Sobrecarga de volumen cardíaco inducida quirúrgicamente por regurgitación aórtica en ratón

Resumen

Este protocolo presenta una guía práctica sobre la cirugía para la creación de regurgitación aórtica (RA) en el ratón. La evaluación del ratón RA mediante ecocardiografía y medición hemodinámica invasiva recapitula sus características clínicamente relevantes de hipertrofia excéntrica inducida por sobrecarga de volumen, lo que sugiere su prometedora aplicación en el estudio de la hipertrofia cardíaca.

Resumen

La regurgitación aórtica (RA) es una enfermedad valvular común que ejerce una sobrecarga de volumen sobre el corazón y representa un problema de salud pública mundial. Aunque los ratones se aplican ampliamente para arrojar luz sobre los mecanismos de las enfermedades cardiovasculares, los modelos de ratón de RA, especialmente los inducidos por la cirugía, siguen siendo escasos. Aquí, se describió en detalle un modelo murino de RA que es inducido quirúrgicamente por la ruptura de las válvulas aórticas bajo ecocardiografía de alta resolución. De acuerdo con el flujo sanguíneo regurgitado, los corazones de ratón AR presentan un fenotipo de sobrecarga de volumen distintivo y clínicamente relevante, que se caracteriza por hipertrofia excéntrica y disfunción cardíaca, como lo demuestra la evaluación ecocardiográfica y hemodinámica invasiva. Nuestra propuesta, de forma fiable y reproducible, proporciona una guía práctica sobre el establecimiento y evaluación de un modelo murino de RA para futuros estudios sobre mecanismos moleculares y dianas terapéuticas de la miocardiopatía por sobrecarga de volumen.

Introducción

En presencia de una sobrecarga de volumen aumentada (precarga) o una sobrecarga de presión (poscarga), el corazón sufre un agrandamiento, una afección denominada hipertrofia. A pesar de que la hipertrofia cardíaca es una respuesta compensatoria para mantener la perfusión de los órganos periféricos antes de la insuficiencia cardíaca, también es un factor de riesgo independiente para eventos cardiovasculares mayores ^1,2. La sobrecarga de volumen es una de las manifestaciones importantes del aumento de la tensión mecánica. La sobrecarga de volumen ocurre durante la diástole cardíaca e induce hipertrofia cardíaca excéntrica, que no solo se observa comúnmente en enfermedades valvulares, como la regurgitación aórtica y la regurgitación mitral, sino también en la enfermedad cardíaca hipertensiva terminal, infarto de miocardio, miocardiopatía dilatada y ejercicio excesivo. Además, en la práctica clínica, algunos fármacos que pueden reducir mejor la hipertrofia miocárdica inducida por sobrecarga de presión tienen efectos insatisfactorios en el tratamiento de la hipertrofia miocárdica inducida por sobrecarga de volumen¹. Por lo tanto, es de gran importancia descubrir el mecanismo y los métodos de intervención de la remodelación cardíaca excéntrica causada por la sobrecarga de volumen. Sin embargo, este tipo de investigación sobre la sobrecarga de volumen se ha visto obstaculizada significativamente durante mucho tiempo, lo que puede atribuirse, en gran parte, a la falta de modelos de animales pequeños que puedan ser fácilmente operados, cuantificados de manera eficiente y replicados de manera estable³.

En cuanto a las especies de animales pequeños, los ratones se han convertido en el principal animal modelo para la investigación de enfermedades cardiovasculares debido a su corto ciclo de vida, operación conveniente, genoma claro y facilidad de modificación genética. En términos de categorías de modelos, en comparación con los modelos de modificación genética y los modelos tratados con fármacos, los modelos quirúrgicos tienen ventajas únicas obvias. El modelo quirúrgico puede evitar la excesiva y laboriosa cría de ratones y la identificación de genes que son necesarios para el modelo de modificación genética y también puede evitar los efectos inespecíficos sobre tejidos y órganos extracardíacos que son difíciles de controlar en los modelos tratados con fármacos. En la literatura previa, se ha documentado que el modelo murino de derivación aortocava induce una sobrecarga del volumen cardíaco⁵. Sin embargo, la derivación aortocava representa una pequeña fracción de la hipertrofia excéntrica cardíaca en la clínica y causa sobrecarga biventricular⁵, por lo que tiene poca importancia traslacional para ser utilizada en el estudio de la hipertrofia excéntrica del ventrículo izquierdo. Sin embargo, la valvulopatía representa un importante problema de salud pública a nivel mundial; Se estima que alrededor del 15% de la población >75 años tiene un trastorno valvular significativo⁶. A pesar de que la regurgitación aórtica (RA) ocupa una parte de la valvulopatía, causa distintivamente hipertrofia excéntrica del ventrículo izquierdo (VI) debido a un aumento de la sobrecarga de volumen por el flujo sanguíneo regurgitante ^7,8. Teniendo en cuenta que la arteria carótida común derecha (RCCA) proporciona una ruta para llegar a la ubicación de las válvulas aórticas, es conceptualmente intrigante interrumpir las válvulas aórticas a través de la RCCA para causar un flujo sanguíneo regurgitante en ratones. Inspirado en las técnicas de creación de flujo aórtico oscilante⁹, recientemente se estableció en nuestro laboratorio un modelo de ratón de regurgitación aórtica (RA) para inducir quirúrgicamente una sobrecarga de volumen⁷. Este ratón AR demuestra una hipertrofia excéntrica obvia del VI, que es un enfoque clínicamente transformador y demuestra un gran potencial traslacional para estudiar el fenotipo del corazón sobrecargado y su mecanismo subyacente. Aquí, se describió un procedimiento detallado paso a paso para realizar la cirugía de RA en ratones, recapitulado por ecocardiografía de alta frecuencia y hemodinámica invasiva para garantizar el éxito de la cirugía (Figura 1).

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Protocolo

Este protocolo ha recibido la aprobación ética del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan, y sigue las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (No. 85-23, revisada en 2011; Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

NOTA: Se realizaron experimentos en animales con ratones machos C57BL/6J >10 semanas de edad. El cirujano en este protocolo debe ser hábil en la manipulación de la ecocardiografía murina, antes de realizar la operación de RA en el ratón. Sin embargo, en la mayoría de las instituciones de investigación, la ecocardiografía de pequeños roedores es operada por una instalación central, por lo que el cirujano puede colaborar estrechamente con los expertos principales, si no con un cirujano experimentado en ecocardiografía. Se valorará la experiencia en la medición hemodinámica invasiva en ratones.

1. Preparación para la ecografía (obligatorio) y la medición hemodinámica invasiva (opcional)

1. Ponga en marcha el ecógrafo conectado a una sonda de 30 MHz. Coloque la plataforma de ultrasonido controlado por temperatura en la posición para la vista del arco aórtico, en la que el lado derecho del mouse está inclinado hacia arriba.
   NOTA: Se recomienda que el extremo craneal de la plataforma del animal de ultrasonido se coloque hacia el cirujano. Sin embargo, el hecho de que el extremo craneal o el extremo caudal esté hacia el cirujano debe depender de con cuál se sienta más cómodo.
2. Conecte un micromanómetro (catéter de presión) al dispositivo de adquisición de datos y al convertidor analógico/digital. Sumerja la cubeta de calibración del micromanómetro en solución salina para la calibración con solución salina.
   NOTA: Si la condición lo permite, también se puede usar un catéter de presión-volumen. Utilizamos un catéter de presión porque el dispositivo de adquisición de datos de presión en el laboratorio recopila datos solo de presión y no tiene la capacidad de recopilar datos relacionados con el volumen, aunque los resultados ecocardiográficos en el estudio actual también pueden delinear los volúmenes del VI.

2. Anestesia de ratones, preparación de dispositivos quirúrgicos y aislamiento del RCCA

NOTA: Las herramientas quirúrgicas deben esterilizarse y esterilizarse en autoclave antes de su uso. Se recomienda que todos los pasos se realicen en condiciones asépticas. También se recomienda que la depilación se realice con 1 día de anticipación para ahorrar tiempo durante el procedimiento de imagen, minimizar las posibles respuestas al estrés no deseadas en los ratones y mantener el pecho y las extremidades limpios y secos.

1. Anestesia al ratón en la cámara de inducción, que está conectada a un vaporizador ajustado al 4% de isoflurano mezclado con 0,8 L/min de oxígeno. Cuando el ratón se duerma o desaparezca el reflejo de pellizco de la cola, retire al animal de la cámara de inducción.
2. Coloque al animal en posición supina sobre una placa de cobre, que se calienta con una almohadilla térmica. Conecte su nariz a un cono nasal, al que se le suministra isoflurano al 1,5% mezclado con 0,8 L/min de oxígeno para mantener un nivel constante de anestesia.
   NOTA: Se recomienda una placa de cobre, ya que es conveniente de limpiar y es resistente a la oxidación, aunque puede ser reemplazada por otro tipo de placa de metal.
3. Coloque ungüento oftálmico en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia y pegue las extremidades con cinta adhesiva a la placa de cobre. Eliminar el vello del cuello y el escote con crema depilatoria y limpiar la zona depilada con etanol al 75%.
4. Prepare las herramientas quirúrgicas necesarias, incluyendo varias pinzas y tijeras (Figura 2A; ver Tabla de Materiales).
5. Realice una incisión mediana longitudinal, alrededor de 1 cm, en el cuello con pinzas de pulgar curvadas y tijeras rectas, entre la mandíbula inferior y el esternón.
6. Diseccione sin rodeos la parte izquierda y derecha de la glándula tiroides con dos pares de fórceps. Con las pinzas de pulgar fino curvadas, separe el músculo stemohioideo y el tejido graso en la región paratraqueal derecha para exponer el RCCA durante el mayor tiempo posible. Evite lesionar el nervio vago en todo momento, ya que esto puede causar hipotensión, bradicardia y la muerte (Figura 2B).

3. Cateterismo a través del RCCA y aorta ascendente bajo guía ecográfica

1. Pase dos hilos de seda 6-0, de unos 5 cm cada uno, por debajo del recipiente. Limine el RCCA distal con un nudo apretado usando una rosca y fije los dos extremos del nudo apretado junto a la cabeza del animal para mantener una tensión ligera en el RCCA. Esta acción facilitará el cateterismo en las próximas etapas.
2. Coloque un nudo suelto en el RCCA proximal usando la segunda rosca. Esto llena de sangre la región sellada del RCCA, lo que facilita la incisión.
3. Utilice unas tijeras pequeñas para cortar una abertura en forma de cuña, 1-2 mm proximal al nudo apretado, para abrir el RCCA. Asegúrese de que el tamaño de la incisión no sea demasiado pequeño para insertar un catéter, ni demasiado grande para que se rompa durante la inserción.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente la incisión bajo un microscopio. Perforar un pequeño orificio en el vaso con una aguja de 26 G es un método alternativo.
4. Prepare un catéter de plástico que contenga un alambre metálico (Figura 2C). Estire la incisión con pinzas de atado curvas de mano larga, inserte el catéter de plástico que contiene el alambre metálico en el RCCA y avance hasta el nudo suelto.
5. Alivie el nudo suelto para avanzar el catéter y el alambre alrededor de 2 cm. Transfiera la placa de cobre que contiene al animal a la plataforma de ultrasonido para animales, aplique gel de ultrasonido en el cuello y el pecho del ratón y, a continuación, avance con cuidado el catéter y el cable a través del RCCA y la aorta ascendente bajo la guía de ultrasonido.

4. Punción de las válvulas aórticas bajo guía ecográfica

1. Recopile datos de ultrasonido basal en modo Doppler color y modo Doppler de onda de pulso antes de que el catéter de plástico y el alambre metálico lleguen al orificio aórtico.
2. Con la ecografía que muestra simultánea y claramente la aorta ascendente, el tracto de salida del VI, el catéter y el alambre, cuando el catéter y el alambre alcanzan el orificio aórtico, sobresalen la punta del alambre del catéter y perforan las válvulas aórticas (Figura 1).
   NOTA: Cuando la válvula aórtica está perforada, el cirujano debe ser capaz de sentir esta rotura.
3. Retirar ligeramente el catéter y el alambre del orificio aórtico y recoger los datos de la ecografía posterior a la perforación en modo Doppler color y Doppler de onda de pulso después de la punción de las válvulas aórticas. El flujo regurgitante es de color rojo durante la diástole cardíaca en modo Doppler color y puede confirmarse cuantitativamente en modo Doppler de onda de pulso.
4. Considerar satisfactoria una velocidad diastólica máxima del flujo aórtico (PSVa) entre 300-500 mm/s. Si el grado de regurgitación del flujo sanguíneo no es satisfactorio, repita el paso 4.2.
5. Opcional: Aplicar un micromanómetro antes e inmediatamente después de la perforación de las válvulas aórticas para confirmar aún más la existencia de flujo regurgitante. Para comprobarlo, tanto la presión diastólica final aórtica (PAEDA) está deprimida como la presión del pulso aórtico aumenta en unos 20 mmHg.
   NOTA: Una descripción detallada de cómo utilizar un catéter micromanómetro para realizar la medición hemodinámica invasiva del VI se ha presentado elegantemente en otro lugar^10,11.

5. Retirada del catéter de plástico y del alambre metálico, y cuidados perioperatorios

1. Retire el gel de ultrasonido y seque el ratón con una gasa estéril o un pañuelo de papel después de la confirmación de la perforación exitosa de las válvulas aórticas, luego retire cuidadosamente el catéter de plástico con el alambre metálico central, antes de la ligadura del RCCA.
2. Cierre la piel con una sutura de seda 5-0 en un patrón de sutura continuo y aplique una solución de povidona yodada en el sitio de la sutura. Administre al ratón meloxicam (0,13 mg) por vía subcutánea para la analgesia y coloque al ratón en una jaula precalentada bajo una luz cálida hasta que esté completamente despierto para su recuperación.

6. Cirugía simulada

1. Realice las secciones 1 a 3 como se describe. En el caso del ratón operado de forma simulada, se deben realizar procedimientos similares a los de la sección 4 sin alterar las válvulas aórticas.
2. Realice la sección 5 como se describe, aunque la RA no debe estar presente en ninguno de los ratones operados de forma simulada.

7. Evaluación de la perforación de la válvula aórtica, morfología cardíaca y función mediante ecocardiografía y medición hemodinámica invasiva

1. Después de 4 semanas de RA, utilice el modo B ecocardiográfico, el modo Doppler color y el modo Doppler de onda de pulso para evaluar el flujo sanguíneo del arco aórtico en la vista del arco aórtico y medir el PDVa, de acuerdo con el paso 4.1 y en otros lugares ^1,12.
2. Utilice el modo B y el modo M ecocardiográficos para evaluar la dimensión y la contractilidad del VI en la vista del eje largo paraesternal, con las dimensiones diastólica final del VI (DAVI) y sistólica final (DSVI), el grosor telediastólico de la pared posterior del VI (LVPWTd) y telesistólica (LVPWT), la fracción de eyección del VI (FEVI) y el acortamiento fraccional (FEVI).
   NOTA: Una descripción detallada de cómo utilizar la máquina de ultrasonido y la manipulación de las vistas de ultrasonido se ha descrito elegantemente^{anteriormente 12}.
3. Después de la imagen ecocardiográfica, realizar la medición hemodinámica invasiva, de manera similar al paso 4.3 y en otros lugares¹⁰. Registre la velocidad máxima de contracción y relajación (+dp/dt y −dp/dt). Inserte el micromanómetro en la arteria carótida común izquierda (LCCA, no RCCA), ya que la RCCA quedó ligada permanentemente durante la cirugía de RA.
4. Después de la medición hemodinámica invasiva, eutanasia al ratón mediante luxación cervical. Abra el tórax, enjuague el corazón con formalina al 10%, seguido de una solución de cloruro de sodio al 0,9%, extirpe el corazón cortando la aorta y corte transversalmente a nivel del margen inferior de la aurícula izquierda. Adquisición de imágenes mediante microscopía óptica.

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Resultados

Para garantizar el éxito de la RA, validamos el flujo sanguíneo regurgitante mediante Doppler color y ecocardiografía Doppler de onda de pulso. En ratones con RA, el espectro Doppler color del arco aórtico mostró flujo regurgitante (rojo) inmediatamente después de la operación, que estaba ausente en ratones simulados (sin flujo en la diástole; Figura 3A). Consistentemente, el Doppler de onda de pulso demostró un flujo regurgitante robusto y elevado ...

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Discusión

La inducción quirúrgica de la RA en el ratón es una técnica nueva y técnicamente desafiante, pero tiene una relevancia traslacional significativa. Para dominar la técnica, un cirujano debe estar familiarizado de antemano con la anatomía cervical y cardíaca murina, el manejo de ratones y la ecocardiografía. Se valorará el manejo hábil en la medición hemodinámica invasiva. Para un funcionamiento exitoso de AR, se debe tener especial cuidado en varios pasos críticos.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia