쥐의 대동맥 역류에 의한 외과적으로 유도된 심장 용적 과부하(Surgically Induced Cardiac Volume Overload by Aortic Regurgitation in Mouse)

요약

이 프로토콜은 마우스에서 대동맥 역류(AR)를 생성하는 수술에 대한 실용적인 가이드를 제공합니다. 심장초음파검사 및 침습적 혈류역학적 측정에 의한 AR 마우스의 평가는 부피 과부하 유발 편심 비대의 임상적으로 관련된 특성을 요약하여 심장 비대 연구에서 유망한 응용 프로그램을 제안합니다.

초록

대동맥 역류증(AR)은 심장에 부피 과부하를 가하는 흔한 심장 판막 질환으로, 전 세계적인 공중 보건 문제를 나타냅니다. 심혈관 질환의 메커니즘을 밝히기 위해 생쥐가 널리 적용되고 있지만, AR의 마우스 모델, 특히 수술에 의해 유도된 모델은 여전히 부족합니다. 여기에서는 고해상도 심초음파에서 대동맥 판막의 파열에 의해 외과적으로 유도되는 AR의 마우스 모델이 자세히 설명되었습니다. 역류된 혈류에 따라 AR 마우스 심장은 심장 초음파 및 침습적 혈역학 평가에 의해 입증된 바와 같이 편심 비대 및 심장 기능 장애를 특징으로 하는 독특하고 임상적으로 관련된 볼륨 과부하 표현형을 나타냅니다. 우리의 제안은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 부피 과부하 심근병증의 분자 메커니즘 및 치료 대상에 대한 향후 연구를 위해 AR의 마우스 모델 구축 및 평가에 대한 실용적인 지침을 제공합니다.

서문

증가된 용적 과부하(예압) 또는 압력 과부하(후부하)가 있는 경우 심장은 비대증을 겪게 되는데, 이를 비대라고 합니다. 심장 비대는 심부전 전에 말초 장기의 관류를 유지하기 위한 보상 반응이지만, 주요 심혈관 질환에 대한 독립적인 위험 인자이기도 합니다 ^1,2. 체적 과부하는 기계적 스트레스 증가의 중요한 징후 중 하나입니다. 심장 이완기 운동 중에는 용적 과부하가 발생하며 편심성 심장 비대를 유발하는데, 이는 대동맥 역류, 승모판 역류와 같은 판막 질환뿐만 아니라 말기 고혈압성 심장 질환, 심근 경색, 확장성 심근병증, 과도한 운동에서도 흔히 볼 수 있습니다. 또한, 임상에서 압력 과부하에 의해 유발된 심근 비대를 더 잘 감소시킬 수 있는 일부 약물은 용적 과부하에 의해 유발된 심근 비대의 치료에 만족스럽지 못한 효과를 나타낸다¹. 따라서 용적 과부하로 인한 편심 심장 리모델링의 메커니즘과 중재 방법을 발견하는 것은 매우 중요합니다. 그러나 부피 과부하에 대한 이러한 연구는 오랫동안 상당한 방해를 받아 왔으며, 이는 대부분 쉽게 작동하고, 효율적으로 정량화하고, 안정적으로 복제할 수 있는 작은 동물 모델이 부족하기 때문일 수 있습니다³.

소동물 종의 경우, 생쥐는 짧은 수명주기, 편리한 작동, 명확한 게놈 및 유전자 변형의 용이성으로 인해 심혈관 질환 연구의 주류 모델 동물이 되었습니다⁴. 모델 범주 측면에서 유전자 변형 모델 및 약물 치료 모델과 비교할 때 수술 모델은 명백한 고유한 이점이 있습니다. 수술 모델은 유전자 변형 모델에 필요한 과도하고 힘든 마우스 육종 및 유전자 동정을 피할 수 있으며, 약물 처리 모델에서 제어하기 어려운 심장외 조직 및 장기에 대한 비특이적 효과도 피할 수 있습니다. 대동맥 션트(aortocaval shunt)의 마우스 모델은 이전 문헌⁵에서 심박 용적 과부하를 유발하는 것으로 문서화되었습니다. 그러나 대동맥 션트는 임상에서 심장 편심 비대의 작은 부분을 차지하고 양심실 과부하⁵를 유발하므로 좌심실 편심 비대 연구에 사용되는 번역적 중요성이 거의 없습니다. 그럼에도 불구하고 심장 판막 질환은 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제를 나타냅니다. 인구의 약 15%>75세 인구가 심각한 판막 장애를 앓고 있는 것으로 추정된다⁶. 대동맥 역류(AR)는 심장판막 질환의 일부를 차지하지만, 역류성 혈류에 의한 부피 과부하 증가로 인해 편심성 좌심실(LV) 비대를 독특하게 유발합니다 ^7,8. 오른쪽 총경동맥(RCCA)이 대동맥 판막의 위치에 도달하는 경로를 제공한다는 점을 고려할 때, RCCA를 통해 대동맥 판막을 파괴하여 생쥐의 역류 혈류를 유발하는 것은 개념적으로 흥미롭습니다. 진동하는 대동맥 흐름⁹을 생성하는 기술에서 영감을 받은 대동맥 역류(AR)의 마우스 모델이 최근 실험실에서 확립되어 외과적으로 부피 과부하⁷를 유도했습니다. 이 AR 마우스는 임상적으로 혁신적인 접근 방식이며 과부하된 심장 표현형과 그 기저 메커니즘을 연구하기 위한 뛰어난 번역 잠재력을 보여주는 명백한 LV 편심 비대를 보여줍니다. 여기에서는 생쥐에서 AR 수술을 수행하기 위한 자세한 단계별 절차를 설명했으며, 수술의 성공을 보장하기 위해 고주파 심장 초음파 검사 및 침습적 혈류역학 검사로 요약했습니다(그림 1).

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프로토콜

이 프로토콜은 푸단대학교 중산병원 동물관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 윤리적 승인을 받았으며, 실험동물의 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 권고사항을 따릅니다(No. 85-23, 2011년 개정; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)에 있습니다.

참고: 동물 실험은 생후 10주 > 수컷 C57BL/6J 마우스에서 수행되었습니다. 이 프로토콜의 외과의는 마우스에서 AR 수술을 수행하기 전에 쥐 심장 초음파 검사를 능숙하게 조작해야 합니다. 그러나 대부분의 연구 기관에서 소형 설치류 심초음파는 핵심 시설에서 운영되므로 외과의는 심장초음파에 대한 경험이 풍부한 외과의는 아니더라도 핵심 전문가와 긴밀하게 협력할 수 있습니다. 마우스의 침습적 혈류역학적 측정 경험은 플러스입니다.

1. 초음파 영상(필수) 및 침습적 혈류역학 측정(선택 사항) 준비

1. 30MHz 프로브에 연결된 초음파 기계를 시작합니다. 온도 제어 초음파 동물 플랫폼을 대동맥궁 위치에 설정 view, 마우스의 오른쪽이 위로 기울어져 있습니다.
   알림: 초음파 동물 플랫폼의 두개골 끝을 외과의를 향해 배치하는 것이 좋습니다. 그러나 두개골 끝이 쪽인지 꼬리 쪽을 향하고 있는지는 외과 의사가 어느 쪽을 더 편하게 느끼느냐에 달려 있습니다.
2. 마이크로압력계(압력 카테터)를 데이터 수집 장치 및 아날로그/디지털 변환기에 연결합니다. 식염수 보정을 위해 마이크로내압계의 보정 큐벳을 식염수에 담그십시오.
   참고: 조건이 허락하는 경우 압력-부피 카테터도 사용할 수 있습니다. 현재 연구의 심초음파 결과도 LV 부피를 설명할 수 있지만 실험실의 압력 데이터 수집 장치는 압력 전용 데이터를 수집하고 부피 관련 데이터를 수집할 수 있는 용량이 없기 때문에 압력 카테터를 사용합니다.

2. 생쥐의 마취, 수술 기구의 준비, RCCA의 격리

알림: 수술 도구는 사용하기 전에 멸균 및 고압멸균해야 합니다. 모든 단계는 무균 조건에서 수행하는 것이 좋습니다. 또한 이미징 절차 중 시간을 절약하고, 생쥐의 잠재적인 원치 않는 스트레스 반응을 최소화하고, 가슴과 사지를 깨끗하고 건조하게 유지하기 위해 제모를 1일 전에 수행하는 것이 좋습니다.

