小鼠主动脉瓣反流手术诱导的心容量超负荷

摘要

该协议提供了关于在小鼠中产生主动脉瓣反流 （AR） 的手术的实用指南。通过超声心动图和侵入性血流动力学测量对 AR 小鼠的评估概括了其容量超负荷诱导的离心肥大的临床相关特征，表明其在心脏肥大研究中具有广阔的应用前景。

摘要

主动脉瓣反流 （AR） 是一种常见的瓣膜性心脏病，它会对心脏造成容量超负荷，是一个全球性的公共卫生问题。尽管小鼠被广泛应用于阐明心血管疾病的机制，但 AR 的小鼠模型，尤其是那些由手术诱导的小鼠模型，仍然缺乏。在这里，详细描述了 AR 的小鼠模型，该模型是在高分辨率超声心动图下通过手术诱导的主动脉瓣破裂而诱导的。根据反流血流，AR 小鼠心脏呈现独特且临床相关的容量超负荷表型，其特征是离心性肥大和心功能不全，超声心动图和侵入性血流动力学评估证明了这一点。我们的提案以可靠和可重复的方式为建立和评估 AR 小鼠模型提供了实用指南，用于未来研究容量超负荷心肌病的分子机制和治疗靶点。

引言

在容量超负荷（前负荷）或压力超负荷（后负荷）增加的情况下，心脏会扩大，这种情况称为肥大。虽然心脏肥大是心力衰竭前维持外周器官灌注的代偿反应，但它也是主要心血管事件的独立危险因素 ^1,2。容量超负荷是机械应力增加的重要表现之一。心脏舒张期发生容量超负荷，诱发偏心性心脏肥大，不仅常见于瓣膜病，如主动脉瓣反流、二尖瓣反流，也常见于终末期高血压心脏病、心肌梗死、扩张型心肌病和过度运动。此外，在临床实践中，一些能较好地减轻压力超负荷诱发的心肌肥大的药物在治疗容量超负荷诱发的心肌肥大方面效果尚不理想¹。因此，发现容量超负荷引起离心心脏重塑的机制和干预方法具有重要意义。然而，这种关于体积超负荷的研究长期以来一直受到严重阻碍，这在很大程度上可以归因于缺乏易于作、有效量化和稳定复制的小动物模型³。

至于小动物物种，小鼠因其生命周期短、作方便、基因组清晰、易于基因改造等优点，已成为心血管疾病研究的主流模式动物⁴。在模型类别方面，与基因改造模型和药物治疗模型相比，手术模型具有明显的独特优势。手术模型可以避免基因改造模型所必需的过度费力的小鼠繁殖和基因鉴定，还可以避免在药物治疗模型中难以控制的对心外组织和器官的非特异性影响。在以前的文献中，主动脉腔静脉分流的小鼠模型已被证明可诱导心脏容量超负荷⁵。然而，主动脉腔静脉分流术在临床上占心脏离心肥大的一小部分，并导致双心室超负荷⁵，因此在左心室离心肥大研究中使用几乎没有转化意义。然而，瓣膜性心脏病是世界范围内的一个主要公共卫生问题;据估计，大约 15% 的人口>75 岁）患有严重的瓣膜病⁶。虽然主动脉瓣反流 （AR） 占据了瓣膜性心脏病的一部分，但由于反流血流导致容量超负荷增加，它明显导致偏心性左心室 （LV） 肥大 ^7,8。考虑到右颈总动脉 （RCCA） 提供了到达主动脉瓣位置的途径，因此从 RCCA 破坏主动脉瓣导致小鼠血流反流在概念上很有趣。受创建振荡主动脉流⁹ 技术的启发，我们实验室最近建立了一种主动脉瓣反流 （AR） 小鼠模型，用于手术诱导容量超负荷⁷。这种 AR 小鼠表现出明显的 LV 离心性肥大，这是一种临床变革性方法，并显示出研究超负荷心脏表型及其潜在机制的巨大转化潜力。在这里，描述了在小鼠中进行 AR 手术的详细分步程序，通过高频超声心动图和侵入性血流动力学概括，以确保手术成功（图1）。

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研究方案

该方案已获得复旦大学附属中山医院动物护理与使用委员会的伦理批准，并遵循《实验动物护理和使用指南》（第 85-23 号，2011 年修订;美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）。

注意：对 10 周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠>进行了动物实验。该协议中的外科医生在他/她在小鼠中执行 AR 手术之前，应熟练作小鼠超声心动图。然而，在大多数研究机构，小型啮齿动物超声心动图由核心机构作，因此外科医生可以与核心专家密切合作，即使不是经验丰富的超声心动图外科医生。有小鼠侵入性血流动力学测量经验者优先。

1. 超声成像（必修）和有创血流动力学测量（可选）的准备

1. 启动连接到 30 MHz 探头的超声机。将温控超声动物平台设置在主动脉弓视图的位置，其中鼠标的右侧向上倾斜。
   注意：建议将超声动物平台的颅端朝向外科医生。然而，颅端还是尾端朝向外科医生应该取决于外科医生对哪一个感觉更舒服。
2. 将微压计（压力导管）连接到数据采集设备和模拟/数字转换器。将微量测压计的校准比色皿浸入盐水中以进行盐水校准。
   注意：如果条件允许，也可以使用压力容积导管。我们使用压力导管是因为实验室中的压力数据采集设备仅收集压力数据，并且没有能力收集与体积相关的数据，尽管当前研究中的超声心动图结果也可以描绘 LV 体积。

2. 小鼠麻醉、手术器械的制备和 RCCA 的分离

注意：手术工具在使用前必须消毒和高压灭菌。建议所有步骤均在无菌条件下进行。还建议提前 1 天进行脱毛，以节省成像过程中的时间，最大限度地减少小鼠潜在的不良应激反应，并保持胸部和四肢清洁干燥。

1. 在诱导室中麻醉小鼠，该诱导室连接到设置为 4% 异氟醚与 0.8 L/min 氧气混合的蒸发器。当小鼠睡着或捏尾反射消失时，将动物从诱导室中取出。
2. 将动物仰卧在铜板上，铜板由加热垫加热。将其鼻子连接到鼻锥上，将 1.5% 异氟醚与 0.8 L/min 氧气混合到鼻锥上，以保持稳定的麻醉水平。
   注意：建议使用铜板，因为它方便清洁且防锈，但可以用其他类型的金属板代替。
3. 将眼药膏涂在眼睛上以防止麻醉下干燥，并将四肢贴在铜板上。使用脱毛膏去除颈部和胸部的毛发，并用 75% 乙醇清洁脱毛区域。
4. 准备必要的手术工具，包括各种镊子和剪刀（图 2A;见 材料表）。
5. 用弯曲的拇指镊子和直剪刀在下颌和胸骨之间，在颈部做一个纵向的正中切口，约 1 厘米。
6. 用两对镊子钝性解剖甲状腺的左右部分。使用弯曲的细拇指镊子，将右气管旁区域的茎和脂肪组织分开，以尽可能长时间地暴露 RCCA。始终避免损伤迷走神经，因为这会导致低血压、心动过缓和死亡（图2B）。

3. 超声引导下通过 RCCA 和升主动脉进行导管插入术

1. 将两根 6-0 丝线（每根约 5 厘米）穿过容器下方。用一根线用紧结结连接远端 RCCA，并将紧结的两端固定在动物头部旁边，以保持 RCCA 上的轻微张力。此作将促进后续步骤的导管插入术。
2. 使用第二根线在近端 RCCA 上打一个松散的结。这会用血液填充 RCCA 的密封区域，使其易于切割。
3. 使用小捏剪刀在紧结近端 1-2 毫米处剪出一个楔形开口，以打开 RCCA。确保切口的大小既不会太小而无法插入导管，也不会太大而无法在插入过程中卡住。
   注意：强烈建议在显微镜下切开。用 26 G 针在血管上穿刺一个小孔是一种替代方法。
4. 准备一根包含金属丝的塑料导管（图 2C）。用长手弯曲的打结钳拉伸切口，将含有金属丝的塑料导管插入 RCCA，然后向前移动到松散的结。
5. 松开松动的结，将导管和电线推进约 2 厘米。将含有动物的铜板转移到超声动物平台上，将超声凝胶涂抹在小鼠颈部和胸部，然后在超声引导下小心地将导管和导线穿过 RCCA 和升主动脉。

4. 超声引导下穿刺主动脉瓣

1. 在塑料导管和金属丝到达主动脉口之前，以彩色多普勒模式和脉搏波多普勒模式收集基础超声数据。
2. 超声同时清晰地显示升主动脉、LV 流出道、导管和导丝，当导管和导丝到达主动脉口时，将导丝尖端从导管中伸出，并穿刺主动脉瓣（图1）。
   注意：当主动脉瓣穿孔时，外科医生应该能够感觉到这种断裂。
3. 从主动脉口稍微后撤导管和导丝，并在主动脉瓣穿刺后以彩色多普勒模式和脉搏波多普勒模式收集穿孔后超声数据。在彩色多普勒模式下，心脏舒张期反流呈红色，在脉搏波多普勒模式下可以定量确认。
4. 考虑主动脉血流舒张期峰值速度 （PSVa） 在 300-500 mm/s 之间是令人满意的。如果血流反流程度不满意，请重复步骤 4.2。
5. 可选：在主动脉瓣穿孔之前和之后立即应用微量压力计，以进一步确认反流血流的存在。为了检查，主动脉舒张末期压 （AEDP） 都降低，主动脉脉压增加约 20 mmHg。
   注意：有关如何使用微量测压计导管进行侵入性 LV 血流动力学测量的详细说明已在其他地方优雅地介绍^10,11。

5. 塑料导管和金属丝的撤出和围手术期护理

1. 确认主动脉瓣成功穿孔后，取出超声凝胶并用无菌纱布或组织干燥小鼠，然后在结扎 RCCA 之前用中央金属丝小心地拔出塑料导管。
2. 使用 5-0 丝线以连续缝合模式闭合皮肤，并将聚维酮碘溶液涂抹在缝合部位。皮下注射美洛昔康 （0.13 mg） 给小鼠镇痛，并将小鼠放在预热的笼子中，在温暖的灯光下直至完全清醒以进行恢复。

6. 假手术

1. 按照说明执行第 1-3 节。对于假手术鼠标，执行与第 4 节类似的程序，而不会破坏主动脉瓣。
2. 如前所述执行第 5 节，尽管 AR 不应存在于任何假手术小鼠中。

7. 使用超声心动图和有创血流动力学测量评估主动脉瓣穿孔、心脏形态和功能

1. AR 4 周后，使用超声心动图 B 型、彩色多普勒模式和脉搏波多普勒模式评估主动脉弓视图中主动脉弓的血流，并根据步骤 4.1 和其他地方测量 PDVa ^1,12。
2. 使用超声心动图 B 型和 M 型在胸骨旁长轴视图中评估 LV 尺寸和收缩力，包括 LV 舒张末期 （LVEDD） 和收缩末期 （LVESD） 尺寸、LV 后壁舒张末期 （LVPWTd） 和收缩末期 （LVPWT） 厚度、LV 射血分数 （LVEF） 和缩短分数 （LVFS）。
   注意：有关如何使用超声机和作超声视图的详细说明已在前面优雅地描述过¹².
3. 超声心动图成像后，以类似于步骤 4.3 和其他地方¹⁰ 的方式进行侵入性血流动力学测量。记录最大收缩和松弛速度（+dp/dt 和 −dp/dt）。将微压计插入左颈总动脉（LCCA，而不是 RCCA），因为 RCCA 在 AR 手术期间被永久结扎。
4. 侵入性血流动力学测量后， 通过 颈椎脱位对小鼠实施安乐死。打开胸腔，用 10% 福尔马林冲洗心脏，然后用 0.9% 氯化钠溶液冲洗心脏，切断主动脉，在左耳廓下缘水平横向切片。使用光学显微镜采集图像。

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结果

为了保证 AR 成功，我们使用彩色多普勒和脉搏波多普勒超声心动图验证了反流血流。在 AR 小鼠中，主动脉弓的彩色多普勒光谱在手术后立即显示反流血流（红色），这在假小鼠中不存在（舒张期无血流;图 3A）。一致地，脉搏波多普勒在 AR 小鼠中显示出强烈升高的反流血流（图 3B、C）。通过使用侵入性血流动力?...

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讨论

在小鼠中手术诱导 AR 是一项技术上具有挑战性的新技术，但具有重要的转化相关性。要掌握该技术，外科医生至少应提前熟悉小鼠颈椎和心脏解剖结构、小鼠处理和超声心动图。熟练的侵入性血流动力学测量作是一个加分项。为了成功进行 AR 手术，应特别注意几个关键步骤。

切开 RCCA 是最关键的一步。RCCA 上的孔不应太小而无法容纳塑料导管，也不...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia