Sovraccarico di volume cardiaco indotto chirurgicamente mediante rigurgito aortico nel topo

Riepilogo

Questo protocollo presenta una guida pratica sulla chirurgia per la creazione di rigurgito aortico (AR) nel topo. La valutazione del topo AR mediante ecocardiografia e misurazione emodinamica invasiva ricapitola le sue caratteristiche clinicamente rilevanti dell'ipertrofia eccentrica indotta da sovraccarico di volume, suggerendo la sua promettente applicazione nello studio dell'ipertrofia cardiaca.

Abstract

Il rigurgito aortico (AR) è una comune cardiopatia valvolare che esercita un sovraccarico di volume sul cuore e rappresenta un problema di salute pubblica globale. Sebbene i topi siano ampiamente utilizzati per far luce sui meccanismi delle malattie cardiovascolari, i modelli murini di AR, in particolare quelli indotti dalla chirurgia, sono ancora scarsi. Qui, è stato descritto in dettaglio un modello murino di AR che è indotto chirurgicamente dalla rottura delle valvole aortiche sotto ecocardiografia ad alta risoluzione. In accordo con il flusso sanguigno rigurgitato, i cuori di topo AR presentano un fenotipo di sovraccarico di volume distintivo e clinicamente rilevante, caratterizzato da ipertrofia eccentrica e disfunzione cardiaca, come evidenziato dalla valutazione ecocardiografica ed emodinamica invasiva. La nostra proposta, in modo affidabile e riproducibile, fornisce una guida pratica sulla creazione e la valutazione di un modello murino di AR per futuri studi sui meccanismi molecolari e sui bersagli terapeutici della cardiomiopatia da sovraccarico di volume.

Introduzione

In presenza di un aumento del sovraccarico di volume (precarico) o di pressione (postcarico), il cuore va incontro ad un ingrossamento, una condizione chiamata ipertrofia. Sebbene l'ipertrofia cardiaca sia una risposta compensatoria per mantenere la perfusione degli organi periferici prima dell'insufficienza cardiaca, è anche un fattore di rischio indipendente per i principali eventi cardiovascolari ^1,2. Il sovraccarico di volume è una delle manifestazioni importanti dell'aumento delle sollecitazioni meccaniche. Il sovraccarico di volume si verifica durante la diastole cardiaca e induce ipertrofia cardiaca eccentrica, che non solo è comunemente osservata nelle malattie valvolari, come il rigurgito aortico e il rigurgito mitralico, ma anche nella cardiopatia ipertensiva allo stadio terminale, nell'infarto del miocardio, nella cardiomiopatia dilatativa e nell'esercizio fisico eccessivo. Inoltre, nella pratica clinica, alcuni farmaci che possono ridurre meglio l'ipertrofia miocardica indotta da sovraccarico pressorio hanno effetti insoddisfacenti nel trattamento dell'ipertrofia miocardica indotta da sovraccarico di volume¹. È quindi di grande importanza scoprire il meccanismo e le modalità di intervento del rimodellamento cardiaco eccentrico causato da sovraccarico di volume. Tuttavia, tale ricerca sul sovraccarico di volume è stata notevolmente ostacolata per molto tempo, il che può essere, in gran parte, attribuito alla mancanza di modelli di piccoli animali che possano essere facilmente utilizzati, quantificati in modo efficiente e replicati stabilmente³.