1. 0.8L/min의 산소와 혼합된 4% 이소플루란으로 설정된 기화기에 연결된 유도실에서 마우스를 마취합니다. 쥐가 잠이 들거나 꼬리 꼬집 반사가 사라지면 유도 챔버에서 동물을 꺼냅니다.
2. 동물을 누운 자세로 구리판에 놓고 가열 패드로 데우십시오. 코를 노즈콘에 연결하면 1.5% 이소플루란과 0.8L/min의 산소가 혼합되어 일정한 마취 수준을 유지하기 위해 전달됩니다.
   알림: 구리판은 청소가 편리하고 녹이 슬지 않으므로 권장되지만 다른 유형의 금속판으로 교체할 수 있습니다.
3. 마취 하에서 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르고 사지를 동판에 테이프로 붙입니다. 제모 크림을 사용하여 목과 가슴의 털을 제거하고 75% 에탄올로 제모된 부분을 청소합니다.
4. 다양한 집게와 가위를 포함하여 필요한 수술 도구를 준비합니다(그림 2A, 재료 표 참조).
5. 아래턱과 흉골 사이 구부러진 엄지 집게와 곧은 가위로 목을 약 1cm 정도 세로 중앙으로 절개합니다.
6. 갑상선의 왼쪽과 오른쪽 부분을 두 쌍의 집게를 사용하여 둔탁하게 절개합니다. 구부러진 미세한 엄지 손가락 집게로 오른쪽 기관주위 부위의 줄기모효이데우스 근육과 지방 조직을 분리하여 RCCA를 가능한 한 오래 노출시킵니다. 미주신경의 손상은 저혈압, 서맥 및 사망을 유발할 수 있으므로 항상 피하십시오(그림 2B).

3. RCCA를 통한 카테터 삽입 및 초음파 유도에 따른 상행 대동맥

1. 각각 약 5cm의 6-0 명주실 두 개를 용기 아래에 통과시킵니다. 하나의 실을 사용하여 원위 RCCA를 단단한 매듭으로 접합하고 단단한 매듭의 두 끝을 동물의 머리 옆에 고정하여 RCCA에 가벼운 장력을 유지합니다. 이 조치는 다음 단계에서 카테터 삽입을 용이하게 합니다.
2. 두 번째 실을 사용하여 근위 RCCA에 느슨한 매듭을 놓습니다. 이렇게 하면 RCCA의 밀봉된 부위가 혈액으로 채워져 쉽게 절개할 수 있습니다.
3. 작은 꼬집음 가위를 사용하여 단단한 매듭에 근접한 1-2mm 쐐기 모양의 구멍을 잘라 RCCA를 엽니다. 절개 부위의 크기가 카테터를 삽입하기에 너무 작거나 삽입 중에 끊어질 정도로 너무 크지 않은지 확인하십시오.
   참고: 현미경으로 절개하는 것이 좋습니다. 26G 바늘로 혈관의 작은 구멍을 뚫는 것도 다른 방법입니다.
4. 금속 와이어가 포함된 플라스틱 카테터를 준비합니다(그림 2C). 장손의 곡선 타이 겸자로 절개 부위를 펴고, 금속 와이어가 들어있는 플라스틱 카테터를 RCCA에 삽입하고, 느슨한 매듭으로 나아갑니다.
5. 느슨한 매듭을 풀어 카테터와 와이어를 약 2cm 전진시킵니다. 동물이 들어있는 구리판을 초음파 동물 플랫폼으로 옮기고 초음파 젤을 마우스의 목과 가슴에 바른 다음 초음파 유도하에 RCCA와 상행 대동맥을 통해 카테터와 와이어를 조심스럽게 전진시킵니다.

4. 초음파 유도하에 대동맥 판막의 천공

1. 플라스틱 카테터와 금속 와이어가 대동맥 구멍에 도달하기 전에 컬러 도플러 모드와 맥파 도플러 모드에서 기초 초음파 데이터를 수집합니다.
2. 초음파를 통해 상행 대동맥, 좌심실 유출로, 카테터 및 와이어를 동시에 명확하게 보여주며, 카테터와 와이어가 대동맥 구멍에 도달하면 카테터에서 와이어 끝이 돌출되어 대동맥 판막에 구멍을 뚫습니다(그림 1).
   참고: 대동맥 판막에 천공이 발생하면 외과의는 이 절단을 감지할 수 있어야 합니다.
3. 대동맥 구멍에서 카테터와 와이어를 약간 후퇴시키고 대동맥 판막 천공 후 컬러 도플러 모드 및 맥파 도플러 모드에서 천공 후 초음파 데이터를 수집합니다. 역류는 컬러 도플러 모드에서 심장 이완기 동안 빨간색이며 맥파 도플러 모드에서 정량적으로 확인할 수 있습니다.
4. 대동맥 흐름의 최대 이완기 속도(PSVa)가 300-500mm/s 사이인 것으로 간주합니다. 역류하는 혈류 정도가 만족스럽지 않으면 4.2단계를 반복합니다.
5. 선택 사항: 역류 흐름의 존재를 추가로 확인하기 위해 대동맥 판막 천공 전과 직후에 미세 압력계를 적용합니다. 이를 확인하기 위해 대동맥 이완기 말단 압력(AEDP)이 모두 낮아지고 대동맥 맥압이 약 20mmHg 증가합니다.
   참고: 침습적 좌심실 혈류역학적 측정을 수행하기 위해 마이크로내압계 카테터를 사용하는 방법에 대한 자세한 설명은 다른 곳에서 우아하게 제시되었습니다^10,11.

5. 플라스틱 카테터와 금속 와이어의 철거 및 수술 전후 관리

1. 초음파 젤을 제거하고 대동맥 판막의 성공적인 천공을 확인한 후 멸균 거즈 또는 조직으로 마우스를 건조시킨 다음 RCCA를 결찰하기 전에 중앙 금속 와이어로 플라스틱 카테터를 조심스럽게 빼냅니다.
2. 연속 봉합사 패턴의 5-0 실크 봉합사를 사용하여 피부를 봉합하고 봉합사 부위에 포비돈 요오드 용액을 도포합니다. 진통제를 위해 마우스에 멜록시캠(0.13mg)을 피하주사로 투여하고 회복을 위해 완전히 깨어날 때까지 예열된 케이지에 따뜻한 빛 아래 마우스를 넣습니다.

6. 가짜 수술

1. 설명된 대로 섹션 1-3을 수행합니다. 가짜 작동식 마우스의 경우 대동맥 판막의 중단 없이 섹션 4와 유사한 절차를 수행합니다.
2. 설명된 대로 섹션 5를 수행하되, AR은 가짜 작동 마우스에 존재해서는 안 됩니다.

7. 심장초음파검사 및 침습적 혈류역학적 측정을 사용한 대동맥 판막 천공, 심장 형태 및 기능 평가

1. AR 4주 후 심초음파 B-모드, 컬러 도플러 모드 및 맥파 도플러 모드를 사용하여 대동맥궁 보기에서 대동맥궁의 혈류를 평가하고 4.1단계 및 기타 ^1,12에 따라 PDVa를 측정합니다.
2. 심초음파 B-모드 및 M-모드를 사용하여 LV 확장기말(LVEDD) 및 수축기말(LVESD) 치수, LV 후벽 확장기말(LVPWTd) 및 수축기말(LVPWTs) 두께, LVEF(LVEF) 및 분획 단축(LVFS)을 도출하여 흉골 주위 장축 보기에서 LV 치수 및 수축성을 평가합니다.
   참고: 초음파 기계 사용 방법과 초음파 보기 조작 방법에 대한 자세한 설명은 앞서¹²번 우아하게 설명되었습니다.
3. 심초음파 영상 촬영 후 4.3단계 및 다른 단계¹⁰과 유사한 방식으로 침습적 혈역학적 측정을 수행합니다. 최대 수축 및 이완 속도(+dp/dt 및 -dp/dt)를 기록합니다. AR 수술 중 RCCA가 영구적으로 결찰되었기 때문에 미세 압력계를 왼쪽 총경동맥(RCCA가 아닌 LCCA)에 삽입합니다.
4. 침습적 혈역학적 측정 후 경추 탈구를 통해 마우스를 안락사시킵니다. 가슴을 열고 포르말린 10%로 심장을 씻어낸 다음 0.9% 염화나트륨 용액을 투여하고 대동맥을 잘라 심장을 절제하고 왼쪽 귓바퀴의 아래쪽 가장자리 수준에서 가로로 절편으로 절제합니다. 광학 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.

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결과

성공적인 AR을 보장하기 위해 컬러 도플러 및 맥파 도플러 심초음파를 사용하여 역류 혈류를 검증했습니다. AR이 있는 마우스에서 대동맥궁의 색 도플러 스펙트럼은 수술 직후 역류 흐름(빨간색)을 보였는데, 이는 가짜 마우스에서는 없었습니다(이완기에는 흐름 없음; 그림 3A). 일관되게 맥파 도플러는 AR 마우스에서 강력하게 증가된 역류 흐름을 보?...

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토론

생쥐에서 AR을 외과적으로 유도하는 것은 기술적으로 까다롭고 새로운 기술이지만 상당한 번역 관련성이 있습니다. 이 기술을 숙달하려면 외과의는 최소한 쥐의 경추 및 심장 해부학, 마우스 취급 및 심장 초음파 검사에 대해 미리 숙지해야 합니다. 침습적 혈류역학적 측정에서 능숙한 작동은 플러스입니다. 성공적인 AR 작동을 위해서는 몇 가지 중요한 단계에서 특별한 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia