Surcharge volumique cardiaque induite chirurgicalement par régurgitation aortique chez la souris

Résumé

Ce protocole présente un guide pratique sur la chirurgie de la création d’une régurgitation aortique (RA) chez la souris. L’évaluation de la souris RA par échocardiographie et mesure hémodynamique invasive récapitule ses caractéristiques cliniquement pertinentes de l’hypertrophie excentrique induite par une surcharge de volume, suggérant son application prometteuse dans l’étude de l’hypertrophie cardiaque.

Résumé

La régurgitation aortique (RA) est une cardiopathie valvulaire courante qui exerce une surcharge volumique sur le cœur et représente un problème de santé publique mondial. Bien que les souris soient largement utilisées pour faire la lumière sur les mécanismes des maladies cardiovasculaires, les modèles murins de RA, en particulier ceux induits par la chirurgie, sont encore rares. Ici, un modèle murin d’AR a été décrit en détail qui est induit chirurgicalement par la perturbation des valves aortiques lors d’une échocardiographie à haute résolution. Conformément au flux sanguin régurgité, les cœurs de souris AR présentent un phénotype de surcharge volumique distinctif et cliniquement pertinent, qui est caractérisé par une hypertrophie excentrique et un dysfonctionnement cardiaque, comme en témoigne l’évaluation échocardiographique et hémodynamique invasive. Notre proposition, de manière fiable et reproductible, fournit un guide pratique sur l’établissement et l’évaluation d’un modèle murin de RA pour de futures études sur les mécanismes moléculaires et les cibles thérapeutiques de la cardiomyopathie en surcharge volumique.

Introduction

En présence d’une surcharge volumique accrue (précharge) ou d’une surcharge de pression (postcharge), le cœur subit une hypertrophie, une condition appelée hypertrophie. Bien que l’hypertrophie cardiaque soit une réponse compensatoire pour maintenir la perfusion des organes périphériques avant l’insuffisance cardiaque, elle est également un facteur de risque indépendant pour les événements cardiovasculaires majeurs ^1,2. La surcharge volumique est l’une des manifestations importantes de l’augmentation des contraintes mécaniques. La surcharge volumique se produit pendant la diastole cardiaque et induit une hypertrophie cardiaque excentrique, qui n’est pas seulement couramment observée dans les maladies valvulaires, telles que la régurgitation aortique et la régurgitation mitrale, mais également dans la cardiopathie hypertensive en phase terminale, l’infarctus du myocarde, la cardiomyopathie dilatée et l’exercice excessif. De plus, en pratique clinique, certains médicaments qui peuvent mieux réduire l’hypertrophie myocardique induite par la surcharge de pression ont des effets insatisfaisants dans le traitement de l’hypertrophie myocardique induite par la surcharge volumique¹. Il est donc d’une grande importance de découvrir le mécanisme et les méthodes d’intervention du remodelage cardiaque excentrique causé par une surcharge volumique. Cependant, ces recherches sur la surcharge volumique ont été considérablement entravées pendant longtemps, ce qui peut être, en grande partie, attribué au manque de petits modèles animaux pouvant être facilement exploités, quantifiés efficacement et reproduits de manière stable³.

En ce qui concerne les espèces de petits animaux, les souris sont devenues l’animal modèle principal pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires en raison de leur cycle de vie court, de leur fonctionnement pratique, de leur génome clair et de leur facilité de modification génétique^. En termes de catégories de modèles, par rapport aux modèles de modification génétique et aux modèles traités par médicament, les modèles chirurgicaux présentent des avantages uniques évidents. Le modèle chirurgical peut éviter l’élevage excessif et laborieux de souris et l’identification des gènes qui sont nécessaires pour le modèle de modification génétique et peut également éviter les effets non spécifiques sur les tissus et organes extracardiaques qui sont difficiles à contrôler dans les modèles traités par médicament. Il a été documenté que le modèle murin de la dérivation aortocavale induit une surcharge volumique cardiaque dans la littérature antérieure⁵. Cependant, le shunt aorto-caveland représente une petite fraction de l’hypertrophie excentrique cardiaque en clinique et provoque une surcharge biventriculaire⁵, ce qui le rend peu significatif en termes de traduction pour être utilisé dans l’étude de l’hypertrophie excentrique ventriculaire gauche. Néanmoins, les cardiopathies valvulaires représentent un problème majeur de santé publique dans le monde entier ; On estime qu’environ 15 % de la population âgée de > 75 ans souffre d’un trouble valvulaire significatif⁶. Bien que la régurgitation aortique (RA) occupe une partie de la cardiopathie valvulaire, elle provoque distinctement une hypertrophie ventriculaire gauche (VG) excentrique en raison d’une augmentation de la surcharge volumique par le flux sanguin régurgitant ^7,8. Étant donné que l’artère carotide commune droite (RCCA) fournit une voie pour atteindre l’emplacement des valves aortiques, il est conceptuellement intrigant de perturber les valves aortiques via le RCCA pour provoquer un flux sanguin régurgitant chez la souris. Inspiré par les techniques de création d’un flux aortique oscillant⁹, un modèle murin de régurgitation aortique (RA) a récemment été établi dans notre laboratoire pour induire chirurgicalement une surcharge de volume⁷. Cette souris AR démontre une hypertrophie excentrique VG évidente, qui est une approche cliniquement transformatrice et démontre un grand potentiel translationnel pour l’étude du phénotype cardiaque surchargé et de son mécanisme sous-jacent. Ici, une procédure détaillée étape par étape a été décrite pour effectuer une chirurgie AR chez la souris, récapitulée par une échocardiographie à haute fréquence et une hémodynamique invasive pour assurer le succès de la chirurgie (Figure 1).

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Protocole

Ce protocole a reçu l’approbation éthique du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’hôpital de Zhongshan de l’Université Fudan, et suit les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (n° 85-23, révisé en 2011 ; National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis).

REMARQUE : Des expériences sur des animaux ont été réalisées sur des souris C57BL/6J mâles âgées de > 10 semaines. Le chirurgien dans ce protocole doit être habile dans la manipulation de l’échocardiographie murine, avant d’effectuer l’opération AR chez la souris. Cependant, dans la plupart des établissements de recherche, l’échocardiographie des petits rongeurs est opérée par une plate-forme, de sorte que le chirurgien peut collaborer étroitement avec des experts principaux, voire un chirurgien expérimenté en échocardiographie. L’expérience de la mesure hémodynamique invasive chez la souris est un plus.

1. Préparation à l’imagerie par ultrasons (obligatoire) et à la mesure hémodynamique invasive (facultative)

1. Démarrez l’échographe connecté à une sonde de 30 MHz. Réglez la plate-forme animale à ultrasons à température contrôlée dans la position de la vue de l’arc aortique, dans laquelle le côté droit de la souris est incliné vers le haut.
   REMARQUE : Il est recommandé de placer l’extrémité crânienne de la plate-forme animale d’échographie vers le chirurgien. Cependant, le fait que l’extrémité crânienne ou l’extrémité caudale soit vers le chirurgien devrait dépendre de celle avec laquelle le chirurgien se sent le plus à l’aise.
2. Connectez un micromanomètre (cathéter de pression) à l’appareil d’acquisition de données et au convertisseur analogique/numérique. Immergez la cuvette d’étalonnage du micromanomètre dans une solution saline pour l’étalonnage salin.
   REMARQUE : Si la condition le permet, un cathéter pression-volume peut également être utilisé. Nous utilisons un cathéter de pression parce que le dispositif d’acquisition de données de pression en laboratoire recueille des données de pression uniquement et n’a pas la capacité de collecter des données liées au volume, bien que les résultats échocardiographiques de l’étude actuelle puissent également délimiter les volumes VG.

2. Anesthésie des souris, préparation des dispositifs chirurgicaux et isolement du RCCA

REMARQUE : Les outils chirurgicaux doivent être stérilisés et autoclavés avant utilisation. Il est recommandé d’effectuer toutes les étapes dans des conditions aseptiques. Il est également recommandé d’effectuer l’épilation 1 jour à l’avance pour gagner du temps pendant la procédure d’imagerie, minimiser les réponses de stress indésirables potentielles chez les souris et garder la poitrine et les extrémités propres et sèches.

1. Anesthésie la souris dans la chambre à induction, qui est reliée à un vaporisateur réglé à 4 % d’isoflurane mélangé à 0,8 L/min d’oxygène. Lorsque la souris s’endort ou que le réflexe de pincement de la queue disparaît, retirez l’animal de la chambre d’induction.
2. Placez l’animal en position couchée sur une plaque de cuivre, qui est réchauffée par un coussin chauffant. Connectez son nez à un cône nasal, auquel 1,5 % d’isoflurane mélangé à 0,8 L/min d’oxygène est délivré pour maintenir un niveau constant d’anesthésie.
   REMARQUE : Une plaque de cuivre est recommandée car elle est pratique à nettoyer et est résistante à la rouille, bien qu’elle puisse être remplacée par un autre type de plaque métallique.
3. Placez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie et collez les extrémités sur la plaque de cuivre. Retirez les poils du cou et de la poitrine à l’aide d’une crème dépilatoire et nettoyez la zone épilée avec de l’éthanol à 75 %.
4. Préparez les outils chirurgicaux nécessaires, y compris diverses pinces et ciseaux (Figure 2A ; voir le tableau des matériaux).
5. Faites une incision médiane longitudinale, d’environ 1 cm, dans le cou avec une pince à pouce incurvée et des ciseaux droits, entre la mâchoire inférieure et le sternum.
6. Disséquez brutalement les parties gauche et droite de la glande thyroïde à l’aide de deux paires de pinces. À l’aide de la pince à pouce fine incurvée, séparez le muscle stemohyoideus et le tissu adipeux dans la région paratrachéale droite pour exposer le RCCA le plus longtemps possible. Évitez en tout temps de lécher le nerf vagal, car cela peut provoquer une hypotension, une bradycardie et la mort (Figure 2B).

3. Cathétérisme à travers le RCCA et l’aorte ascendante sous guidage échographique

1. Passez deux fils de soie 6-0 d’environ 5 cm chacun sous le récipient. Lissez le RCCA distal avec un nœud serré à l’aide d’un fil et fixez les deux extrémités du nœud serré à côté de la tête de l’animal pour maintenir une légère tension sur le RCCA. Cette action facilitera le cathétérisme dans les prochaines étapes.
2. Placez un nœud lâche sur le RCCA proximal à l’aide du deuxième fil. Cela remplit la région scellée du RCCA avec du sang, ce qui facilite l’incisation.
3. Utilisez de petits ciseaux pincés pour découper une ouverture en forme de coin, de 1 à 2 mm à proximité du nœud serré, pour ouvrir le RCCA. Assurez-vous que la taille de l’incision n’est ni trop petite pour insérer un cathéter, ni trop grande pour qu’elle se casse lors de l’insertion.
   REMARQUE : L’incision au microscope est fortement recommandée. Perforer un petit trou dans le récipient avec une aiguille de 26 G est une méthode alternative.
4. Préparez un cathéter en plastique contenant un fil métallique (Figure 2C). Étirez l’incision à l’aide d’une pince à attacher incurvée à longue main, insérez le cathéter en plastique contenant le fil métallique dans le RCCA et avancez jusqu’au nœud lâche.
5. Relâchez le nœud lâche pour faire avancer le cathéter et le fil d’environ 2 cm. Transférez la plaque de cuivre contenant l’animal sur la plate-forme d’échographie animale, appliquez du gel à ultrasons sur le cou et la poitrine de la souris, puis faites passer soigneusement le cathéter et le fil à travers le RCCA et l’aorte ascendante sous guidage échographique.

4. Ponction des valves aortiques sous guidage échographique

1. Collectez les données d’échographie basale en mode Doppler couleur et en mode Doppler à ondes de pouls avant que le cathéter en plastique et le fil métallique n’atteignent l’orifice aortique.
2. Avec l’échographie montrant simultanément et clairement l’aorte ascendante, la voie d’éjection du VG, le cathéter et le fil, lorsque le cathéter et le fil atteignent l’orifice aortique, faites saillir l’extrémité du fil du cathéter et percez les valves aortiques (Figure 1).
   REMARQUE : Lorsque la valve aortique est perforée, le chirurgien devrait être en mesure de détecter cette rupture.
3. Retirez légèrement le cathéter et le fil de l’orifice aortique et collectez des données d’échographie post-perforation en mode Doppler couleur et en mode Doppler à ondes de pouls après la ponction des valves aortiques. Le flux régurgitant est de couleur rouge pendant la diastole cardiaque en mode Doppler couleur et peut être confirmé quantitativement en mode Doppler à ondes de pouls.
4. Considérez une vitesse diastolique maximale de l’écoulement aortique (PSVa) comprise entre 300 et 500 mm/s comme satisfaisante. Si le débit sanguin régurgitant n’est pas satisfaisant, répétez l’étape 4.2.
5. Facultatif : Appliquer un micromanomètre avant et immédiatement après la perforation des valves aortiques pour confirmer l’existence d’un écoulement régurgissant. Pour vérifier, la pression aortique en fin de diastolique (AEDP) est abaissée et la pression du pouls aortique est augmentée d’environ 20 mmHg.
   REMARQUE : Une description détaillée de la façon d’utiliser un cathéter micromanométrique pour effectuer une mesure hémodynamique invasive du VG a été élégamment présentée ailleurs^10,11.

5. Retrait du cathéter en plastique et du fil métallique, et soins périopératoires

1. Retirez le gel à ultrasons et séchez la souris avec de la gaze ou du tissu stérile après confirmation de la perforation réussie des valves aortiques, puis retirez soigneusement le cathéter en plastique avec le fil métallique central, avant la ligature du RCCA.
2. Fermez la peau à l’aide d’une suture en soie 5-0 dans un motif de suture continu et appliquez une solution de povidone iodée sur le site de suture. Administrez à la souris du méloxicam (0,13 mg) par voie sous-cutanée pour l’analgésie et placez la souris dans une cage préchauffée sous une lumière chauffante jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée pour la récupération.

6. Chirurgie simulée

1. Effectuez les sections 1 à 3 comme décrit. Pour la souris simulée, effectuez des procédures similaires à celles de la section 4 sans perturber les valves aortiques.
2. Effectuez la section 5 comme décrit, bien que l’AR ne doive être présent chez aucune des souris fonctionnant avec un simulacre.

7. Évaluation de la perforation de la valve aortique, de la morphologie cardiaque et de la fonction à l’aide de l’échocardiographie et de la mesure hémodynamique invasive

1. Après 4 semaines d’AR, utilisez le mode B échocardiographique, le mode Doppler couleur et le mode Doppler à ondes de pouls pour évaluer le flux sanguin de l’arc aortique dans la vue de l’arc aortique, et mesurez la PDVa, conformément à l’étape 4.1 et ailleurs ^1,12.
2. Utilisez le mode B et le mode M échocardiographiques pour évaluer la dimension et la contractilité du VG dans la vue parasternale grand axe, avec les dimensions de fin diastolique (LVEDD) et de fin systolique (LVESD), d’épaisseur de la paroi postérieure du VG de fin de diastolique (LVPWTd) et de fin systolique (LVPWT), de fraction d’éjection du VG (LVEF) et de raccourcissement fractionnel (LVFS) dérivées.
   REMARQUE : Une description détaillée de l’utilisation de l’appareil à ultrasons et de la manipulation des vues échographiques a été élégamment décrite précédemment¹².
3. Après l’imagerie échocardiographique, effectuer une mesure hémodynamique invasive, d’une manière similaire à l’étape 4.3 et ailleurs¹⁰. Enregistrez la vitesse maximale de contraction et de relaxation (+dp/dt et −dp/dt). Insérez le micromanomètre dans l’artère carotide commune gauche (LCCA, et non RCCA), car la RCCA a été ligaturée de façon permanente pendant la chirurgie AR.
4. Après la mesure hémodynamique invasive, euthanasier la souris via une luxation cervicale. Ouvrez la poitrine, rincez le cœur avec du formol à 10 %, suivi d’une solution de chlorure de sodium à 0,9 %, excisez le cœur en coupant l’aorte et sectionnez transversalement au niveau du bord inférieur du pavillon gauche. Acquisition d’images à l’aide de la microscopie optique.

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Résultats

Pour garantir une RA réussie, nous avons validé le flux sanguin régurgitant à l’aide d’un Doppler couleur et d’une échocardiographie Doppler à ondes de pouls. Chez les souris atteintes d’AR, le spectre Doppler couleur de l’arc aortique a montré un flux régurgitant (rouge) immédiatement après l’opération, ce qui était absent chez les souris fictives (pas de flux en diastole ; Figure 3A). De manière constante, le Doppler à ondes de po...

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Discussion

L’induction chirurgicale de l’AR chez la souris est une nouvelle technique techniquement difficile, mais qui présente une pertinence translationnelle importante. Pour maîtriser la technique, un chirurgien doit au moins connaître à l’avance l’anatomie cervicale et cardiaque murine, le maniement des souris et l’échocardiographie. Une utilisation habile dans la mesure hémodynamique invasive est un plus. Pour un fonctionnement réussi de la RA, une attention particulière doi...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia