マウスの大動脈弁逆流による外科的誘発心電量過負荷

要約

このプロトコルは、マウスの大動脈弁逆流 (AR) を作成するための手術に関する実践的なガイドを提供します。心エコー検査と侵襲的血行動態測定によるARマウスの評価は、ボリュームオーバーロード誘発偏心肥大の臨床的に関連する特性を再現し、心肥大の研究におけるその有望な応用を示唆しています。

要約

大動脈弁閉鎖不全症(AR)は、心臓にボリューム過負荷を及ぼし、世界的な公衆衛生問題を表す一般的な心臓弁膜症です。マウスは心血管疾患のメカニズムを解明するために広く応用されていますが、ARのマウスモデル、特に手術によって誘導されるモデルはまだ不足しています。ここでは、高解像度心エコー検査下で大動脈弁の破壊によって外科的に誘発されるARのマウスモデルが詳細に説明されました。逆流した血流に従って、ARマウスの心臓は、心エコー検査および侵襲的血行動態評価によって証明されるように、偏心肥大および心機能障害を特徴とする、独特で臨床的に関連するボリュームオーバーロード表現型を示します。私たちの提案は、信頼性と再現性のある方法で、ARのマウスモデルの確立と評価に関する実用的なガイドを提供します ボリュームオーバーロード心筋症の分子メカニズムと治療標的に関する将来の研究のために。

概要

体積過負荷(前負荷)または圧力過負荷(後負荷)の増加があると、心臓は肥大する、肥大と呼ばれる状態になります。心肥大は、心不全の前に末梢臓器の灌流を維持するための代償反応ですが、主要な心血管イベントの独立した危険因子でもあります^1,2。ボリュームオーバーロードは、機械的ストレスの増加の重要な兆候の1つです。ボリュームオーバーロードは、心拡張期に起こり、偏心心肥大を誘発しますが、これは大動脈弁閉鎖不全症や僧帽弁閉鎖不全症などの弁疾患だけでなく、末期高血圧性心疾患、心筋梗塞、拡張型心筋症、過度の運動にもよく見られます。さらに、臨床診療では、圧力過負荷によって誘発される心筋肥大をよりよく軽減できるいくつかの薬物は、容積過負荷¹によって誘発される心筋肥大の治療において不十分な効果を持っています。したがって、ボリュームオーバーロードによって引き起こされる偏心心臓リモデリングのメカニズムと介入方法を発見することは非常に重要です。しかし、このような体積過負荷に関する研究は長い間大きく妨げられてきましたが、これは主に、簡単に操作でき、効率的に定量化され、安定して複製できる小動物モデルが不足していることに起因している可能性があります³。

小動物種については、マウスはライフサイクルが短いこと、操作が容易であること、ゲノムが明瞭であること、遺伝子組換えが容易であることなどから、循環器疾患研究の主流モデル動物となっています⁴。モデルカテゴリーに関しては、遺伝子組換えモデルや薬物治療モデルと比較して、手術モデルには明らかな独自の利点があります。手術モデルは、遺伝子改変モデルに必要な過剰で手間のかかるマウスの育種や遺伝子同定を回避でき、また、薬物治療モデルでは制御が困難な心臓外組織や臓器への非特異的な影響も回避できます。大動脈シャントのマウスモデルは、以前の文献5で心容積過負荷を誘発することが文書化^{されています。}ただし、大動脈シャントは、クリニックの心臓偏心肥大のごく一部を占め、両心室過負荷⁵ を引き起こし、左心室偏心肥大研究で使用する翻訳的重要性はほとんどありません。それにもかかわらず、心臓弁膜症は世界中で主要な公衆衛生問題を表しています。人口の約15%>75歳が重大な弁膜症を患っていると推定されています⁶。大動脈弁閉鎖不全症(AR)は心臓弁膜症の一部を占めていますが、逆流血流による体積過負荷の増加により、偏心左心室(LV)肥大を特徴的に引き起こします^7,8。右総頸動脈(RCCA)が大動脈弁の位置に到達する経路を提供することを考えると、RCCAを介して大動脈弁を破壊し、マウスに逆流性血流を引き起こすことは概念的に興味深いです。振動性大動脈流⁹を作り出す技術に触発されて、最近、私たちの研究室では、ボリュームオーバーロード⁷を外科的に誘発するための大動脈弁逆流(AR)のマウスモデルが確立されました。このARマウスは、臨床的に変革的なアプローチであり、過負荷の心臓表現型とその根底にあるメカニズムを研究するための大きな翻訳の可能性を示す、明らかなLV偏心肥大を示しています。ここでは、マウスでAR手術を行うための詳細な段階的な手順について説明し、高周波心エコー検査と侵襲的血行動態によって再現して、手術の成功を確実にしました(図1)。

プロトコル

このプロトコルは、復旦大学中山病院の動物管理および使用委員会から倫理的承認を受けており、実験動物の世話と使用に関するガイド(No.85-23、2011年改訂;国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国)。

注:動物実験は、10週齢の雄C57BL/6Jマウスで行いました>。このプロトコルの外科医は、マウスでAR手術を行う前に、マウス心エコー検査の操作に熟練している必要があります。しかし、ほとんどの研究機関では、小型のげっ歯類の心エコー検査は中核施設で運営されているため、外科医は心エコー検査の経験豊富な外科医ではないにしても、中核的な専門家と密接に協力することができます。マウスでの侵襲的な血行動態測定の経験があれば尚可。

1. 超音波画像診断(必須)および侵襲的血行動態測定(オプション)の準備

1. 30MHzプローブに接続された超音波装置を起動します。温度制御された超音波動物プラットフォームを、マウスの右側を上に傾ける大動脈弓ビューの位置に設定します。
   注:超音波動物プラットフォームの頭蓋端は外科医に向けて配置することをお勧めします。ただし、頭蓋端と尾端のどちらが外科医の方を向いているかは、外科医がどちらに快適だと感じるかに依存する必要があります。
2. マイクロマノメーター(圧力カテーテル)をデータ収集装置とアナログ/デジタルコンバーターに接続します。マイクロマノメーターのキャリブレーションキュベットを生理食塩水に浸して、生理食塩水のキャリブレーションを行います。
   注:条件が許せば、圧力容量カテーテルも使用できます。ラボの圧力データ収集デバイスは圧力のみのデータを収集し、体積関連のデータを収集する能力がないため、圧力カテーテルを使用しますが、現在の研究の心エコー検査の結果ではLVボリュームも描写できます。

2. マウスの麻酔、手術器具の作製、RCCAの単離

注:手術器具は、使用前に滅菌およびオートクレーブする必要があります。すべてのステップは、無菌条件下で実行することをお勧めします。また、イメージング手順の時間を節約し、マウスの望ましくないストレス反応を最小限に抑え、胸部と四肢を清潔で乾燥した状態に保つために、脱毛を1日前に行うことをお勧めします。

1. 4% イソフルランに 0.8 L/min の酸素を混合した気化器に接続された誘導チャンバーでマウスに麻酔をかけます。マウスが眠りに落ちたり、尾のつまみ反射が消えたりしたら、動物を誘導室から取り出します。
2. 動物を銅板の上に仰臥位に置き、銅板を加熱パッドで温めます。鼻をノーズコーンに接続し、1.5%イソフルランと0.8L / minの酸素を混合して、麻酔を一定レベルに維持します。
   注:銅板はお手入れが便利で防錆性があるため、銅板をお勧めしますが、別の種類の金属板と交換することもできます。
3. 麻酔下での乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に置き、四肢を銅板にテープで固定します。脱毛クリームを使用して首と胸の毛を取り除き、脱毛した部分を75%エタノールできれいにします。
4. さまざまな鉗子やはさみなど、必要な手術器具を準備します(図2A; 材料の表を参照)。
5. 下顎と胸骨の間に、湾曲した親指鉗子とまっすぐなハサミを使用して、首に縦方向の中央値を約1cm切開します。
6. 甲状腺の左右の部分を2対の鉗子を使用して鈍く解剖します。湾曲した細い親指鉗子で、右の傍気管領域のステモヒョイデウス筋と脂肪組織を分離して、RCCAをできるだけ長く露出させます。迷走神経の損傷は、低血圧、徐脈、および死を引き起こす可能性があるため、常に避けてください(図2B)。

3. RCCAによるカテーテル法と超音波下での上行大動脈

1. 容器の下に、それぞれ約5cmの6-0の絹糸を2本通します。遠位RCCAを1本の糸を使用してきつく結び目で結紮し、きつい結び目の両端を動物の頭の隣に固定して、RCCAの軽い張力を維持します。このアクションは、次のステップでのカテーテル挿入を容易にします。
2. 2番目のスレッドを使用して、近位RCCAに緩い結び目を置きます。これにより、RCCAの密閉された領域が血液で満たされ、切開が容易になります。
3. 小さなピンチハサミを使用して、タイトノットの近位に1〜2 mmのくさび形の開口部を切り取り、RCCAを開きます。切開部のサイズがカテーテルを挿入するには小さすぎたり、挿入中に折れたりしないようにしてください。
   注:顕微鏡下での切開を強くお勧めします。容器の小さな穴に26Gの針を刺すのも一つの方法です。
4. 金属線を含むプラスチックカテーテルを準備します(図2C)。手持ちの湾曲した結束鉗子で切開部を伸ばし、RCCAに金属線が入ったプラスチックカテーテルを挿入し、緩い結び目まで前進させます。
5. 緩んだ結び目をほぐして、カテーテルとワイヤーを約2cm進めます。動物を含む銅板を超音波動物プラットフォームに移し、マウスの首と胸部に超音波ゲルを塗布し、次にカテーテルとワイヤーをRCCAと上行大動脈を通して超音波ガイド下で慎重に前進させます。

4.超音波ガイド下での大動脈弁の穿刺

1. プラスチックカテーテルと金属線が大動脈開口部に到達する前に、カラードップラーモードとパルス波ドップラーモードで基礎超音波データを収集します。
2. 超音波で上行大動脈、LV流出路、カテーテル、ワイヤーが同時にはっきりと見えると、カテーテルとワイヤーが大動脈口に到達すると、ワイヤーの先端がカテーテルから突き出て大動脈弁に穴を開けます(図1)。
   注:大動脈弁が穿孔されている場合、外科医はこの破損を感知できるはずです。
3. カテーテルとワイヤーを大動脈開口部からわずかに後退させ、大動脈弁の穿刺後にカラードップラーモードとパルス波ドップラーモードで穿孔後の超音波データを収集します。カラードップラーモードでは、心拡張期の逆流流は赤色で、脈波ドップラーモードでは定量的に確認できます。
4. 大動脈流の拡張期ピーク速度 (PSVa) が 300 から 500 mm/s の間であれば十分と考えてください。血流の逆流度が不十分な場合は、手順4.2を繰り返します。
5. オプション:大動脈弁の穿孔前と直後にマイクロマノメーターを適用して、逆流流の存在をさらに確認します。確認するために、大動脈拡張末期圧(AEDP)が低下し、大動脈脈圧が約20mmHg上昇します。
   注:マイクロマノメーターカテーテルを使用して侵襲的なLV血行動態測定を行う方法の詳細な説明は、他の場所でエレガントに提示されています^10,11。

5. プラスチックカテーテルと金属線の抜去、周術期ケア

1. 超音波ゲルを取り外し、大動脈弁の穿孔が成功したことを確認した後、マウスを滅菌ガーゼまたは組織で乾燥させ、RCCAの結紮前に中央の金属ワイヤーでプラスチックカテーテルを慎重に引き抜きます。
2. 5-0シルク縫合糸を使用して連続縫合パターンで皮膚を閉じ、縫合部位にポビドンヨード溶液を塗布します。鎮痛のためにマウスにメロキシカム(0.13 mg)を皮下投与し、マウスを完全に覚醒するまで温めた光の下で予め温めたケージにマウスを置きます。

6.偽の手術

1. 説明されているように、セクション 1 から 3 を実行します。偽操作マウスの場合は、大動脈弁を壊さずにセクション4と同様の手順を実行します。.
2. 説明されているようにセクション5を実行しますが、ARは偽の操作マウスのいずれにも存在すべきではありません。

7. 心エコー検査と侵襲的血行動態測定による大動脈弁穿孔、心臓形態、機能の評価

1. AR の 4 週間後、心エコー検査 B モード、カラー ドップラー モード、および脈波ドップラー モードを使用して、大動脈弓ビューで大動脈弓の血流を評価し、ステップ 4.1 およびその他の場所 ^1,12 に従って PDVa を測定します。
2. 心エコー検査 B モードと M モードを使用して、胸骨傍長軸ビューで LV 寸法と収縮性を評価します。左室拡張末期 (LVEDD) および収縮末期 (LVESD) の寸法、左室後壁拡張末期 (LVPWTd) および収縮末期 (LVPWT) の厚さ、左室駆出率 (LVEF)、および分数短縮 (LVFS) が導き出されます。
   注:超音波装置の使用方法と超音波ビューの操作の詳細な説明は、以前にエレガントに説明されています¹²。
3. 心エコーイメージングの後、ステップ4.3および他の^{場所と同様の}方法で侵襲的な血行動態測定を行います10。最大収縮速度と緩和速度(+dp/dtおよび-dp/dt)を記録します。マイクロマノメーターは、AR手術中にRCCAが永久的に結紮されたため、左総頸動脈(RCCAではなくLCCA)に挿入します。
4. 侵襲的な血行動態測定の後、子宮頸部脱 臼を介して マウスを安楽死させます。胸を開き、心臓を10%ホルマリンで洗い流し、続いて0.9%塩化ナトリウム溶液で洗い流し、大動脈を切開して心臓を切除し、左耳介の下縁のレベルで横切片にします。光学顕微鏡を使用して画像を取得します。

結果

ARの成功を保証するために、カラードップラーと脈波ドップラー心エコー法を使用して逆流性の血流を検証しました。ARのマウスでは、大動脈弓のカラードップラースペクトルは、手術直後に逆流流(赤)を示しましたが、これは偽マウスには見られませんでした(拡張期には流れがありません。図3A)。一貫して、パルス波ドップラーはARマウスで堅...

ディスカッション

マウスへのARの外科的導入は、技術的に困難な新しい技術ですが、翻訳には大きな関連性があります。この技術を習得するには、外科医は少なくともマウスの頸部と心臓の解剖学、マウスの取り扱い、および心エコー検査に事前に精通している必要があります。侵襲的な血行動態測定における巧みな操作はプラスです。AR操作を成功させるには、いくつかの重要なス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia