الحمل الزائد لحجم القلب الناجم جراحيا عن طريق قلس الأبهر في الفأر

Summary

يقدم هذا البروتوكول دليلا عمليا حول جراحة إنشاء قلس الأبهر (AR) في الفأر. يلخص تقييم فأر الواقع المعزز عن طريق تخطيط صدى القلب وقياس ديناميكا الدم الغازية خصائصه ذات الصلة سريريا المتمثل في تضخم غريب الأطوار الناجم عن الحمل الزائد للحجم ، مما يشير إلى تطبيقه الواعد في دراسة تضخم القلب.

Abstract

قلس الأبهر (AR) هو مرض صمامي شائع في القلب يمارس حمولة زائدة على القلب ويمثل مشكلة صحية عامة عالمية. على الرغم من أن الفئران يتم تطبيقها على نطاق واسع لتسليط الضوء على آليات أمراض القلب والأوعية الدموية ، إلا أن نماذج الفئران من الواقع المعزز ، خاصة تلك التي تسببها الجراحة ، لا تزال نادرة. هنا ، تم وصف نموذج فأر من AR بالتفصيل والذي يتم إحداثه جراحيا عن طريق اضطراب الصمامات الأبهرية تحت تخطيط صدى القلب عالي الدقة. وفقا لتدفق الدم المتقيأ ، تقدم قلوب الفئران AR نمطا ظاهريا مميزا ومناسبا سريريا للحجم الزائد ، والذي يتميز بتضخم غريب الأطوار وخلل وظيفي في القلب ، كما يتضح من تخطيط صدى القلب والتقييم الديناميكي الدموي الغازي. يوفر اقتراحنا ، بطريقة موثوقة وقابلة للتكرار ، دليلا عمليا حول إنشاء وتقييم نموذج فأر للواقع المعزز للدراسات المستقبلية حول الآليات الجزيئية والأهداف العلاجية لاعتلال عضلة القلب الزائد في الحجم.

Introduction

في حالة وجود زيادة في الحجم الزائد (التحميل المسبق) أو الحمل الزائد للضغط (الحمل اللاحق) ، يخضع القلب للتضخم ، وهي حالة تسمى التضخم. على الرغم من أن تضخم القلب هو استجابة تعويضية للحفاظ على نضح الأعضاء الطرفية قبل فشل القلب ، إلا أنه أيضا عامل خطر مستقل لأحداث القلب والأوعية الدموية الكبرى^1،2. يعد الحمل الزائد للحجم أحد المظاهر المهمة لزيادة الإجهاد الميكانيكي. يحدث الحمل الزائد للحجم أثناء الانبساط القلبي ويؤدي إلى تضخم القلب غريب الأطوار ، والذي لا يظهر فقط في أمراض الصمامات ، مثل قلس الأبهر وقلس التاجي ، ولكن أيضا في أمراض القلب المرتفعة في المرحلة النهائية ، واحتشاء عضلة القلب ، واعتلال عضلة القلب التوسعي ، والإفراط في ممارسة الرياضة. بالإضافة إلى ذلك ، في الممارسة السريرية ، فإن بعض الأدوية التي يمكن أن تقلل بشكل أفضل من تضخم عضلة القلب الناجم عن الحمل الزائد للضغط لها تأثيرات غير مرضية في علاج تضخم عضلة القلب الناجم عن الحمل الزائد للحجم¹. لذلك من الأهمية بمكان اكتشاف آلية وطرق التدخل لإعادة تشكيل القلب غريب الأطوار الناجم عن الحمل الزائد للحجم. ومع ذلك ، فقد تم إعاقة مثل هذه الأبحاث حول الحمل الزائد للحجم بشكل كبير لفترة طويلة ، والتي يمكن أن تعزى ، إلى حد كبير ، إلى الافتقار إلى نماذج الصغيرة التي يمكن تشغيلها بسهولة ، وقياسها كميا بكفاءة ، وتكرارها بثبات³.

أما بالنسبة لأنواع الصغيرة ، فقد أصبحت الفئران النموذجي السائد لأبحاث أمراض القلب والأوعية الدموية نظرا لدورة حياتها القصيرة ، وتشغيلها المريح ، والجينوم الواضح ، وسهولة التعديل الجيني⁴. من حيث فئات النماذج ، مقارنة بنماذج التعديل الجيني والنماذج المعالجة بالأدوية ، تتمتع النماذج الجراحية بمزايا فريدة واضحة. يمكن للنموذج الجراحي تجنب تربية الفئران المفرطة والشاقة وتحديد الجينات الضرورية لنموذج التعديل الجيني ويمكنه أيضا تجنب التأثيرات غير المحددة على الأنسجة والأعضاء خارج القلب التي يصعب التحكم فيها في النماذج المعالجة بالأدوية. تم توثيق نموذج الفأر لتحويلة الشريان الأورطي للحث على زيادة حجم القلب في الأدبيات السابقة⁵. ومع ذلك ، فإن تحويلة الشريان الأورطي تمثل جزءا صغيرا من تضخم القلب غريب الأطوار في العيادة وتسبب الحمل الزائد ثنائي البطين⁵ ، مما يجعله ذا أهمية انتقالية ضئيلة لاستخدامه في دراسة تضخم البطين الأيسر غريب الأطوار. ومع ذلك ، فإن أمراض القلب الصمامية تمثل مشكلة صحية عامة رئيسية في جميع أنحاء العالم. تشير التقديرات إلى أن حوالي 15٪ من السكان الذين تبلغ أعمارهم >75 عاما يعانون من اضطراب صمامي^{كبير 6}. على الرغم من أن قلس الأبهر (AR) يحتل جزءا من أمراض القلب الصمامية ، إلا أنه يسبب بشكل مميز تضخم البطين الأيسر غريب الأطوار (LV) بسبب زيادة الحمل الزائد في الحجم عن طريق تدفق الدم القلس^7،8. بالنظر إلى أن الشريان السباتي المشترك الأيمن (RCCA) يوفر طريقا للوصول إلى موقع الصمامات الأبهرية ، فمن المثير للاهتمام من الناحية المفاهيمية تعطيل الصمامات الأبهرية عبر RCCA لإحداث تدفق دم قاسي في الفئران. مستوحاة من تقنيات إنشاء تدفق الأبهر المتذبذب⁹ ، تم إنشاء نموذج فأر لقلس الأبهر (AR) مؤخرا في مختبرنا للحث جراحيا على زيادة الحجم⁷. يوضح هذا الفأر الواقع المعزز تضخم غريب الأطوار LV الواضح ، وهو نهج تحويلي سريريا ويوضح إمكانات انتقالية كبيرة لدراسة النمط الظاهري للقلب المثقل وآليته الأساسية. هنا ، تم وصف إجراء مفصل خطوة بخطوة لإجراء جراحة الواقع المعزز في الفئران ، تم تلخيصه بواسطة تخطيط صدى القلب عالي التردد وديناميكا الدم الغازية لضمان نجاح الجراحة (الشكل 1).

Protocol

حصل هذا البروتوكول على موافقة أخلاقية من لجنة رعاية واستخدامه في مستشفى تشونغشان بجامعة فودان ، ويتبع توصيات دليل رعاية واستخدام المختبر (رقم 85-23 ، تمت مراجعته 2011 ؛ المعاهد الوطنية للصحة ، بيثيسدا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية).

ملاحظة: أجريت تجارب على على ذكور الفئران C57BL / 6J > عمر 10 أسابيع. يجب أن يكون الجراح في هذا البروتوكول ماهرا في التلاعب بتخطيط صدى القلب في الفئران ، قبل إجراء عملية الواقع المعزز في الفأر. ومع ذلك ، في معظم المؤسسات البحثية ، يتم تشغيل تخطيط صدى القلب للقوارض الصغيرة بواسطة منشأة أساسية ، لذلك يمكن للجراح التعاون عن كثب مع الخبراء الأساسيين ، إن لم يكن جراحا متمرسا في تخطيط صدى القلب. تجربة قياس ديناميكا الدم الغازية في الفأر ميزة إضافية.

1. التحضير للتصوير بالموجات فوق الصوتية (إلزامي) وقياس ديناميكا الدم الغازي (اختياري)

1. ابدأ تشغيل جهاز الموجات فوق الصوتية المتصل بمسبار 30 ميجاهرتز. اضبط منصة الموجات فوق الصوتية التي يتم التحكم في درجة حرارتها في وضع عرض قوس الأبهر ، حيث يتم إمالة الجانب الأيمن من الماوس لأعلى.
   ملاحظة: يوصى بوضع الطرف الجمجفي لمنصة الموجات فوق الصوتية باتجاه الجراح. ومع ذلك ، يجب أن يعتمد ما إذا كانت نهاية الجمجمة أو النهاية الذيلية تجاه الجراح على أيهما يشعر الجراح براحة أكبر معه.
2. قم بتوصيل مقياس الضغط الصغير (قسطرة الضغط) بجهاز الحصول على البيانات والمحول التناظري / الرقمي. اغمر كوفيت معايرة الميكرومانومتر في محلول ملحي لمعايرة المحلول الملحي.
   ملاحظة: إذا سمحت الحالة بذلك ، يمكن أيضا استخدام قسطرة حجم الضغط. نستخدم قسطرة الضغط لأن جهاز الحصول على بيانات الضغط في المختبر يجمع بيانات الضغط فقط وليس لديه القدرة على جمع البيانات المتعلقة بالحجم ، على الرغم من أن نتائج تخطيط صدى القلب في الدراسة الحالية يمكن أن تحدد أيضا أحجام الجهد المنخفض.

2. تخدير الفئران وإعداد الأجهزة الجراحية وعزل RCCA

ملاحظة: يجب تعقيم الأدوات الجراحية وتعقيمها قبل الاستخدام. يوصى بتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة. يوصى أيضا بإجراء إزالة الشعر قبل يوم واحد لتوفير الوقت أثناء إجراء التصوير ، وتقليل استجابات الإجهاد غير المرغوب فيها المحتملة في الفئران ، والحفاظ على نظافة وجفاف الصدر والأطراف.

1. قم بتخدير الفأر في حجرة الحث ، والتي يتم توصيلها بجهاز مبخر مضبوطة على 4٪ من الأيزوفلوران الممزوج ب 0.8 لتر / دقيقة من الأكسجين. عندما ينام الماوس أو يختفي منعكس قرصة الذيل ، أخرج من غرفة الحث.
2. ضع في وضع ضعيف على صفيحة نحاسية يتم تسخينها بواسطة وسادة تدفئة. قم بتوصيل أنفه بمخروط الأنف ، حيث يتم توصيل 1.5٪ من الأيزوفلوران الممزوج ب 0.8 لتر / دقيقة من الأكسجين للحفاظ على مستوى ثابت من التخدير.
   ملاحظة: يوصى باستخدام صفيحة نحاسية لأنها ملائمة للتنظيف ومقاومة للصدأ ، على الرغم من أنه يمكن استبدالها بنوع آخر من الألواح المعدنية.
3. ضع مرهم العين على العينين لمنع الجفاف تحت التخدير ولصق الأطراف على الصفيحة النحاسية. قم بإزالة الشعر من الرقبة والصدر باستخدام كريم إزالة الشعر وتنظيف المنطقة منزوعة الشعر بنسبة 75٪ من الإيثانول.
4. قم بإعداد الأدوات الجراحية اللازمة ، بما في ذلك الملقط والمقصات المختلفة (الشكل 2 أ ؛ انظر جدول المواد).
5. قم بعمل شق متوسط طولي ، حوالي 1 سم ، في الرقبة باستخدام ملقط إبهام منحني ومقص مستقيم ، بين الفك السفلي والقص.
6. قم بتشريح الجزء الأيسر والأيمن من الغدة الدرقية بصراحة باستخدام زوجين من الملقط. باستخدام ملقط الإبهام الناعم المنحني ، افصل العضلة الجذعية والأنسجة الدهنية في المنطقة المجاورة للقصبة الهوائية اليمنى لفضح RCCA لأطول فترة ممكنة. تجنب إصابة العصب المبهم في جميع الأوقات ، حيث يمكن أن يسبب ذلك انخفاض ضغط الدم وبطء القلب والموت (الشكل 2 ب).

3. القسطرة من خلال RCCA والشريان الأورطي الصاعد تحت إشراف الموجات فوق الصوتية

1. مرر خيطين من الحرير 6-0 ، حوالي 5 سم لكل منهما ، تحت الإناء. اربط RCCA البعيدة بعقدة ضيقة باستخدام خيط واحد وقم بتثبيت طرفي العقدة الضيقة بجوار رأس للحفاظ على التوتر الخفيف على RCCA. سيسهل هذا الإجراء القسطرة في الخطوات القادمة.
2. ضع عقدة فضفاضة على RCCA القريب باستخدام الخيط الثاني. هذا يملأ المنطقة المغلقة من RCCA بالدم ، مما يسهل شقها.
3. استخدم مقصا صغيرا لقطع فتحة على شكل إسفين ، 1-2 مم قريبة من العقدة الضيقة ، لفتح RCCA. تأكد من أن حجم الشق ليس صغيرا جدا بحيث لا يمكن إدخال قسطرة ، ولا كبير جدا بحيث لا ينكسر أثناء الإدخال.
   ملاحظة: يوصى بشدة بالشق تحت المجهر. يعد ثقب ثقب ثقب صغير في الوعاء بإبرة 26 جم طريقة بديلة.
4. قم بإعداد قسطرة بلاستيكية تحتوي على سلك معدني (الشكل 2 ج). قم بتمديد الشق باستخدام ملقط ربط منحني طويل اليد ، وأدخل القسطرة البلاستيكية التي تحتوي على السلك المعدني في RCCA ، وتحرك للأمام إلى العقدة السائبة.
5. قم بتخفيف العقدة السائبة لدفع القسطرة والأسلاك حوالي 2 سم. انقل الصفيحة النحاسية التي تحتوي على إلى منصة الموجات فوق الصوتية ، وقم بتطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على عنق الفأر وصدره ، ثم قم بإعادة توجيه القسطرة والأسلاك بعناية عبر RCCA والشريان الأورطي الصاعد تحت توجيه الموجات فوق الصوتية.

4. ثقب الصمامات الأبهرية تحت توجيه الموجات فوق الصوتية

1. اجمع بيانات الموجات فوق الصوتية القاعدية في وضع دوبلر الملون ووضع دوبلر الموجة النبضية قبل أن تصل القسطرة البلاستيكية والسلك المعدني إلى فتحة الأبهر.
2. مع الموجات فوق الصوتية التي تظهر في وقت واحد وبوضوح الشريان الأورطي الصاعد ، ومسار التدفق المنخفض ، والقسطرة ، والسلك ، عندما تصل القسطرة والسلك إلى فتحة الأبهر ، يبرز طرف السلك من القسطرة ، وثقب الصمامات الأبهرية (الشكل 1).
   ملاحظة: عندما يكون الصمام الأبهري مثقوبا ، يجب أن يكون الجراح قادرا على الشعور بهذا الكسر.
3. اسحب القسطرة والسلك قليلا من فتحة الأبهر واجمع بيانات الموجات فوق الصوتية بعد الانثقاب في وضع دوبلر الملون ووضع دوبلر الموجة النبضية بعد ثقب الصمامات الأبهري. يكون تدفق القلس أحمر اللون أثناء الانبساط القلبي في وضع دوبلر الملون ويمكن تأكيده كميا في وضع دوبلر الموجة النبضية.
4. ضع في اعتبارك أن السرعة القصوى للتدفق الانبساطي (PSVa) بين 300-500 مم / ثانية مرضية. إذا كانت درجة القلس في تدفق الدم غير مرضية، فكرر الخطوة 4.2.
5. اختياري: ضع مقياس ضغط صغير قبل ثقب الصمامات الأبهرية وبعدها مباشرة لتأكيد وجود تدفق القلس. للتحقق ، يتم انخفاض ضغط نهاية الأبهر الانبساطي (AEDP) ، ويتم تعزيز ضغط النبض الأبهري بحوالي 20 مم زئبق.
   ملاحظة: تم تقديم وصف مفصل لكيفية استخدام قسطرة مقياس الضغط الصغير لإجراء قياس ديناميكية الدم الغازية LV بأناقة في مكان آخر^10،11.

5. سحب القسطرة البلاستيكية والأسلاك المعدنية ، والرعاية المحيطة بالجراحة

1. قم بإزالة جل الموجات فوق الصوتية وجفف الماوس بشاش أو منديل معقم بعد التأكد من الثقب الناجح للصمامات الأبهرية ، ثم اسحب القسطرة البلاستيكية بعناية باستخدام السلك المعدني المركزي ، قبل ربط RCCA.
2. أغلق الجلد باستخدام خياطة حريرية 5-0 بنمط خياطة مستمر وقم بتطبيق محلول بوفيدون اليود على موقع الخياطة. قم بتطبيق الفأر مع ميلوكسيكام (0.13 مجم) تحت الجلد لعلاج التسكين ووضع الفأر في قفص دافئ مسبقا تحت ضوء دافئ حتى يستيقظ تماما للشفاء.

6. جراحة الشام

1. قم بتنفيذ الأقسام 1-3 كما هو موضح. بالنسبة للماوس الذي يتم تشغيله بالفأر الوهمي ، قم بإجراء إجراءات مماثلة كما في القسم 4 دون تعطيل الصمامات الأبهري.
2. قم بتنفيذ القسم 5 كما هو موضح ، على الرغم من أن الواقع المعزز لا ينبغي أن يكون موجودا في أي من الفئران التي يتم تشغيلها بشكل زائف.

7. تقييم ثقب الصمام الأبهري ومورفولوجيا القلب ووظيفته باستخدام تخطيط صدى القلب وقياس ديناميكا الدم الغازية

1. بعد 4 أسابيع من الواقع المعزز ، استخدم الوضع B لمخطط صدى القلب ، ووضع دوبلر الملون ، ووضع دوبلر الموجة النبضية لتقييم تدفق الدم في قوس الأبهر في عرض قوس الأبهر ، وقياس PDVa ، وفقا للخطوة 4.1 وفي أماكن أخرى^1،12.
2. استخدم تخطيط صدى القلب الوضع B والوضع M لتقييم أبعاد الجهد المنخفض والانقباض في عرض المحور الطويل للقص ، مع أبعاد الانبساطي النهائي LV (LVEDD) والانقباضي النهائي (LVESD) ، وسمك نهاية الجدار الخلفي (LVPWTd) والانقباضي النهائي (LVPWTs) ، وكسر طرد LV (LVEF) ، والتقصير الجزئي (LVFS) مشتقة.
   ملاحظة: تم وصف وصف مفصل لكيفية استخدام جهاز الموجات فوق الصوتية والتلاعب بطرق عرض الموجات فوق الصوتية بأناقة^{سابقا 12}.
3. بعد تصوير تخطيط صدى القلب ، قم بإجراء قياس ديناميكا الدم الغازية ، بطريقة مشابهة للخطوة 4.3 وفي أي مكان^{آخر 10}. سجل سرعة الانكماش والاسترخاء القصوى (+ dp / dt و −dp / dt). أدخل مقياس الضغط الصغير في الشريان السباتي المشترك الأيسر (LCCA ، وليس RCCA) ، حيث تم ربط RCCA بشكل دائم أثناء جراحة AR.
4. بعد قياس ديناميكا الدم الغازية ، قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم. افتح الصدر ، واغسل القلب ب 10٪ فورمالين ، متبوعا بمحلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ ، واستئصال القلب عن طريق قطع الشريان الأورطي ، وقم بتقطيعه بشكل عرضي على مستوى الهامش السفلي للأذن الأيسر. الحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري الضوئي.

النتائج

لضمان نجاح الواقع المعزز ، قمنا بالتحقق من تدفق الدم القلس باستخدام دوبلر الملون وتخطيط صدى القلب دوبلر بالموجة النبضية. في الفئران المصابة بالواقع المعزز ، أظهر طيف دوبلر الملون لقوس الأبهر تدفقا قاسيا (أحمر) بعد العملية مباشرة ، والذي كان غائبا في الفئران الزائفة (لا ي...

Discussion

يعد الحث الجراحي للواقع المعزز في الفأر تقنية جديدة صعبة من الناحية الفنية ولكن لها أهمية انتقالية كبيرة. لإتقان هذه التقنية ، يجب أن يكون الجراح على الأقل على دراية مسبقا بتشريح عنق الرحم والقلب للفئران ، والتعامل مع الفئران ، وتخطيط صدى القلب. يعد التشغيل الماهر في قيا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia