Sobrecarga de volume cardíaco induzida cirurgicamente por insuficiência aórtica em camundongos

Resumo

Este protocolo apresenta um guia prático sobre a cirurgia para criação de regurgitação aórtica (RA) no camundongo. A avaliação do camundongo AR por ecocardiografia e medição hemodinâmica invasiva recapitula suas características clinicamente relevantes de hipertrofia excêntrica induzida por sobrecarga de volume, sugerindo sua aplicação promissora no estudo da hipertrofia cardíaca.

Resumo

A regurgitação aórtica (RA) é uma valvopatia comum que exerce sobrecarga de volume sobre o coração e representa um problema de saúde pública mundial. Embora os camundongos sejam amplamente aplicados para lançar luz sobre os mecanismos da doença cardiovascular, os modelos de camundongos de RA, especialmente aqueles induzidos por cirurgia, ainda são escassos. Aqui, um modelo de camundongo de RA foi descrito em detalhes, que é induzido cirurgicamente pela ruptura das válvulas aórticas sob ecocardiografia de alta resolução. De acordo com o fluxo sanguíneo regurgitado, os corações de camundongos AR apresentam um fenótipo de sobrecarga de volume distinto e clinicamente relevante, caracterizado por hipertrofia excêntrica e disfunção cardíaca, conforme evidenciado pela avaliação ecocardiográfica e hemodinâmica invasiva. Nossa proposta, de forma confiável e reprodutível, fornece um guia prático sobre o estabelecimento e avaliação de um modelo de RA em camundongos para futuros estudos sobre mecanismos moleculares e alvos terapêuticos da cardiomiopatia por sobrecarga de volume.

Introdução

Na presença de aumento da sobrecarga de volume (pré-carga) ou sobrecarga de pressão (pós-carga), o coração sofre aumento, uma condição denominada hipertrofia. Embora a hipertrofia cardíaca seja uma resposta compensatória para manter a perfusão de órgãos periféricos antes da insuficiência cardíaca, ela também é um fator de risco independente para eventos cardiovasculares maiores ^1,2. A sobrecarga de volume é uma das manifestações importantes do aumento do estresse mecânico. A sobrecarga de volume ocorre durante a diástole cardíaca e induz hipertrofia cardíaca excêntrica, que não é comumente observada apenas em doenças valvares, como regurgitação aórtica e insuficiência mitral, mas também em cardiopatias hipertensivas em estágio terminal, infarto do miocárdio, cardiomiopatia dilatada e exercício excessivo. Além disso, na prática clínica, algumas drogas que podem reduzir melhor a hipertrofia miocárdica induzida pela sobrecarga pressórica têm efeitos insatisfatórios no tratamento da hipertrofia miocárdica induzida pela sobrecarga de volume¹. Portanto, é de grande importância descobrir o mecanismo e os métodos de intervenção do remodelamento cardíaco excêntrico causado pela sobrecarga de volume. No entanto, essa pesquisa sobre sobrecarga de volume tem sido significativamente dificultada por um longo tempo, o que pode ser, em grande parte, atribuído à falta de modelos de pequenos animais que possam ser facilmente operados, quantificados de forma eficiente e replicados de forma estável³.

Quanto às espécies de pequenos animais, os camundongos se tornaram o principal modelo animal para pesquisa de doenças cardiovasculares devido ao seu ciclo de vida curto, operação conveniente, genoma claro e facilidade de modificação genética⁴. Em termos de categorias de modelos, em comparação com modelos de modificação genética e modelos tratados com medicamentos, os modelos cirúrgicos têm vantagens únicas óbvias. O modelo cirúrgico pode evitar a criação excessiva e trabalhosa de camundongos e a identificação de genes que são necessários para o modelo de modificação genética e também pode evitar os efeitos inespecíficos em tecidos e órgãos extracardíacos que são difíceis de controlar em modelos tratados com drogas. O modelo de camundongo de shunt aortocava foi documentado como indutor de sobrecarga de volume cardíaco na literatura anterior⁵. No entanto, o shunt aortocava é responsável por uma pequena fração da hipertrofia excêntrica cardíaca na clínica e causa sobrecarga biventricular⁵, tornando-o de pouca importância translacional para ser usado no estudo da hipertrofia excêntrica do ventrículo esquerdo. No entanto, a valvopatia representa um importante problema de saúde pública em todo o mundo; Estima-se que cerca de 15% da população >75 anos de idade apresente distúrbio valvar significativo⁶. Embora a regurgitação aórtica (RA) ocupe uma parcela da valvopatia cardíaca, ela causa hipertrofia excêntrica do ventrículo esquerdo (VE) devido ao aumento da sobrecarga de volume pelo fluxo sanguíneo regurgitante ^7,8. Considerando que a artéria carótida comum direita (ACRC) fornece uma rota para chegar à localização das válvulas aórticas, é conceitualmente intrigante interromper as válvulas aórticas através da ACDC para causar fluxo sanguíneo regurgitante em camundongos. Inspirado nas técnicas de criação de fluxo aórtico oscilante⁹, um modelo de regurgitação aórtica (RA) em camundongos foi recentemente estabelecido em nosso laboratório para induzir cirurgicamente a sobrecarga de volume⁷. Este camundongo AR demonstra hipertrofia excêntrica LV óbvia, que é uma abordagem clinicamente transformadora e demonstra um grande potencial translacional para estudar o fenótipo cardíaco sobrecarregado e seu mecanismo subjacente. Aqui, um procedimento passo a passo detalhado foi descrito para realizar a cirurgia de RA em camundongos, recapitulado por ecocardiografia de alta frequência e hemodinâmica invasiva para garantir o sucesso da cirurgia (Figura 1).

Protocolo

Este protocolo recebeu aprovação ética do Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Zhongshan, Universidade de Fudan, e segue as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (nº 85-23, revisado em 2011; Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, MD, EUA).

NOTA: Experimentos em animais foram realizados em camundongos C57BL / 6J machos >10 semanas de idade. O cirurgião neste protocolo deve ser hábil na manipulação da ecocardiografia murina, antes de realizar a operação de RA no camundongo. No entanto, na maioria das instituições de pesquisa, a ecocardiografia de pequenos roedores é operada por uma instalação central, de modo que o cirurgião pode colaborar estreitamente com os principais especialistas, se não um cirurgião experiente em ecocardiografia. A experiência de medidas hemodinâmicas invasivas em camundongos é uma vantagem.

1. Preparação para imagens de ultrassom (obrigatória) e medição hemodinâmica invasiva (opcional)

1. Ligue a máquina de ultrassom conectada a uma sonda de 30 MHz. Coloque a plataforma animal de ultrassom com temperatura controlada na posição para a vista do arco aórtico, na qual o lado direito do mouse está inclinado para cima.
   NOTA: Recomenda-se que a extremidade cranial da plataforma animal de ultrassom seja colocada em direção ao cirurgião. No entanto, se a extremidade cranial ou caudal está voltada para o cirurgião deve depender de qual deles o cirurgião se sente mais confortável.
2. Conecte um micromanômetro (cateter de pressão) ao dispositivo de aquisição de dados e ao conversor analógico/digital. Mergulhe a cubeta de calibração do micromanômetro em solução salina para calibração salina.
   NOTA: Se a condição permitir, um cateter de pressão de volume também pode ser usado. Usamos um cateter de pressão porque o dispositivo de aquisição de dados de pressão no laboratório coleta dados apenas de pressão e não tem capacidade para coletar dados relacionados ao volume, embora os resultados ecocardiográficos no estudo atual também possam delinear os volumes do VE.

2. Anestesia de camundongos, preparação de dispositivos cirúrgicos e isolamento do RCCA

NOTA: As ferramentas cirúrgicas devem ser esterilizadas e autoclavadas antes do uso. Recomenda-se que todas as etapas sejam executadas em condições assépticas. Também é recomendado que a depilação seja realizada com 1 dia de antecedência para economizar tempo durante o procedimento de imagem, minimizar possíveis respostas indesejadas ao estresse nos camundongos e manter o tórax e as extremidades limpos e secos.

1. Anestesiar o camundongo na câmara de indução, que é conectada a um vaporizador ajustado para isoflurano a 4% misturado com 0,8 L/min de oxigênio. Quando o camundongo adormecer ou o reflexo de pinça da cauda desaparecer, remova o animal da câmara de indução.
2. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma placa de cobre, que é aquecida por uma almofada de aquecimento. Conecte seu nariz a um nariz, ao qual 1,5% de isoflurano misturado com 0,8 L/min de oxigênio é fornecido para manter um nível constante de anestesia.
   NOTA: Uma placa de cobre é recomendada, pois é conveniente de limpar e é à prova de ferrugem, embora possa ser substituída por outro tipo de placa de metal.
3. Coloque pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento sob anestesia e prenda as extremidades na placa de cobre. Retire os pelos do pescoço e do peito com creme depilatório e limpe a área depilada com etanol 75%.
4. Prepare as ferramentas cirúrgicas necessárias, incluindo várias pinças e tesouras (Figura 2A; ver Tabela de Materiais).
5. Faça uma incisão mediana longitudinal, com cerca de 1 cm, no pescoço com pinça de polegar curvo e tesoura reta, entre o maxilar inferior e o esterno.
6. Disseque sem rodeios a parte esquerda e direita da glândula tireoide usando dois pares de pinças. Com a pinça curva fina do polegar, separe o músculo stemo-hioideus e o tecido adiposo na região paratraqueal direita para expor a ACDC pelo maior tempo possível. Evite lesões do nervo vago em todos os momentos, pois isso pode causar hipotensão, bradicardia e morte (Figura 2B).

3. Cateterismo através da ACDC e aorta ascendente sob orientação ultrassonográfica

1. Passe dois fios de seda 6-0, com cerca de 5 cm cada, por baixo do recipiente. Ligue o RCCA distal com um nó apertado usando um fio e fixe as duas extremidades do nó apertado próximo à cabeça do animal para manter uma leve tensão no RCCA. Essa ação facilitará o cateterismo nas próximas etapas.
2. Faça um nó solto na ACDC proximal usando o segundo fio. Isso preenche a região selada do RCCA com sangue, facilitando a incisão.
3. Use uma tesoura pequena para cortar uma abertura em forma de cunha, 1-2 mm proximal ao nó apertado, para abrir o RCCA. Certifique-se de que o tamanho da incisão não seja muito pequeno para inserir um cateter, nem muito grande para que ele se quebre durante a inserção.
   NOTA: A incisão ao microscópio é altamente recomendada. Perfurar um pequeno orifício no vaso com uma agulha de 26 G é um método alternativo.
4. Prepare um cateter de plástico contendo um fio de metal (Figura 2C). Estique a incisão com uma pinça de amarração curva de mão longa, insira o cateter de plástico contendo o fio de metal no RCCA e avance para o nó solto.
5. Alivie o nó solto para avançar o cateter e o fio em torno de 2 cm. Transfira a placa de cobre contendo o animal para a plataforma do animal de ultrassom, aplique gel de ultrassom no pescoço e no tórax do camundongo e, em seguida, encaminhe cuidadosamente o cateter e o fio através do RCCA e da aorta ascendente sob orientação de ultrassom.

4. Punção das valvas aórticas guiadas por ultrassom

1. Colete dados de ultrassom basal no modo Doppler colorido e no modo Doppler de onda de pulso antes que o cateter de plástico e o fio de metal atinjam o orifício aórtico.
2. Com o ultrassom mostrando simultânea e claramente a aorta ascendente, a via de saída do VE, o cateter e o fio, quando o cateter e o fio atingem o orifício aórtico, projetam a ponta do fio do cateter e puncionam as valvas aórticas (Figura 1).
   NOTA: Quando a válvula aórtica é perfurada, o cirurgião deve ser capaz de sentir essa ruptura.
3. Afaste ligeiramente o cateter e o fio do orifício aórtico e colete dados de ultrassom pós-perfuração no modo Doppler colorido e no modo Doppler de onda de pulso após a punção das válvulas aórticas. O fluxo regurgitante é de cor vermelha durante a diástole cardíaca no modo Doppler colorido e pode ser confirmado quantitativamente no modo Doppler de onda de pulso.
4. Considere satisfatório um pico de velocidade diastólica do fluxo aórtico (PSVa) entre 300-500 mm/s. Se o grau regurgitante do fluxo sanguíneo for insatisfatório, repita a etapa 4.2.
5. Opcional: Aplique um micromanômetro antes e imediatamente após a perfuração das válvulas aórticas para confirmar ainda mais a existência de fluxo regurgitante. Para verificar, tanto a pressão diastólica final da aorta (PEAE) é reduzida quanto a pressão de pulso aórtica é aumentada em cerca de 20 mmHg.
   NOTA: Uma descrição detalhada de como usar um cateter micromanômetro para realizar a medida hemodinâmica invasiva do VE foi elegantemente apresentada em outro lugar^10,11.

5. Retirada do cateter plástico e fio metálico e cuidados perioperatórios

1. Remova o gel de ultrassom e seque o camundongo com gaze ou tecido estéril após a confirmação da perfuração bem-sucedida das válvulas aórticas e, em seguida, retire cuidadosamente o cateter plástico com o fio metálico central, antes da ligadura do RCCA.
2. Feche a pele usando uma sutura de seda 5-0 em um padrão de sutura contínua e aplique solução de iodopovidona no local da sutura. Administre o camundongo com meloxicam (0,13 mg) por via subcutânea para analgesia e coloque o camundongo em uma gaiola pré-aquecida sob uma luz quente até que esteja totalmente acordado para recuperação.

6. Cirurgia simulada

1. Execute as seções 1-3 conforme descrito. Para o camundongo operado simuladamente, execute procedimentos semelhantes aos da seção 4 sem ruptura das válvulas aórticas.
2. Execute a seção 5 conforme descrito, embora o AR não deva estar presente em nenhum dos camundongos operados simuladamente.

7. Avaliação da perfuração da valva aórtica, morfologia e função cardíaca por meio de ecocardiografia e medição hemodinâmica invasiva

1. Após 4 semanas de RA, usar o modo B ecocardiográfico, o modo Doppler colorido e o modo Doppler de onda de pulso para avaliar o fluxo sanguíneo do arco aórtico na incidência do arco aórtico e medir a PDVa, de acordo com o passo 4.1 e outros ^1,12.
2. Use o modo B e o modo M ecocardiográficos para avaliar a dimensão e a contratilidade do VE na incidência do eixo longo paraesternal, com as dimensões diastólica final (DDVE) e sistólica final (DSVE), espessura diastólica final da parede posterior do VE (TPVEd) e sistólica final (TPVE), fração de ejeção do VE (FEVE) e encurtamento fracionado (SVFVE) derivadas.
   NOTA: Uma descrição detalhada de como usar a máquina de ultrassom e manipulação de incidências de ultrassom foi elegantemente descrita anteriormente¹².
3. Após a imagem ecocardiográfica, realizar a medida hemodinâmica invasiva, de maneira semelhante ao passo 4.3 e em outros^{lugares 10}. Registre a contração máxima e a velocidade de relaxamento (+dp/dt e −dp/dt). Insira o micromanômetro na artéria carótida comum esquerda (ACCE, não ACD), uma vez que a ACDC foi permanentemente ligada durante a cirurgia de RA.
4. Após a medição hemodinâmica invasiva, eutanasiar o camundongo por luxação cervical. Abra o tórax, lave o coração com formalina a 10%, seguida de solução de cloreto de sódio a 0,9%, excise o coração cortando a aorta e corte transversalmente ao nível da margem inferior da aurícula esquerda. Adquira imagens usando microscopia de luz.

Resultados

Para garantir o sucesso da RA, validamos o fluxo sanguíneo regurgitante usando Doppler colorido e ecocardiografia com Doppler de onda de pulso. Em camundongos com RA, o espectro Doppler colorido do arco aórtico mostrou fluxo regurgitante (vermelho) imediatamente após a operação, que estava ausente em camundongos simulados (sem fluxo em diástole; Figura 3A). Consistentemente, o Doppler de onda de pulso demonstrou fluxo regurgitante robustamente elevado ...

Discussão

A indução cirúrgica de AR no camundongo é uma técnica nova e tecnicamente desafiadora, mas tem relevância translacional significativa. Para dominar a técnica, um cirurgião deve pelo menos estar familiarizado com antecedência com a anatomia cervical e cardíaca murina, manuseio de camundongos e ecocardiografia. A operação hábil na medição hemodinâmica invasiva é uma vantagem. Para uma operação de RA bem-sucedida, deve-se tomar cuidado especial em várias etapas críticas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia