Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Résumé

La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca²⁺] et membranaire.

Résumé

Le flux sanguin cérébral est véhiculé par les artères de résistance vasculaire et les artérioles parenchymateuses en aval. La résistance vasculaire à l’état d’équilibre au flux sanguin augmente avec la diminution du diamètre des artères aux artérioles qui alimentent finalement les capillaires. En raison de leur plus petite taille et de leur emplacement dans le parenchyme, les artérioles ont été relativement peu étudiées et avec moins de reproductibilité dans les résultats que les artères piales de surface. Quoi qu’il en soit, la structure et la fonction des cellules endothéliales artériolaires – qui font partie intégrante de la physiologie et de l’étiologie des maladies dégénératives chroniques – nécessitent une enquête approfondie. En particulier, de nouvelles preuves démontrent que la fonction endothéliale compromise précède et exacerbe les troubles cognitifs et la démence.

Dans la microcirculation parenchymateuse, la fonction endothéliale du canal K ⁺ est le stimulus le plus robuste pour contrôler finement la propagation de la vasodilatation afin de favoriser l’augmentation du flux sanguin vers les zones d’activité neuronale. Cet article illustre une méthode raffinée pour isoler fraîchement des « tubes » endothéliaux intacts et couplés électriquement (diamètre, ~ 25 μm) à partir d’artérioles parenchymateuses du cerveau de souris. Les tubes endothéliaux artériolaires sont fixés dans des conditions physiologiques (37 °C, pH 7,4) pour résoudre les variables expérimentales qui englobent la fonction du canal K⁺ et leur régulation, y compris la dynamique intracellulaire du Ca²⁺ , les changements dans le potentiel membranaire et la régulation des lipides membranaires. Un avantage technique distinct par rapport à l’endothélium artériel est la résolution morphologique améliorée des dimensions des cellules et des organites (par exemple, les mitochondries), ce qui élargit l’utilité de cette technique. Une perfusion cérébrale saine tout au long de la vie implique une fonction endothéliale robuste dans les artérioles parenchymateuses, reliant directement le flux sanguin à l’alimentation de l’activité neuronale et gliale dans des régions anatomiques précises du cerveau. Ainsi, on s’attend à ce que cette méthode fasse progresser de manière significative les connaissances générales en physiologie vasculaire et en neurosciences concernant le cerveau sain et malade.

Introduction

Les artérioles parenchymateuses fournissent directement de l’oxygène et des nutriments essentiels dans tout le cerveau¹. Lors de l’interfaçage avec les capillaires, les artérioles hautement vasoactives répondent à la signalisation rétrograde initiée par les canaux ioniques capillaires qui détectent les signaux métaboliques de régions neuronales spécifiques². Le parenchyme cérébral ayant historiquement fait l’objet de la majeure partie des recherches, un rôle pour le dysfonctionnement endothélial est maintenant apparu pour clarifier les mécanismes pathologiques associés à divers troubles cérébrovasculaires qui sous-tendent la démence (par exemple, accident vasculaire cérébral ischémique, maladie d’Alzheimer)3,4,5,6 . L’endothélium fait partie intégrante de la perfusion du cerveau en accord avec l’hétérogénéité de la génétique, de la structure et de la fonction dans les segments vasculaires⁷. Les artères piales ont été largement étudiées en raison de leur taille relativement grande, de leur résistance vasculaire segmentaire élevée et de leur rôle dans la distribution du flux sanguin vers le cerveau sous-jacent ^8,9. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes endothéliaux artériolaires améliorera probablement la compréhension de la régulation du flux sanguin cérébral dans la santé et la maladie en vue du développement de nouveaux schémas thérapeutiques.

De nouvelles preuves soulignent l’importance d’étudier les artérioles parenchymateuses en relation avec différentes voies de signalisation et maladies ^8,10. Cependant, cette approche s’est limitée à l’utilisation de préparations intactes d’artériole¹¹ sous pression et/ou d’artériole capillaire-parenchymateuse (CaPA)¹². Les cellules endothéliales artériolaires cérébrales natives fraîchement isolées et dépourvues d’autres types de cellules et de facteurs de confusion n’ont pas été examinées, probablement en raison de difficultés techniques dans leur isolement. Cet article avance une technique antérieure mettant en évidence l’isolement de l’endothélium artériel pial¹³ pour isoler maintenant de manière fiable et reproductible l’endothélium des artérioles parenchymateuses du cerveau (largeur: ~25 μm, longueur: ~250 μm). Cette technique permet d’obtenir une résolution optimale des cellules couplées électriquement et chimiquement dans leur orientation individuelle et leurs réseaux cellulaires.

Les principales voies d’intérêt ont inclus l’interaction de la signalisation intracellulaire ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) et l’hyperpolarisation du potentiel membranaire (V_m)^14,15 – partie intégrante de la vasodilatation¹⁶ – pour permettre au sang de pénétrer dans les capillaires et de fournir de l’oxygène et des nutriments au parenchyme^{actif 17}. Ces préparations permettent des enregistrements électrophysiologiques en temps réel des canaux ioniques, y compris les canaux ca²⁺-perméants, le potentiel récepteur transitoire (TRP) et les canaux K⁺ et/ou l’imagerie fluorescente des organites intracellulaires dans les tubes cellulaires endothéliaux dans des conditions quasi physiologiques. Il s’agit d’une technique appropriée pour les chercheurs intéressés par les mécanismes cellulaires physiologiques qui régissent le contrôle des cellules endothéliales de l’administration du flux sanguin cérébral au parenchyme cérébral. Dans l’ensemble, cette technique aidera les chercheurs à mieux comprendre les voies fondamentales de signalisation endothéliale et la communication en réseau des artérioles intégrées dans le parenchyme cérébral tout en abordant les questions liées à la physiologie et à la pathologie cérébrovasculaires.

Protocole

Les expérimentateurs doivent s’assurer que l’utilisation désignée des animaux et les protocoles connexes sont approuvés par leur Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) et effectués conformément au « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » du Conseil national de recherches du Canada (8^e édition, 2011) et aux lignes directrices ARRIVE. L’IACUC de l’Université de Loma Linda et l’Université de l’Arizona ont approuvé tous les protocoles utilisés pour ce manuscrit pour les souris C57BL/6N et 3xTg-AD (mâles et femelles; tranche d’âge: 2-30 mois). Voir la figure 1 comme un aperçu de l’isolement et de l’examen des tubes endothéliaux artériolaires fraîchement isolés à partir d’artérioles parenchymateuses du cerveau de souris.

1. Matériaux et équipements

REMARQUE : Voir le Tableau des matériaux pour tous les réactifs et matériaux requis pour ce protocole. En outre, les manuels et les sites Web associés aux fournisseurs respectifs peuvent également être consultés au besoin. Des illustrations de stations de dissection et d’appareils expérimentaux ont déjà été fournies¹³.

1. Chambre d’écoulement
   1. Fixez une chambre de superfusion avec un couvercle en verre sur une plate-forme composée d’aluminium anodisé. Fixez la plate-forme avec la chambre sur un étage de microscope en aluminium.
   2. Placez un micromanipulateur tenant une pipette d’épinglage à chaque extrémité de la plate-forme sur l’étage du microscope en aluminium.
      REMARQUE: Si nécessaire, utilisez un appareil à étage transférable avec une unité de chambre d’écoulement pour déplacer un tube endothélial isolé et sécurisé d’un appareil de microscope à un autre pour l’expérimentation.
2. Microscopes
   1. Utilisez des stéréomicroscopes (plage de grossissement de 5 à 50x) et des sources lumineuses à fibre optique pour les procédures de dissection.
   2. Pour isoler les tubes endothéliaux, utilisez un microscope inversé équipé d’objectifs compatibles avec le contraste de phase ou le contraste d’interférence différentielle (DIC) (10x, 20x et 40x) et un étage en aluminium.
   3. Ayez un contrôleur de pompe à microsyringe prêt à côté de l’appareil dédié à l’isolation des tubes endothéliaux des vaisseaux sanguins partiellement digérés.
   4. Installez l’appareil expérimental en disposant un microscope inversé (objectifs: 4x, 10x, 20x, 40x et 60x) et un étage manuel en aluminium sur une table d’isolation des vibrations.
3. Appareil de contrôle intracellulaire V_m
   1. Connectez l’électromètre à un headstage compatible. Utilisez des accessoires, tels qu’un générateur de fonction et un stimulateur, pour les protocoles nécessitant une injection de courant.
   2. Connectez les sorties d’amplificateur à un système de numérisation de données, à un oscilloscope et à des moniteurs de base audibles. Fixez l’électrode de bain de référence (pastille Ag/AgCl) près de la sortie de la chambre d’écoulement.
   3. Assemblez un système photométrique avec des composants intégrés d’une interface de système de fluorescence, d’une lampe à arc à haute intensité et d’une alimentation électrique, d’un hypercommutateur, d’un tube photomultiplicateur (ou PMT) et _d’une caméra pour mesurer [Ca²⁺]i dans les cellules endothéliales.
   4. Assemblez un régulateur de température équipé d’un réchauffeur en ligne pour élever et maintenir une température physiologique (37 °C) tout au long de l’expérience.
   5. Assemblez une plate-forme multicanal connectée à un contrôleur de vanne avec une vanne de régulation de débit en ligne pour contrôler la livraison de solutions aux tubes endothéliaux fixés dans la chambre.
4. Micropipettes et électrodes tranchantes
   REMARQUE: L’expérimentateur aura besoin d’un extracteur de verre électronique et d’une microforge pour préparer la trituration et épingler les pipettes.
   1. Pour séparer le tube endothélial du segment artériolaire partiellement digéré, préparez des pipettes de trituration polies thermiquement (diamètre interne de la pointe: 30-50 μm) à partir de capillaires en verre borosilicate.
   2. Pour fixer le tube endothélial dans la chambre de superfusion, préparez des pipettes d’épinglage polies à la chaleur avec une extrémité sphérique émoussée (diamètre extérieur: 50-70 μm) préparée à partir de capillaires en verre borosilicate à paroi mince.
   3. Pour enregistrer V_m d’une cellule endothéliale, préparez des électrodes pointues avec une résistance de pointe d’environ 150 ± 30 MΩ à partir de capillaires en verre en utilisant uniquement le extracteur de verre.

2. Solutions et médicaments

1. Solution saline physiologique (PSS)
   1. Préparer un minimum de 1 L de PSS en utilisant 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de_CaCl2, 1 mM de_MgCl2, 10 mM d’acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique (HEPES) et 10 mM de glucose.
   2. Préparer les solutions nécessaires dépourvues de CaCl₂ (zéro Ca²⁺ PSS) pour la dissection des artérioles cérébrales et l’isolement du tube endothélial.
      REMARQUE: Préparer toutes les solutions dans H₂O désionisé ultrapur, suivi d’une filtration (0,22 μm). Assurez-vous que le produit final contient un pH de 7,4 avec une osmolalité comprise entre 290 et 300 mOsm.
2. Albumine sérique bovine (BSA, 10 %)
   1. Dissoudre 1 g de poudre de BSA lyophilisée dans un bécher de 10 mL de Ca²⁺ PSS nul. Couvrir le bécher et laisser reposer au moins 2 h en remuant lentement pour que le BSA se dissolve.
   2. Filtrer la solution à l’aide d’une seringue de 10 mL plus un filtre de 0,22 μm et préparer 1 mL d’aliquotes à conserver à -20 °C.
3. Solution de dissection
   1. Ajouter 500 μL de BSA (10 %) à 49,5 mL de Ca²⁺ PSS zéro pour un volume total de 50 mL.
   2. Transférer la solution dans une boîte de Petri pour des dissections artériolaires.
4. Solution de dissociation
   1. Ajouter 5 μL de solution de CaCl₂ (1 M) et 500 μL de BSA (10 %) à 49,5 mL de Ca²⁺ PSS zéro pour un volume total de 50 mL. Incuber la solution à température ambiante pendant au moins 1 h.
5. Enzymes
   1. Préparer 1 mL de solution de digestion avec 100 μg/mL de papaïne, 170 μg/mL de dithioérythritol, 250 μg/mL de collagénase (mélange de type H) et 40 μg/mL d’élastase.
      REMARQUE: Les activités enzymatiques peuvent varier, bien que les protocoles réussis nécessiteront probablement les activités enzymatiques suivantes: ≥ 10 unités / mg pour la papaïne, ≥ 1 unité / mg pour la collagénase et ≥ 5 unités / mg pour l’élastase.
6. Fura-2 et agents pharmacologiques
   1. Préparer le bouillon de Fura-2 AM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO; 1 mM). Préparer 500 μL de concentration de travail (10 μM) en ajoutant 5 μL de la matière à 495 μL de PSS pour le chargement.
   2. Préparer au moins 50 mL de concentrations opérationnelles d’agents pharmacologiques dans le PSS ou le DMSO, selon le cas.
7. Solution de conduction
   1. Préparer 2 M KCl en dissolvant KCl dans H₂O désionisé (7,455 g de KCl dans 50 mL de H₂O). Passer la solution à travers une seringue avec un filtre de 0,22 μm avant de remplir les électrodes tranchantes.
8. Trackers d’organites fluorescents et anticorps
   1. Préparer des traceurs de membrane plasmique ou organellaires (p. ex. noyau, réticulum endoplasmique) dans la solution saline physiologique appropriée conformément aux instructions du fabricant.
   2. Préparer les anticorps primaires et secondaires selon les instructions du fabricant dans la solution saline physiologique appropriée.

3. Dissection et isolement des artérioles cérébrales de souris

REMARQUE: Les stéréomicroscopes et les outils de microdissection affûtés (par exemple, les pinces à pointe fine, les ciseaux de dissection de style Vannas) doivent être utilisés pour le grossissement de l’échantillon (jusqu’à 50x) dans toutes ces procédures de dissection.

1. Isolement du cerveau de la souris
   1. Anesthésier une souris de laboratoire standard (p. ex., C57BL/6, 3xTg-AD; 2 à 30 mois, mâle ou femelle) par inhalation d’isoflurane (3 % pendant 2 à 3 min), suivie d’une décapitation immédiate à l’aide de ciseaux tranchants ou de guillotine selon l’approbation de l’IACUC. Placer la tête de souris dans une boîte de Petri (diamètre 10 cm, profondeur 1,5 cm) contenant une solution de dissection froide (4 °C).
   2. Lors de la visualisation sous un stéréomicroscope, retirez la peau et les poils sur le crâne et lavez l’excès de sang avec une solution de dissection froide. À l’aide des pointes des ciseaux à dissection standard (p. ex. lames de 24 mm), faites une incision en commençant par l’os occipital et en s’étendant jusqu’à travers l’os nasal du crâne. Utilisez des pinces à pointe grossière pour ouvrir soigneusement le crâne le long de l’incision et séparez le tissu conjonctif (membrane méningée) pour isoler le cerveau contenant un cercle intact de Willis.
   3. Lavez le cerveau isolé avec une solution de dissection froide dans un bécher ou une boîte de Pétri pour éliminer le sang restant de la surface du cerveau. Placer la face ventrale du cerveau vers le haut dans une chambre contenant une solution de dissection froide pour isoler les artérioles parenchymateuses (Figure 2A).
2. Isolement des artérioles parenchymateuses
   REMARQUE: Les artérioles provenant des artères cérébrales moyennes (MCA) et intégrées dans le parenchyme cérébral sont choisies pour ce protocole. Les artérioles sont isolées comme décrit précédemment¹¹, avec modification.
   1. Utilisez des broches en acier (diamètre: 0,2 mm, longueur: 11 à 12 mm) pour fixer le cerveau isolé dans une solution de dissection froide dans une boîte de Petri contenant un revêtement en polymère de silicium infusé de charbon de bois (profondeur ≥ 50 cm).
   2. À l’aide de ciseaux de dissection tranchants et alignés, coupez un rectangle de tissu cérébral (longueur: 5 mm, largeur: 3 mm) (Figure 2B) autour du MCA tout en vous assurant que la partie supérieure du segment tissulaire est au-delà du point de ramification du cercle de Willis. Coupez un autre rectangle de tissu cérébral de l’autre hémisphère du cerveau pour accéder à plus d’artérioles si nécessaire.
   3. Fixez le segment de tissu cérébral séparé dans le plat avec le MCA tourné vers le haut (distal du cercle de Willis) à l’aide de broches en acier (diamètre: 0,1 mm, longueur: 13 à 14 mm). Faites soigneusement une incision peu profonde près des broches pour retirer la pia avec une petite pince, en pelant doucement d’une extrémité vers l’autre (Figure 2C). Retirez la pia de l’autre segment tissulaire pour accéder à plus d’artérioles si nécessaire. Fixez soigneusement la pia isolée avec des artérioles parenchymateuses ramifiées à partir de MCA dans le plat avec les épingles et disséquez les artérioles parenchymateuses (Figure 2D), en veillant à ce que les artérioles ne soient pas endommagées.
      REMARQUE: Si les artérioles ne sont pas facilement retirées avec la pia du parenchyme, utilisez une pince fine et creusez dans le cerveau, en commençant par le point de branche MCA du cercle de Willis. Localisez l’artériole, desserrez soigneusement le tissu autour des artérioles (figure 2E) et retirez doucement l’artériole du parenchyme, en maintenant l’extrémité supérieure de l’artériole (figure 2F). Plusieurs artérioles (longueur: ~ 1,5-2 mm) peuvent être isolées à partir d’un rectangle de tissu cérébral.
   4. Assurez-vous que l’artériole est propre sans tissu attaché et coupez toutes les branches distales restantes (figure 3A). Utilisez cet artériole propre et intact pour la digestion enzymatique. Alternativement, coupez chaque artériole en deux morceaux (longueur: 0,75-1 mm) pour la digestion enzymatique pour la préparation de tubes endothéliaux si vous le souhaitez.

4. Digestion des artérioles parenchymateuses et préparation des tubes endothéliaux

1. Disposition de l’équipement et des pipettes
   NOTE: L’isolement des trompes endothéliales artérielles du cerveau a été décrit précédemment^13,18. Le protocole actuel incorpore des modifications pour l’isolement de l’endothélium des artérioles parenchymateuses (intracérébrales). Plusieurs artérioles et/ou morceaux d’artérioles peuvent être utilisés ensemble pour la digestion enzymatique.
   1. Assemblez l’appareil de trituration¹³ pour la préparation de tubes endothéliaux à l’aide d’un étage en aluminium supportant une chambre et des micromanipulateurs. Assemblez un microscope équipé d’objectifs (5x-60x) et d’une caméra connectée à un écran d’ordinateur. Fixez un microsyringe avec un contrôleur de pompe à côté de la scène et de l’échantillon.
   2. Fixez une pipette de trituration remblayée avec de l’huile minérale sur le piston microsyringe. Utilisez le microsyringe avec le contrôleur de pompe pour retirer la solution de dissociation dans la pipette de trituration (~130 nL) sur le dessus de l’huile minérale tout en prenant soin d’éviter les bulles d’air dans la pipette.
2. Digestion partielle des segments artériolaires
   1. Placer des segments artériolaires intacts dans 1 mL de solution de dissociation dans un tube de verre de 10 mL contenant 100 μg/mL de papaïne, 170 μg/mL de dithioérythritol, 250 μg/mL de collagénase et 40 μg/mL d’élastase. Incuber des segments artériolaires à 34 °C pendant 10-12 min.
   2. Après la digestion, remplacer la solution enzymatique par 3-4 mL de solution de dissociation fraîche à température ambiante.
3. Isolement du tube endothélial artériolaire
   REMARQUE: Après la digestion et le remplacement de la solution enzymatique, transférer un ou plusieurs segments partiellement digérés dans la solution de dissociation dans une chambre de superfusion fixée à une plate-forme mobile. Lors de l’affichage à un grossissement de 100x à 200x, sélectionnez un segment de vaisseau partiellement digéré mais ininterrompu et concentrez-vous dessus au microscope.
   1. Placez la pipette de trituration fixée avec l’injecteur de microsyringe dans la solution de dissociation dans la chambre et positionnez-la près d’une extrémité du segment de récipient digéré. Réglez un débit compris entre 1 et 3 nL/s sur le contrôleur de la pompe pour une trituration en douceur.
   2. Tout en maintenant un grossissement de 100x à 200x, retirez le segment artériolaire dans la pipette, puis éjectez-vous pour dissocier l’adventice et les cellules musculaires lisses (Figure 3B). Triturez le segment des vaisseaux jusqu’à ce que toutes les cellules musculaires lisses soient dissociées et que seules les cellules endothéliales restent sous forme de « tube » intact.
      REMARQUE: Si nécessaire pendant la trituration, utilisez soigneusement une pince à pointe fine pour retirer l’adventice dissociée et la lame élastique interne du tube endothélial. En règle générale, seuls quelques cycles de trituration donnent un tube endothélial intact.
   3. Utilisez des micromanipulateurs pour fixer chaque extrémité du tube endothélial sur le couvercle en verre dans la chambre avec des pipettes d’épinglage en verre borosilicate (Figure 3C,D).
4. Fixation du tube endothélial artériolaire
   1. Remplacer la solution de dissociation par une solution de superfusion (PSS contenant 2 mM de CaCl₂) tout en veillant à ce que le matériau non endothélial soit lavé de la chambre.
   2. Transférer le tube endothélial sécurisé de la plate-forme mobile vers la plate-forme de microscope conçue pour la superfusion continue et les enregistrements / imagerie intracellulaires ou fluorescents.
   3. Appliquer la livraison continue de PSS pendant l’expérience. Réglez manuellement le débit (5-7 mL/min) tout au long de l’expérience à l’aide de la vanne de régulation du débit en ligne, compatible avec le débit laminaire, tout en faisant correspondre l’alimentation du débit de solution à l’étendue de l’aspiration sous vide. Laisser ≥5 min d’écoulement PSS dans la chambre pour la superfusion du tube endothélial avant d’acquérir des données de fond et/ou de chargement de colorant.

5. Utilisation de trompes endothéliales artériolaires pour l’examen de la physiologie cellulaire

REMARQUE: Des tubes endothéliaux artériolaires isolés et sécurisés peuvent être utilisés pour les enregistrements intracellulaires de la dynamique [Ca²⁺]_i et de V_m en utilisant respectivement la photométrie et l’électrophysiologie des électrodes pointues, comme illustré précédemment¹³ (Figure 4). [Ca²⁺] _i et V_m peuvent être mesurés en tant que variables expérimentales distinctes ou combinées selon les besoins¹³ (Figure 4). Cependant, les tubes endothéliaux artériolaires sont plus délicats que l’endothélium artériel et le temps d’expérimentation ne doit pas dépasser 1 h.

1. Mesure de [Ca²⁺]_i
   1. Allumez l’équipement et le logiciel pour les enregistrements [Ca²⁺]_i tout en maintenant une superfusion continue à un débit de 5 à 7 mL/min.
   2. Chargez le tube endothélial avec le colorant Ca²⁺ Fura-2 AM pendant 30 min à température ambiante. Lavez les cellules avec une solution de superfusion pendant encore 20 à 30 minutes tout en augmentant progressivement la température du bain à 37 ° C. Maintenez la température à 37 °C tout au long de l’expérience.
   3. Ajustez manuellement la fenêtre d’imagerie à l’aide d’un logiciel de photométrie pour faire la mise au point sur environ 20 cellules endothéliales (Figure 4A). En l’absence de lumière, tournez le PMT sur l’interface de fluorescence et commencez l’acquisition de [Ca²⁺]_i en excitant Fura-2 alternativement (≥10 Hz) à 340 nm et 380 nm tout en collectant l’émission de fluorescence à 510 nm. Une fois qu’un enregistrement de base stable de [Ca²⁺]_i est établi, appliquer des agents pharmacologiques (p. ex., agonistes des récepteurs purinergiques) par objectif expérimental (figure 4B).
2. Mesure de V_m
   1. Allumez l’équipement et le logiciel pour les enregistrements V_m et réglez le débit d’acquisition de données (≥10 Hz) tout en maintenant une superfusion continue à un débit de 5 à 7 mL / min. Augmentez progressivement la température du bain à 37 °C et maintenez-la jusqu’à la fin de l’expérience.
   2. Tirez une électrode tranchante à l’aide d’un capillaire en verre borosilicate, remblai de 2 M KCl, et fixez-la sur un fil d’argent recouvert de chlorure dans le porte-pipette fixé à un électromètre, qui à son tour, est maintenu par un micromanipulateur.
   3. Lors de la visualisation à travers l’objectif 4x, utilisez un micromanipulateur pour positionner soigneusement la pointe de l’électrode pointue juste au-dessus d’une cellule du tube endothélial artériolaire dans le PSS qui coule dans la chambre.
   4. Augmentez progressivement le grossissement à 400x et repositionnez la pointe de l’électrode au besoin.
   5. À l’aide du micromanipulateur, insérez doucement la pointe d’une électrode tranchante dans l’une des cellules du tube endothélial et commencez à enregistrer V_m à l’aide d’un électromètre (Figure 4A).
   6. Une fois que le V_m au repos endothélial est stable (−30 à −40 mV), appliquer les agents pharmacologiques souhaités par objectif expérimental (figure 4C).

6. Imagerie cellulaire

REMARQUE: Les tubes endothéliaux fixés dans la chambre de la plate-forme mobile peuvent également être utilisés pour l’imagerie microscopique dans des conditions réelles et fixes¹⁹ en utilisant la fluorescence standard ou la microscopie confocale. L’immunohistochimie avec différents anticorps pour les récepteurs et les canaux ioniques peut également être appliquée comme décrit précédemment²⁰.

1. Chargez le tube endothélial avec le traceur de fluorescence pour la membrane plasmique ou l’organite souhaité (par exemple, noyau, réticulum endoplasmique) à 37 °C pendant 15-30 min.
2. Lavez les cellules avec de la superfusion PSS fraîche et imagez les cellules vivantes au microscope à la longueur d’onde d’excitation des colorants respectifs (Figure 4D, E).
   REMARQUE: L’immunohistochimie peut être effectuée sur ce modèle de tube en utilisant des anticorps d’intérêt.

Résultats

Une démonstration du protocole est illustrée à la figure 1 avec les étapes de dissection artériolaire et d’isolation du tube endothélial comme la figure 2 et la figure 3, respectivement. Ici, la fonction endothéliale a été évaluée en mesurant [Ca²⁺]_i et V_m à l’aide de la photométrie Fura-2 et de l’électrophysiologie à électrode pointue (Figure 4A) e...

Discussion

De plus en plus de preuves suggèrent que les maladies cérébrovasculaires (MCV), le vieillissement et la maladie d’Alzheimer sont fortement corrélés et constituent un sujet actuel de recherche sur la démence ^4,8,14,21. Ainsi, il est évident que les études du réseau cérébrovasculaire auraient un large impact sur la santé tout en nécessitant une enquête approfondie et continue pend...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Audible baseline monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Bath Chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicate glass capillaries (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate glass capillaries (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicate glass capillaries (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: Bovine Serum Albumin	Sigma	A7906
CaCl2: Calcium Chloride	Sigma	223506
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Cover Glass (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissection Dish (Glass Petri with Charcoal Sylgard bottom)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (porcine pancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmic Reticulum Tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamide)	ThermoFisher Scientific	E34250
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescence system interface, ARC lamp & power supply, hyperswitch and PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Forceps (Fine-tipped, sharpened)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Function Generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: Hydrochloric Acid	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: Potassium Chloride	Sigma	P9541
MgCl2: Magnesium Chloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipette puller (digital)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscope (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscope objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) and 40X (Plan Fluor)
Microscope platform (anodized aluminum; diameter, 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pump Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-Methylthioadenosine diphosphate trisodium salt	Tocris	1624
NaCl: Sodium Chloride	Sigma	S7653
NaOH: Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Nuclear Stain (NucBlue Live ReadyProbes Reagent; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papain	Sigma	P4762
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasma Membrane Stain (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scissors (3 mm & 7 mm blades)	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scissors (Vannas style; 9.5 mm & 3 mm blades)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Syringe filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperature Controller (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B or C
Valve Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibration Isolation Table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g