Per quanto riguarda le specie di piccoli animali, i topi sono diventati l'animale modello principale per la ricerca sulle malattie cardiovascolari grazie al loro breve ciclo di vita, al funzionamento conveniente, al genoma chiaro e alla facilità di modificazione genetica⁴. In termini di categorie di modelli, rispetto ai modelli di modificazione genetica e ai modelli trattati con farmaci, i modelli chirurgici presentano evidenti vantaggi unici. Il modello chirurgico può evitare l'eccessivo e laborioso allevamento dei topi e l'identificazione genica che sono necessari per il modello di modificazione genetica e può anche evitare gli effetti aspecifici su tessuti e organi extracardiaci che sono difficili da controllare nei modelli trattati con farmaci. Nella letteratura precedente è stato documentato che il modello murino di shunt aortocavale induce un sovraccarico di volume cardiaco⁵. Tuttavia, lo shunt aortocavale rappresenta una piccola frazione dell'ipertrofia eccentrica cardiaca in clinica e causa un sovraccarico biventricolare⁵, rendendolo di scarso significato traslazionale da utilizzare nello studio dell'ipertrofia eccentrica ventricolare sinistra. Tuttavia, la cardiopatia valvolare rappresenta un grave problema di salute pubblica in tutto il mondo; Si stima che circa il 15% della popolazione di età >compresa tra i 75 anni soffra di un disturbo valvolare significativo⁶. Sebbene il rigurgito aortico (AR) occupi una parte della cardiopatia valvolare, causa in modo distintivo ipertrofia eccentrica del ventricolo sinistro (LV) a causa di un aumento del sovraccarico di volume dovuto al flusso sanguigno di rigurgito ^7,8. Considerando che l'arteria carotide comune destra (RCCA) fornisce un percorso per raggiungere la posizione delle valvole aortiche, è concettualmente intrigante interrompere le valvole aortiche attraverso l'RCCA per causare il flusso sanguigno di rigurgito nei topi. Ispirato dalle tecniche di creazione del flusso aortico oscillante⁹, un modello murino di rigurgito aortico (AR) è stato recentemente stabilito nel nostro laboratorio per indurre chirurgicamente il sovraccarico di volume⁷. Questo topo AR dimostra un'evidente ipertrofia eccentrica del ventricolo sinistro, che è un approccio clinicamente trasformativo e dimostra un grande potenziale traslazionale per lo studio del fenotipo cardiaco sovraccarico e del suo meccanismo sottostante. Qui, è stata descritta una dettagliata procedura passo-passo per eseguire la chirurgia AR nei topi, ricapitolata dall'ecocardiografia ad alta frequenza e dall'emodinamica invasiva per garantire il successo dell'intervento chirurgico (Figura 1).

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Protocollo

Questo protocollo ha ricevuto l'approvazione etica dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale Zhongshan, Università di Fudan, e segue le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (n. 85-23, rivista nel 2011; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

NOTA: Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti su topi maschi C57BL/6J di >10 settimane di età. Il chirurgo in questo protocollo dovrebbe essere abile nella manipolazione dell'ecocardiografia murina, prima di eseguire l'operazione AR nel topo. Tuttavia, nella maggior parte degli istituti di ricerca, l'ecocardiografia di piccoli roditori viene eseguita da una struttura di base, in modo che il chirurgo possa collaborare strettamente con gli esperti di base, se non con un chirurgo esperto in ecocardiografia. L'esperienza della misurazione emodinamica invasiva nel topo è un vantaggio.

1. Preparazione all'ecografia (obbligatoria) e alla misurazione emodinamica invasiva (opzionale)

1. Avviare l'ecografo collegato ad una sonda da 30 MHz. Impostare la piattaforma dell'animale a ultrasuoni a temperatura controllata nella posizione per la vista dell'arco aortico, in cui il lato destro del mouse è inclinato verso l'alto.
   NOTA: Si raccomanda di posizionare l'estremità cranica della piattaforma dell'animale ecografico verso il chirurgo. Tuttavia, se l'estremità cranica o l'estremità caudale è rivolta verso il chirurgo dovrebbe dipendere da quale si sente più a suo agio.
2. Collegare un micromanometro (catetere a pressione) al dispositivo di acquisizione dati e al convertitore analogico/digitale. Immergere la cuvetta di calibrazione del micromanometro nella soluzione fisiologica per la calibrazione della soluzione salina.
   NOTA: Se la condizione lo consente, è possibile utilizzare anche un catetere a pressione-volume. Utilizziamo un catetere a pressione perché il dispositivo di acquisizione dei dati di pressione in laboratorio raccoglie dati di sola pressione e non ha la capacità di raccogliere dati relativi al volume, sebbene i risultati ecocardiografici nel presente studio possano anche delineare i volumi del ventricolo sinistro.

2. Anestesia dei topi, preparazione dei dispositivi chirurgici e isolamento dell'RCCA

NOTA: Gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati e sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Si consiglia di eseguire tutti i passaggi in condizioni asettiche. Si raccomanda inoltre di eseguire la depilazione con 1 giorno di anticipo per risparmiare tempo durante la procedura di imaging, ridurre al minimo le potenziali risposte indesiderate allo stress nei topi e mantenere il torace e le estremità puliti e asciutti.

1. Anestetizzare il topo nella camera di induzione, che è collegata a un vaporizzatore impostato al 4% di isoflurano miscelato con 0,8 L/min di ossigeno. Quando il topo si addormenta o il riflesso di pizzicamento della coda scompare, rimuovere l'animale dalla camera di induzione.
2. Posizionare l'animale in posizione supina su una piastra di rame, riscaldata da un termoforo. Collegare il naso a un ogiva, al quale viene erogato isoflurano all'1,5% miscelato con 0,8 L/min di ossigeno per mantenere un livello costante di anestesia.
   NOTA: Si consiglia una piastra di rame in quanto è comoda da pulire ed è resistente alla ruggine, anche se può essere sostituita da un altro tipo di piastra metallica.
3. Posizionare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia e fissare le estremità sulla piastra di rame. Rimuovere i peli dal collo e dal petto con una crema depilatoria e pulire la zona depilata con etanolo al 75%.
4. Preparare gli strumenti chirurgici necessari, tra cui varie pinze e forbici (Figura 2A; vedere la Tabella dei materiali).
5. Praticare un'incisione longitudinale mediana, di circa 1 cm, nel collo con una pinza per pollice curva e forbici dritte, tra la mascella inferiore e lo sterno.
6. Sezionare senza mezzi termini la parte sinistra e destra della ghiandola tiroidea usando due paia di pinze. Con la pinza per pollice sottile ricurva, separare il muscolo stemohyoideo e il tessuto adiposo nella regione paratracheale destra per esporre l'RCCA il più a lungo possibile. Evitare sempre lesioni al nervo vagale, in quanto ciò può causare ipotensione, bradicardia e morte (Figura 2B).

3. Cateterismo attraverso l'RCCA e l'aorta ascendente sotto guida ecografica

1. Passare due fili di seta 6-0, di circa 5 cm ciascuno, sotto il recipiente. Legare l'RCCA distale con un nodo stretto usando un filo e fissare le due estremità del nodo stretto vicino alla testa dell'animale per mantenere una leggera tensione sull'RCCA. Questa azione faciliterà il cateterismo nelle fasi successive.
2. Posiziona un nodo sciolto sull'RCCA prossimale usando il secondo filo. Questo riempie di sangue la regione sigillata dell'RCCA, facilitandone l'incisione.
3. Usa le piccole forbici a pizzico per tagliare un'apertura a forma di cuneo, 1-2 mm prossimalmente al nodo stretto, per aprire l'RCCA. Assicurarsi che la dimensione dell'incisione non sia né troppo piccola per inserire un catetere, né troppo grande per scattare durante l'inserimento.
   NOTA: Si consiglia vivamente di incidere al microscopio. Praticare un piccolo foro nel recipiente con un ago da 26 G è un metodo alternativo.
4. Preparare un catetere di plastica contenente un filo metallico (Figura 2C). Allungare l'incisione con una pinza da legatura curva a mano lunga, inserire il catetere di plastica contenente il filo metallico nell'RCCA e andare avanti fino al nodo allentato.
5. Sciogliere il nodo sciolto per far avanzare il catetere e il filo di circa 2 cm. Trasferire la piastra di rame contenente l'animale sulla piattaforma dell'animale a ultrasuoni, applicare il gel per ultrasuoni sul collo e sul torace del topo, quindi inoltrare con cautela il catetere e il filo attraverso l'RCCA e l'aorta ascendente sotto guida ecografica.

4. Puntura delle valvole aortiche sotto guida ecografica

1. Raccogli i dati dell'ecografia basale in modalità Color Doppler e in modalità Doppler a onde pulsate prima che il catetere di plastica e il filo metallico raggiungano l'orifizio aortico.
2. Con l'ecografia che mostra simultaneamente e chiaramente l'aorta ascendente, il tratto di efflusso del ventricolo sinistro, il catetere e il filo, quando il catetere e il filo raggiungono l'orifizio aortico, sporgono la punta del filo dal catetere e perforano le valvole aortiche (Figura 1).
   NOTA: Quando la valvola aortica è perforata, il chirurgo dovrebbe essere in grado di percepire questa rottura.
3. Ritirare leggermente il catetere e il filo dall'orifizio aortico e raccogliere i dati ecografici post-perforazione in modalità Color Doppler e in modalità Doppler a onde pulsate dopo la puntura delle valvole aortiche. Il flusso di rigurgito è di colore rosso durante la diastole cardiaca in modalità color Doppler e può essere confermato quantitativamente in modalità Doppler a onde pulsate.
4. Considerare soddisfacente una velocità diastolica di picco del flusso aortico (PSVa) compresa tra 300 e 500 mm/s. Se il grado di rigurgito del flusso sanguigno è insoddisfacente, ripetere il passaggio 4.2.
5. Opzionale: applicare un micromanometro prima e immediatamente dopo la perforazione delle valvole aortiche per confermare ulteriormente l'esistenza del flusso di rigurgito. Per verificare, sia la pressione telediastolica aortica (AEDP) è depressa, sia la pressione del polso aortico è aumentata di circa 20 mmHg.
   NOTA: Una descrizione dettagliata di come utilizzare un catetere micromanometrico per eseguire la misurazione emodinamica invasiva del ventricolo sinistro è stata elegantemente presentata altrove^10,11.

5. Ritiro del catetere di plastica e del filo metallico e assistenza perioperatoria

1. Rimuovere il gel per ultrasuoni e asciugare il topo con una garza sterile o un fazzoletto dopo la conferma dell'avvenuta perforazione delle valvole aortiche, quindi estrarre con cura il catetere di plastica con il filo metallico centrale, prima della legatura dell'RCCA.
2. Chiudere la pelle utilizzando una sutura di seta 5-0 in uno schema di sutura continuo e applicare la soluzione di iodio povidone sul sito di sutura. Somministrare al topo meloxicam (0,13 mg) per via sottocutanea per analgesia e posizionare il topo in una gabbia preriscaldata sotto una luce riscaldante fino a completo risveglio per il recupero.

6. Chirurgia fittizia

1. Eseguire le sezioni 1-3 come descritto. Per il topo con intervento simulato, eseguire procedure simili a quelle descritte nella sezione 4 senza interrompere le valvole aortiche.
2. Eseguire la sezione 5 come descritto, anche se l'AR non dovrebbe essere presente in nessuno dei topi operati con sham.

7. Valutazione della perforazione della valvola aortica, della morfologia cardiaca e della funzione mediante ecocardiografia e misurazione emodinamica invasiva

1. Dopo 4 settimane di AR, utilizzare la modalità B ecocardiografica, la modalità color Doppler e la modalità Doppler a onde pulsate per valutare il flusso sanguigno dell'arco aortico nella vista dell'arco aortico e misurare la PDVa, secondo il passaggio 4.1 e altrove ^1,12.
2. Utilizzare la modalità B e la modalità M ecocardiografiche per valutare le dimensioni e la contrattilità del ventricolo sinistro nella vista dell'asse lungo parasternale, derivando le dimensioni telediastolica (LVEDD) e telesistolica (LVESD), lo spessore telediastolico della parete posteriore del ventricolo sinistro (LVPWTd) e la fine sistolica (LVPWT), la frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF) e l'accorciamento frazionario (LVFS).
   NOTA: Una descrizione dettagliata di come utilizzare l'ecografo e la manipolazione delle viste ecografiche è stata elegantemente descritta in precedenza¹².
3. Dopo l'imaging ecocardiografico, eseguire la misurazione emodinamica invasiva, in modo simile al passaggio 4.3 e altrove¹⁰. Registra la massima velocità di contrazione e rilassamento (+dp/dt e -dp/dt). Inserire il micromanometro nell'arteria carotide comune sinistra (LCCA, non RCCA), poiché l'RCCA è stato legato in modo permanente durante l'intervento chirurgico di AR.
4. Dopo la misurazione emodinamica invasiva, sopprimere il topo tramite lussazione cervicale. Aprire il torace, sciacquare il cuore con formalina al 10%, seguita da una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, asportare il cuore tagliando l'aorta e sezionarlo trasversalmente a livello del margine inferiore del padiglione auricolare sinistro. Acquisizione di immagini mediante microscopia ottica.

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Risultati

Per garantire il successo dell'AR, abbiamo convalidato il flusso sanguigno del rigurgito utilizzando l'ecocardiografia color Doppler e l'ecocardiografia Doppler a onde di polso. Nei topi con AR, lo spettro color Doppler dell'arco aortico mostrava un flusso di rigurgito (rosso) immediatamente dopo l'operazione, che era assente nei topi fittizi (nessun flusso nella diastole; Figura 3A). Coerentemente, il Doppler a onde pulsate ha dimostrato un flusso di rigurg...

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Discussione

L'induzione chirurgica dell'AR nel topo è una tecnica nuova e tecnicamente impegnativa, ma ha una significativa rilevanza traslazionale. Per padroneggiare la tecnica, un chirurgo dovrebbe almeno avere familiarità in anticipo con l'anatomia cervicale e cardiaca murina, la manipolazione del topo e l'ecocardiografia. L'uso efficiente nella misurazione emodinamica invasiva è un vantaggio. Per il successo del funzionamento dell'AR, è necessario prestare particolare attenzione a diversi pa...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia