segmentten ayırmak için, borosilikat cam kılcal damarlardan ısıl cilalı tritürasyon pipetleri (iç uç çapı: 30-50 μm) hazırlayın.
    2. Endotel tüpünü süperfüzyon odasına sabitlemek için, ince duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan hazırlanmış, körelmiş, küresel uçlu (dış çap: 50-70 μm) ısı ile parlatılmış iğneleme pipetleri hazırlayın.
    3. Bir endotel hücresinin Vm'sini kaydetmek için, sadece cam çektirmeyi kullanarak cam kılcal damarlardan ~ 150 ± 30 MΩ uç direncine sahip keskin elektrotlar hazırlayın.

2. Çözümler ve ilaçlar

  1. Fizyolojik tuz çözeltisi (PSS)
    1. 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM N-2-hidroksietiliperarazin-N'-2-etansülfonik asit (HEPES) ve 10 mM glikoz kullanarak en az 1 L PSS hazırlayın.
    2. Serebral arteriyollerin diseksiyonu ve endotel tüpünün izolasyonu için CaCl 2(sıfır Ca2+ PSS) içermeyen gerekli solüsyonları hazırlayın.
      NOT: Tüm çözeltileri ultra saf deiyonizeH2O'da hazırlayın, ardından filtrasyon (0,22 μm). Nihai ürünün, ozmolalitesi 290 ila 300 mOsm arasında olan bir pH 7.4 içerdiğinden emin olun.
  2. Sığır serum albümini (BSA, %10)
    1. Liyofilize BSA tozunun 1 g'ını 10 mL'lik sıfır Ca2 + PSS'lik bir beher içinde çözün. Beheri örtün ve BSA'nın çözünmesi için yavaş karıştırma ile en az 2 saat bekleyin.
    2. 10 mL'lik bir şırınga artı 0,22 μm filtre kullanarak çözeltiyi filtreleyin ve -20 ° C'de saklanmak üzere 1 mL alikot hazırlayın.
  3. Diseksiyon çözümü
    1. Toplam 50 mL hacim için 49,5 mL'lik sıfır Ca2+ PSS'ye 500 μL BSA (%10) ekleyin.
    2. Arteriyolar diseksiyonlar için bir Petri kabına transfer çözeltisi.
  4. Ayrışma çözümü
    1. Toplam 50 mL hacim için 5 μL CaCl2 çözeltisi (1 M) ve 500 μL BSA (%10) ile 49,5 mL sıfır Ca2+ PSS ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin.
  5. Enzim
    1. 100 μg / mL papain, 170 μg / mL ditiyoeritritol, 250 μg / mL kollajenaz (H tipi karışım) ve 40 μg / mL elastaz ile 1 mL sindirim çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Enzim aktiviteleri değişebilir, ancak başarılı protokoller muhtemelen aşağıdaki enzimatik aktiviteleri gerektirecektir: ≥ papain için 10 birim / mg, kollajenaz için ≥ 1 birim / mg ve elastaz için ≥ 5 birim / mg.
  6. Fura-2 ve farmakolojik ajanlar
    1. Fura-2 stoğunu dimetil sülfoksitte (DMSO; 1 mM) hazırlayın. Yükleme için 495 μL PSS'ye 5 μL stok ekleyerek 500 μL çalışma konsantrasyonu (10 μM) hazırlayın.
    2. PSS veya DMSO'da farmakolojik ajanların en az 50 mL çalışma konsantrasyonunu uygun şekilde hazırlayın.
  7. İletken çözüm
    1. KCl'yi deiyonize H 2 O'da çözerek2M KCl hazırlayın (50 mL'likH2O'da 7.455 g KCl). Keskin elektrotları geri doldurmadan önce çözeltiyi 0,22 μm filtreli bir şırıngadan geçirin.
  8. Floresan organel izleyiciler ve antikorlar
    1. Plazma zarı veya organellar (örneğin, çekirdek, endoplazmik retikulum) izleyicileri, üreticinin talimatlarına göre uygun fizyolojik salin çözeltisinde hazırlayın.
    2. Birincil ve ikincil antikorları, uygun fizyolojik tuz çözeltisinde üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.

3. Fare serebral arteriollerinin diseksiyonu ve izolasyonu

NOT: Tüm bu diseksiyon prosedürlerinde numune büyütme (50x'e kadar) için stereomikroskoplar ve keskinleştirilmiş mikrodiseksiyon aletleri (örneğin, ince uçlu forsepsler, Vannas tarzı diseksiyon makasları) kullanılmalıdır.

  1. Fare beyninin izolasyonu
    1. İzofluran inhalasyonu (2-3 dakika boyunca% 3) kullanarak standart bir laboratuvar faresini (örneğin, C57BL / 6, 3xTg-AD; 2-30 aylık, erkek veya dişi) anestezi altına alın, ardından IACUC onayına göre keskin makas veya giyotin kullanılarak derhal kafa kesme işlemi yapılır. Fare kafasını soğuk (4 °C) diseksiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına (çap 10 cm, derinlik 1,5 cm) yerleştirin.
    2. Bir stereomikroskop altında izlerken, kafatasının üzerindeki cildi ve kılları çıkarın ve aşırı kanı soğuk diseksiyon çözeltisi ile yıkayın. Standart diseksiyon makaslarının uçlarını (örneğin, 24 mm'lik bıçaklar) kullanarak, oksipital kemikten başlayarak kafatasının burun kemiğinden yukarı doğru uzanan bir kesi yapın. Kafatasını insizyon boyunca dikkatlice açmak için kaba uçlu forseps kullanın ve sağlam bir Willis Çemberi içeren beyni izole etmek için ayrı bağ dokusu (meningeal membran) kullanın.
    3. Beynin yüzeyinden kalan kanı çıkarmak için izole edilmiş beyni bir beher veya Petri kabında soğuk diseksiyon çözeltisi ile yıkayın. Beyin ventral tarafını yukarı bakacak şekilde, parankimal arteriollerin izolasyonu için soğuk diseksiyon çözeltisi içeren bir odaya yerleştirin (Şekil 2A).
  2. Parankimal arteriollerin izolasyonu
    NOT: Orta serebral arterlerden (MCA'lar) kaynaklanan ve beyin parankimine gömülü arterioller bu protokol için seçilmiştir. Arterioller daha önce tarif edildiği gibiizole edilir 11, modifikasyon ile.
    1. İzole edilmiş beyni, kömürle aşılanmış silikon polimer kaplama (derinlik ≥ 50 cm) içeren bir Petri kabında soğuk diseksiyon çözeltisinde sabitlemek için çelik pimler (çap: 0,2 mm, uzunluk: 11 ila 12 mm) kullanın.
    2. Keskin ve hizalanmış diseksiyon makası kullanarak, MCA'nın etrafındaki bir beyin dokusu dikdörtgenini (uzunluk: 5 mm, genişlik: 3 mm) (Şekil 2B) keserken, doku segmentinin üst kısmının Willis Çemberi'nden dallanma noktasını geçmesini sağlayın. Gerekirse daha fazla arteriol'e erişmek için beynin diğer yarımküresinden başka bir beyin dokusu dikdörtgeni kesin.
    3. Ayrılmış beyin dokusu segmentini, MCA yukarı bakacak şekilde (Willis Çemberi'nden distal) çelik pimler (çap: 0,1 mm, uzunluk: 13 ila 14 mm) kullanarak çanağa sabitleyin. Piayı küçük forsepslerle çıkarmak için pimlerin yakınında sığ bir kesi yapın, bir uçtan diğerine doğru yavaşça soyun (Şekil 2C). Gerekirse daha fazla arteriole erişmek için piayı diğer doku segmentinden çıkarın. İzole piayı, çanaktaki MCA'dan dallanmış parankimal arteriollerle pimlerle dikkatlice sabitleyin ve parankimal arteriolleri diseke edin (Şekil 2D), arteriollerin zarar görmemesini sağlayın.
      NOT: Arterioller parankimden pia ile kolayca çekilmezse, ince forseps kullanın ve Willis Çemberi'nden MCA dal noktasından başlayarak beynin içine kazın. Arteriolün yerini bulun, arteriollerin etrafındaki dokuyu dikkatlice gevşetin (Şekil 2E) ve arteriolün üst ucunu tutarak arteriolün parankimden yavaşça dışarı çekin (Şekil 2F). Çoklu arterioller (uzunluk: ~ 1.5-2 mm) beyin dokusunun bir dikdörtgeninden izole edilebilir.
    4. Arteriolün kendisine bağlı doku olmadan temiz olduğundan emin olun ve kalan distal dalları kesin (Şekil 3A). Enzimatik sindirim için bu temiz, sağlam arteriol kullanın. Alternatif olarak, istenirse endotel tüplerinin hazırlanması için enzimatik sindirim için her bir arteriol iki parçaya (uzunluk: 0.75-1 mm) kesin.

4. Parankimal arteriollerin sindirimi ve endotel tüplerinin hazırlanması

  1. Ekipman ve pipetlerin düzenlenmesi
    NOT: Arteriyel endotel tüplerinin beyinden izolasyonu daha önce13,18 olarak tanımlanmıştır. Mevcut protokol, endotelin parankimal (intraserebral) arteriollerden izolasyonu için modifikasyonlar içermektedir. Enzimatik sindirim için çoklu arterioller veya / ve arteriol parçaları birlikte kullanılabilir.
    1. Bir odayı ve mikromanipülatörleri destekleyen alüminyum bir aşama kullanarak endotel tüplerini hazırlamak için tritürasyon aparatı13'ü monte edin. Hedeflerle (5x-60x) donatılmış bir mikroskop ve bir bilgisayar monitörüne bağlı bir kamera monte edin. Sahnenin ve numunenin yanında bir pompa kontrolörü ile bir mikroşırıngayı sabitleyin.
    2. Mikroşırınga pistonunun üzerine mineral yağ ile doldurulmuş bir tritürasyon pipeti sabitleyin. Pipetteki hava kabarcıklarını önlemeye özen gösterirken ayrışma solüsyonunu mineral yağın üstündeki tritürasyon pipetine (~130 nL) çekmek için pompa kontrol cihazıyla birlikte mikroşırıngayı kullanın.
  2. Arteriyolar segmentlerin kısmi sindirimi
    1. Bozulmamış arteriyolar segmentleri, 100 μg / mL papain, 170 μg / mL ditiyoeritritol, 250 μg / mL kollajenaz ve 40 μg / mL elastaz içeren 10 mL'lik bir cam tüp içinde 1 mL ayrışma çözeltisine yerleştirin. Arteriyolar segmentleri 10-12 dakika boyunca 34 °C'de inkübe edin.
    2. Sindirimden sonra, enzim çözeltisini oda sıcaklığında 3-4 mL taze ayrışma çözeltisi ile değiştirin.
  3. Arteriyolar endotel tüpünün izolasyonu
    NOT: Enzim çözeltisinin sindirimi ve değiştirilmesini takiben, bir veya daha fazla kısmen sindirilmiş segmenti, bir mobil platforma bağlı bir süperfüzyon odasında ayrışma çözeltisine aktarın. 100x ila 200x büyütmede görüntülerken, kısmen sindirilmiş ancak kırılmamış bir damar segmenti seçin ve mikroskop altında odaklanın.
    1. Mikroşırınga enjektörüne bağlı tritürasyon pipetini odadaki ayrışma çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş damar segmentinin bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Nazik tritürasyon için pompa kontrolöründe 1-3 nL/s aralığında bir hız ayarlayın.
    2. 100x ila 200x büyütmeyi korurken, arteriyolar segmenti pipete çekin ve ardından adventiti ve düz kas hücrelerini ayırmak için dışarı çıkarın (Şekil 3B). Tüm düz kas hücreleri ayrışana kadar damar segmentini tritüre edin ve sadece endotel hücreleri sağlam bir "tüp" olarak kalır.
      NOT: Tritürasyon sırasında gerekirse, ayrışmış adventitiyi ve iç elastik laminayı endotel tüpünden çıkarmak için ince uçlu forseps kullanın. Tipik olarak, sadece birkaç tritürasyon döngüsü sağlam bir endotel tüpü verir.
    3. Odadaki cam kapak kayması üzerindeki endotel tüpünün her bir ucunu borosilikat cam sabitleme pipetleri ile sabitlemek için mikromanipülatörler kullanın (Şekil 3C, D).
  4. Arteriyolar endotel tüpünün sabitlenmesi
    1. Endotel dışı materyalin odadan yıkanmasını sağlarken ayrışma çözeltisini süperfüzyon çözeltisi (2 mM CaCl2 içeren PSS) ile değiştirin.
    2. Mobil platformdaki güvenli endotel tüpünü, sürekli süperfüzyon ve hücre içi veya floresan kayıtlar/görüntüleme için tasarlanmış mikroskop donanımına aktarın.
    3. Deneme sırasında PSS'nin sürekli teslimini uygulayın. Hat içi akış kontrol vanasını kullanarak deney boyunca akış hızını (5-7 mL/dak) laminer akışla tutarlı bir şekilde manuel olarak ayarlayın ve çözelti akışının beslemesini vakum emme derecesine göre eşleştirin. Arka plan verilerini ve / veya boya yüklemesini almadan önce endotel tüpünün süperfüzyonu için odaya ≥5 dakikalık PSS akışı sağlayın.

5. Hücresel fizyolojinin incelenmesinde arteriyolar endotel tüplerinin kullanımı

NOT: İzole ve güvenli arteriyolar endotel tüpleri, daha önce gösterildiği gibi sırasıyla fotometri ve keskin elektrot elektrofizyolojisi kullanılarak [Ca2+]i dinamiği ve Vm'nin hücre içi kayıtları içinkullanılabilir (Şekil 4). [Ca2+] i ve Vm, gerektiğinde ayrı veya birleşik deneysel değişkenler olarak ölçülebilir13 (Şekil 4). Bununla birlikte, arteriyolar endotel tüpleri arteriyel endotelden daha hassastır ve deney süresi 1 saati geçmemelidir.

  1. [Ca2+]i ölçümü
    1. [Ca2+]i kayıtları için ekipmanı ve yazılımı açarken, 5-7 mL/dak akış hızında sürekli süperfüzyonu koruyun.
    2. Endotel tüpünü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Ca2+ boya Fura-2 ile yükleyin. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 ° C'ye yükseltirken hücreleri 20-30 dakika daha süperfüzyon çözeltisi ile yıkayın. Deney boyunca sıcaklığı 37 ° C'de tutun.
    3. ~20 endotel hücresine odaklanmak için fotometri yazılımını kullanarak görüntüleme penceresini manuel olarak ayarlayın (Şekil 4A). Işık yokluğunda, PMT'yi floresan arayüzünde çevirin ve 510 nm'de floresan emisyonu toplarken Fura-2'yi dönüşümlü olarak (≥10 Hz) 340 nm ve 380 nm'de heyecanlandırarak [Ca2+]i elde etmeye başlayın. [Ca2+]i'nin kararlı bir başlangıç kaydı oluşturulduktan sonra, deneysel amaç başına farmakolojik ajanlar (örneğin, pürinerjik reseptör agonistleri) uygulayın (Şekil 4B).
  2. Vm ölçümü
    1. Vm kayıtları için ekipmanı ve yazılımı açın ve 5-7 mL/dak akış hızında sürekli süperfüzyonu korurken veri toplama hızını (≥10 Hz) ayarlayın. Banyo sıcaklığını kademeli olarak 37 ° C'ye yükseltin ve deneyin sonuna kadar koruyun.
    2. Bir borosilikat cam kılcal damar kullanarak keskin bir elektrot çekin, 2 M KCl ile doldurun ve bir elektrometreye bağlı pipet tutucusunda klorürle kaplı gümüş bir tel üzerine sabitleyin, bu da bir mikromanipülatör tarafından tutulur.
    3. 4x hedefini izlerken, keskin elektrot ucunu arteriyolar endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine dikkatlice yerleştirmek için bir mikromanipülatör kullanın.
    4. Büyütmeyi kademeli olarak 400x'e yükseltin ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın.
    5. Mikromanipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine yavaşça yerleştirin ve bir elektrometre kullanarak Vm kaydetmeye başlayın (Şekil 4A).
    6. Endotel istirahati Vm stabil olduğunda (-30 ila -40 mV), deneysel amaç başına istenen farmakolojik ajanları uygulayın (Şekil 4C).

6. Hücresel görüntüleme

NOT: Mobil platformun odasına sabitlenmiş endotel tüpleri, standart floresan veya konfokal mikroskopi kullanılarak hem canlı hem de sabit koşullarda19 mikroskobik görüntüleme için de kullanılabilir. Reseptörler ve iyon kanalları için farklı antikorlara sahip immünohistokimya da daha önce tarif edildiği gibi uygulanabilir20.

  1. Endotel tüpünü, plazma zarı veya istenen organel (örneğin, çekirdek, endoplazmik retikulum) için floresan izleyici ile 15-30 dakika boyunca 37 ° C'de yükleyin.
  2. Hücreleri taze süperfüzyon PSS ile yıkayın ve canlı hücreleri mikroskop altında ilgili boyaların uyarma dalga boyunda görüntüleyin (Şekil 4D, E).
    NOT: İmmünohistokimya, bu tüp modelinde ilgili antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Protokolün bir gösterimi Şekil 1'de arteriyoler diseksiyon ve endotel tüp izolasyon basamakları ile sırasıyla Şekil 2 ve Şekil 3 olarak gösterilmiştir. Burada, endotel fonksiyonu, 37 ° C'de güçlü bir pürinerjik reseptör (P2YR) agonisti olan 2-metiltiyoadenozin difosfat (MTA), güçlü bir pürinerjik reseptör (P2YR) agonisti] yanıtında Fura-2 fotometrisi ve keskin elektrot elektrofizyolojisi (

Tartışmalar

Artan kanıtlar, serebrovasküler hastalık (CVD), yaşlanma ve Alzheimer hastalığının güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu ve demans araştırmalarının güncel bir konusu olduğunu göstermektedir 4,8,14,21. Bu nedenle, serebrovasküler ağ çalışmalarının sağlık üzerinde geniş bir etkiye sahip olacağı ve hastalık koşulları sırasında sürekli kapsamlı araştırmalar ...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R00AG047198 & R56AG062169) EJB'ye; R00HL140106'dan PWP'ye) ve Alzheimer Derneği (AZRGD-21-805835'ten PWP'ye). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Alzheimer Derneği'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AmplifiersMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAAxoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitorsAmpol US LLC, Sarasota, FL, USA BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)ThermoFisher Scientific13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)Warner InstrumentsG150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)Warner InstrumentsGC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA1B100-4
BSA: Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
CaCl2: Calcium ChlorideSigma223506
Collagenase (Type H Blend)SigmaC8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)ThermoFisher Scientific12-548-5M
Data Acquision DigitizerMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USADigidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USADD-90-S-BLK
DithioerythritolSigmaD8255
DMSO: Dimethyl SulfoxideSigmaD8418
Elastase (porcine pancreas)SigmaE7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)ThermoFisher ScientificE34250
Fiber optic light sources Schott, Mainz, Germany & KL200, ZeissFostec 8375
Flow Control ValveWarner Instruments FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMTMolecular Devices, Sunnyvale, CA, USAIonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)FSTDumont #5 & Dumont #55
Function GeneratorEZ Digital, Seoul, South KoreaFG-8002
Fura-2 AM dyeInvitrogen, Carlsbad, CA, USAF14185
GlucoseSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)G7021
HCl: Hydrochloric AcidThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)A466250
HeadstagesMolecular DevicesHS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)SigmaH4034
Inline Solution HeaterWarner InstrumentsSH-27B
KCl: Potassium ChlorideSigmaP9541
MgCl2: Magnesium ChlorideSigmaM2670
MicroforgeNarishige, East Meadow, NY, USA MF-900
MicromanipulatorSiskiyou MX10
Micropipette puller (digital)Sutter Instruments, Novato, CA, USAP-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USATs2
Microscope (Nikon-inverted)Nikon Instruments IncEclipse TS100
Microscope objectivesNikon Instruments Inc20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)Warner InstrumentsPM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)Siskiyou, Grants Pass, OR, USA8090P
Microsyringe Pump ControllerWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USASYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium saltTocris1624
NaCl: Sodium ChlorideSigmaS7653
NaOH: Sodium HydroxideSigmaS8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)ThermoFisher ScientificR37605
OscilloscopeTektronix, Beaverton, Oregon, USA TDS 2024B
PapainSigmaP4762
Phase contrast objectivesNikon Instruments Inc (Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)ThermoFisher ScientificC10046
Plexiglas superfusion chamberWarner Instruments, Camden, CT, USARC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USAMoria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)World Precision Instruments555640S, 14364
StereomicroscopesZeiss, NY, USAStemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)ThermoFisher Scientific722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)Warner InstrumentsTC-344B or C
Valve Control SystemWarner InstrumentsVC-6
Vibration Isolation TableTechnical Manufacturing, Peabody, MA, USA Micro-g

Referanslar

  1. Fernandez-Klett, F., Offenhauser, N., Dirnagl, U., Priller, J., Lindauer, U. Pericytes in capillaries are contractile in vivo, but arterioles mediate functional hyperemia in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22290-22295 (2010).
  2. Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
  3. Kelleher, R. J., Soiza, R. L. Evidence of endothelial dysfunction in the development of Alzheimer's disease: Is Alzheimer's a vascular disorder. American Journal of Cardiovascular Disease. 3 (4), 197-226 (2013).
  4. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Development of Alzheimer's disease progressively alters sex-dependent KCa and sex-independent KIR channel function in cerebrovascular endothelium. Journal of Alzheimers Disease. 76 (4), 1423-1442 (2020).
  5. Pires, P. W., Earley, S. Neuroprotective effects of TRPA1 channels in the cerebral endothelium following ischemic stroke. elife. 7, 35316 (2018).
  6. Mughal, A., Harraz, O. F., Gonzales, A. L., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 improves cerebral blood flow in a mouse model of Alzheimer's disease. Function. 2 (2), (2021).
  7. Zhao, L., et al. Pharmacologically reversible zonation-dependent endothelial cell transcriptomic changes with neurodegenerative disease associations in the aged brain. Nature Communications. 11 (1), 4413 (2020).
  8. Peters, E. C., et al. Amyloid-beta disrupts unitary calcium entry through endothelial NMDA receptors in mouse cerebral arteries. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2021).
  9. De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in cerebral arteries and parenchymal arterioles with aging: Role of rho kinase 2 and impact of genetic background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
  10. Fontaine, J. T., Rosehart, A. C., Joutel, A., Dabertrand, F. HB-EGF depolarizes hippocampal arterioles to restore myogenic tone in a genetic model of small vessel disease. Mechanisms of Ageing and Development. 192, 111389 (2020).
  11. Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (111), e53835 (2016).
  12. Rosehart, A. C., Johnson, A. C., Dabertrand, F. Ex vivo pressurized hippocampal capillary-parenchymal arteriole preparation for functional study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60676 (2019).
  13. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous measurements of intracellular calcium and membrane potential in freshly isolated and intact mouse cerebral endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58832 (2019).
  14. Hakim, M. A., Chum, P. P., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Aging alters cerebrovascular endothelial GPCR and K+ channel function: Divergent role of biological sex. Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 75 (11), 2064-2073 (2020).
  15. Behringer, E. J., Hakim, M. A. Functional interaction among KCa and TRP channels for cardiovascular physiology: Modern perspectives on aging and chronic disease. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1380 (2019).
  16. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), 1590-1599 (2003).
  17. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SKCa and IKCa channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  18. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacological Research and Perspectives. 6 (2), 00391 (2018).
  19. Hakim, M. A., Behringer, E. J. Methyl-beta-cyclodextrin restores KIR channel function in brain endothelium of female Alzheimer's disease Mice. Journal of Alzheimers Disease Reports. 5 (1), 693-703 (2021).
  20. Behringer, E. J., Shaw, R. L., Westcott, E. B., Socha, M. J., Segal, S. S. Aging impairs electrical conduction along endothelium of resistance arteries through enhanced Ca2+-activated K+ channel activation. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1892-1901 (2013).
  21. Attems, J., Jellinger, K. A. The overlap between vascular disease and Alzheimer's disease--lessons from pathology. BMC Medicine. 12, 206 (2014).
  22. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 12 (1), 1-15 (1968).
  23. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  24. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (1), 1-14 (2014).
  25. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
  26. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
  27. Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. Journal of Vascular Research. 58 (3), 159-171 (2021).
  28. Bando, Y., Sakamoto, M., Kim, S., Ayzenshtat, I., Yuste, R. Comparative evaluation of genetically encoded voltage indicators. Cell Reports. 26 (3), 802-813 (2019).
  29. Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), 2031-2041 (2015).
  30. Behringer, E. J., Segal, S. S. Tuning electrical conduction along endothelial tubes of resistance arteries through Ca2+-activated K+ channels. Circulation Research. 110 (10), 1311-1321 (2012).
  31. Behringer, E. J., Socha, M. J., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Electrical conduction along endothelial cell tubes from mouse feed arteries: confounding actions of glycyrrhetinic acid derivatives. British Journal of Pharmacology. 166 (2), 774-787 (2012).
  32. Thomsen, M. S., Routhe, L. J., Moos, T. The vascular basement membrane in the healthy and pathological brain. Journal of Cerebral of Blood Flow and Metabolism. 37 (10), 3300-3317 (2017).
  33. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. elife. 9, 51413 (2020).
  34. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 365-375 (2016).
  35. Chen, M. B., et al. Brain endothelial cells are exquisite sensors of age-related circulatory cues. Cell Reports. 30 (13), 4418-4432 (2020).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 181beyin mikrosirk lasyonuendotel hiperpolarizasyonuCa2 sinyalizasyonuK kanallarh cresel g r nt lemeelektrofizyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır