Chirurgisch induzierte kardiale Volumenüberlastung durch Aorteninsuffizienz bei der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt einen praktischen Leitfaden für die Operation zur Entstehung einer Aorteninsuffizienz (AR) bei der Maus dar. Die Beurteilung der AR-Maus mittels Echokardiographie und invasiver hämodynamischer Messung rekapituliert ihre klinisch relevanten Eigenschaften der Volumenüberladungs-induzierten exzentrischen Hypertrophie, was auf ihre vielversprechende Anwendung in der Erforschung der kardialen Hypertrophie hindeutet.

Zusammenfassung

Die Aorteninsuffizienz (AR) ist eine häufige Herzklappenerkrankung, die eine Volumenüberlastung des Herzens ausübt und ein globales Problem für die öffentliche Gesundheit darstellt. Obwohl Mäuse häufig eingesetzt werden, um die Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu beleuchten, sind Mausmodelle für AR, insbesondere solche, die durch Operationen induziert werden, immer noch rar. In dieser Arbeit wurde ein Mausmodell der AR detailliert beschrieben, das unter hochauflösender Echokardiographie operativ durch eine Störung der Aortenklappen induziert wird. In Übereinstimmung mit dem regurgitierten Blutfluss weisen AR-Mausherzen einen ausgeprägten und klinisch relevanten Volumenüberlastungsphänotyp auf, der durch exzentrische Hypertrophie und kardiale Dysfunktion gekennzeichnet ist, wie durch echokardiographische und invasive hämodynamische Untersuchungen nachgewiesen wird. Unser Vorschlag bietet auf zuverlässige und reproduzierbare Weise einen praktischen Leitfaden für die Etablierung und Bewertung eines Mausmodells für AR für zukünftige Studien zu molekularen Mechanismen und therapeutischen Zielen der Volumenüberladungs-Kardiomyopathie.

Einleitung

Bei erhöhter Volumenüberlastung (Vorspannung) oder Drucküberlastung (Nachlast) vergrößert sich das Herz, ein Zustand, der als Hypertrophie bezeichnet wird. Obwohl die kardiale Hypertrophie eine kompensatorische Reaktion auf die Aufrechterhaltung der Durchblutung peripherer Organe vor Herzinsuffizienz ist, ist sie auch ein unabhängiger Risikofaktor für schwere kardiovaskuläre Ereignisse ^1,2. Die Überlastung des Volumens ist eine der wichtigsten Manifestationen einer erhöhten mechanischen Beanspruchung. Eine Volumenüberlastung tritt während der Herzdiastole auf und induziert eine exzentrische Herzhypertrophie, die nicht nur häufig bei Herzklappenerkrankungen wie Aorteninsuffizienz und Mitralinsuffizienz auftritt, sondern auch bei hypertensiven Herzerkrankungen im Endstadium, Myokardinfarkt, dilatativer Kardiomyopathie und übermäßiger körperlicher Anstrengung. Darüber hinaus haben in der klinischen Praxis einige Medikamente, die die durch Drucküberladung induzierte Myokardhypertrophie besser reduzieren können, unbefriedigende Wirkungen bei der Behandlung der durch Volumenüberlastung induzierten Myokardhypertrophie¹. Es ist daher von großer Bedeutung, den Mechanismus und die Interventionsmethoden des exzentrischen kardialen Umbaus, der durch Volumenüberlastung verursacht wird, zu entdecken. Diese Forschung zur Volumenüberladung wurde jedoch lange Zeit erheblich behindert, was zum großen Teil auf den Mangel an Kleintiermodellen zurückzuführen ist, die leicht zu bedienen, effizient quantifiziert und stabil repliziert werden zu können³.

Was die Kleintierarten betrifft, so sind Mäuse aufgrund ihres kurzen Lebenszyklus, ihrer bequemen Bedienung, ihres klaren Genoms und ihrer einfachen genetischen Veränderung zum Mainstream-Modelltier für die Erforschung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geworden⁴. In Bezug auf die Modellkategorien haben chirurgische Modelle im Vergleich zu genetischen Modifikationsmodellen und medikamentös behandelten Modellen offensichtliche einzigartige Vorteile. Das chirurgische Modell kann die exzessive und aufwändige Zucht und Genidentifizierung von Mäusen vermeiden, die für das genetische Modifikationsmodell notwendig sind, und kann auch die unspezifischen Effekte auf extrakardiale Gewebe und Organe vermeiden, die in medikamentös behandelten Modellen schwer zu kontrollieren sind. Das Mausmodell des aortocavalen Shunts wurde in der früheren Literatur als Induktion einer kardialen Volumenüberlastung dokumentiert⁵. Der aortocavale Shunt macht jedoch nur einen kleinen Teil der kardialen exzentrischen Hypertrophie in der Klinik aus und verursacht eine biventrikuläre Überlastung⁵, so dass er für die Verwendung in Studien zur linksventrikulären exzentrischen Hypertrophie von geringer translationaler Bedeutung ist. Nichtsdestotrotz stellt die Herzklappenerkrankung weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit dar. Es wird geschätzt, dass etwa 15 % der Bevölkerung >75 Jahre an einer signifikanten Herzklappenstörung leiden⁶. Obwohl die Aorteninsuffizienz (AR) einen Teil der Herzklappenerkrankung einnimmt, verursacht sie aufgrund einer Zunahme der Volumenüberlastung durch den regurgitativen Blutfluss eine exzentrische linksventrikuläre (LV) Hypertrophie ^7,8. In Anbetracht der Tatsache, dass die rechte Arteria carotis communis (RCCA) einen Weg bietet, um die Lage der Aortenklappen zu erreichen, ist es konzeptionell faszinierend, Aortenklappen über die RCCA zu unterbrechen, um bei Mäusen einen regurgitativen Blutfluss zu verursachen. Inspiriert von den Techniken zur Erzeugung eines oszillierenden Aortenflusses⁹ wurde kürzlich in unserem Labor ein Mausmodell der Aorteninsuffizienz (AR) etabliert, um eine Volumenüberlastung chirurgisch zu induzieren⁷. Diese AR-Maus zeigt eine offensichtliche exzentrische LV-Hypertrophie, die einen klinisch transformativen Ansatz darstellt und ein großes translationales Potenzial für die Untersuchung des Phänotyps des überlasteten Herzens und des zugrunde liegenden Mechanismus aufweist. Hier wurde ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Durchführung von AR-Operationen bei Mäusen beschrieben, das durch Hochfrequenz-Echokardiographie und invasive Hämodynamik rekapituliert wurde, um den Erfolg der Operation sicherzustellen (Abbildung 1).

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Komitee für Tierpflege und -verwendung des Zhongshan-Krankenhauses der Fudan-Universität ethisch genehmigt und folgt den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Nr. 85-23, überarbeitet 2011; National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

HINWEIS: Tierversuche wurden an männlichen C57BL/6J-Mäusen im Alter von >10 Wochen durchgeführt. Der Chirurg in diesem Protokoll sollte in der Manipulation der murinen Echokardiographie geübt sein, bevor er die AR-Operation an der Maus durchführt. An den meisten Forschungseinrichtungen wird die Echokardiographie kleiner Nagetiere jedoch von einer Core Facility durchgeführt, so dass der Chirurg eng mit Kernexperten zusammenarbeiten kann, wenn es sich nicht um einen erfahrenen Chirurgen in der Echokardiographie handelt. Erfahrung mit invasiven hämodynamischen Messungen bei der Maus ist von Vorteil.

1. Vorbereitung auf die Ultraschallbildgebung (obligatorisch) und die invasive hämodynamische Messung (optional)

1. Starten Sie das Ultraschallgerät, das an eine 30-MHz-Sonde angeschlossen ist. Stellen Sie die temperaturgesteuerte Ultraschall-Tierplattform in die Position für die Aortenbogenansicht, in der die rechte Seite der Maus nach oben geneigt ist.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, das kraniale Ende der Ultraschall-Tierplattform in Richtung des Chirurgen zu platzieren. Ob das kraniale Ende oder das kaudale Ende zum Chirurgen hin ausgerichtet ist, sollte jedoch davon abhängen, mit welchem sich der Chirurg wohler fühlt.
2. Schließen Sie ein Mikromanometer (Druckkatheter) an das Datenerfassungsgerät und den Analog-Digital-Wandler an. Tauchen Sie die Kalibrierküvette des Mikromanometers in Kochsalzlösung, um die Kochsalzlösung zu kalibrieren.
   HINWEIS: Wenn der Zustand es zulässt, kann auch ein Druck-Volumen-Katheter verwendet werden. Wir verwenden einen Druckkatheter, da das Druckdatenerfassungsgerät im Labor nur Druckdaten sammelt und nicht in der Lage ist, volumenbezogene Daten zu sammeln, obwohl die echokardiographischen Ergebnisse in der aktuellen Studie auch LV-Volumina abgrenzen können.

2. Anästhesie von Mäusen, Vorbereitung von chirurgischen Geräten und Isolierung des RCCA

HINWEIS: Chirurgische Instrumente müssen vor der Verwendung sterilisiert und autoklaviert werden. Es wird empfohlen, alle Schritte unter aseptischen Bedingungen durchzuführen. Es wird auch empfohlen, dass die Haarentfernung 1 Tag im Voraus durchgeführt wird, um Zeit während des bildgebenden Verfahrens zu sparen, mögliche unerwünschte Stressreaktionen bei den Mäusen zu minimieren und die Brust und die Extremitäten sauber und trocken zu halten.

1. Betäuben Sie die Maus in der Induktionskammer, die mit einem Verdampfer verbunden ist, der auf 4 % Isofluran gemischt mit 0,8 l/min Sauerstoff eingestellt ist. Wenn die Maus einschläft oder der Schwanzklemmreflex verschwindet, nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer.
2. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Kupferplatte, die durch ein Heizkissen erwärmt wird. Verbinden Sie die Nase mit einem Nasenkonus, an den 1,5 % Isofluran gemischt mit 0,8 l/min Sauerstoff abgegeben wird, um ein gleichmäßiges Anästhesieniveau aufrechtzuerhalten.
   HINWEIS: Eine Kupferplatte wird empfohlen, da sie bequem zu reinigen und rostfrei ist, obwohl sie durch eine andere Art von Metallplatte ersetzt werden kann.
3. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu verhindern, und kleben Sie die Extremitäten auf die Kupferplatte. Entfernen Sie die Haare an Hals und Brust mit Enthaarungscreme und reinigen Sie die enthaarte Stelle mit 75% Ethanol.
4. Bereiten Sie die notwendigen chirurgischen Instrumente vor, einschließlich verschiedener Pinzetten und Scheren (Abbildung 2A; siehe Materialtabelle).
5. Machen Sie einen medianen Längsschnitt von etwa 1 cm im Nacken mit einer gebogenen Daumenzange und einer geraden Schere zwischen Unterkiefer und Brustbein.
6. Präparieren Sie den linken und rechten Teil der Schilddrüse stumpf mit zwei Pinzettenpaaren. Trennen Sie mit der gebogenen feinen Daumenzange den Stemohyoideus-Muskel und das Fettgewebe in der rechten paratrachealen Region, um die RCCA so lange wie möglich freizulegen. Vermeiden Sie zu jeder Zeit eine Verletzung des Vagusnervs, da dies zu Hypotonie, Bradykardie und Tod führen kann (Abbildung 2B).

3. Katheterisierung durch RCCA und aufsteigende Aorta unter Ultraschallkontrolle

1. Führen Sie zwei 6-0 Seidenfäden von je ca. 5 cm Länge unter das Gefäß. Befestigen Sie den distalen RCCA mit einem festen Knoten mit einem Faden und befestigen Sie die beiden Enden des engen Knotens neben dem Kopf des Tieres, um eine leichte Spannung auf dem RCCA zu halten. Diese Maßnahme wird die Katheterisierung in den folgenden Schritten erleichtern.
2. Legen Sie mit dem zweiten Faden einen losen Knoten auf den proximalen RCCA. Dadurch wird der versiegelte Bereich des RCCA mit Blut gefüllt, wodurch es leicht geschnitten werden kann.
3. Schneiden Sie mit einer kleinen Klemmschere eine keilförmige Öffnung, 1-2 mm proximal zum festen Knoten, um den RCCA zu öffnen. Stellen Sie sicher, dass die Größe des Schnitts weder zu klein ist, um einen Katheter einzuführen, noch zu groß, damit er beim Einführen einrastet.
   HINWEIS: Ein Schnitt unter einem Mikroskop wird dringend empfohlen. Das Einstechen eines kleinen Lochs in das Gefäß mit einer 26 G Nadel ist eine alternative Methode.
4. Bereiten Sie einen Kunststoffkatheter vor, der einen Metalldraht enthält (Abbildung 2C). Dehnen Sie den Schnitt mit einer langhändigen, gebogenen Bindezange, führen Sie den Kunststoffkatheter mit dem Metalldraht in den RCCA ein und bewegen Sie sich nach vorne zum losen Knoten.
5. Lösen Sie den losen Knoten, um den Katheter und den Draht etwa 2 cm nach vorne zu schieben. Übertragen Sie die Kupferplatte, die das Tier enthält, auf die Ultraschall-Tierplattform, tragen Sie das Ultraschallgel auf den Hals und die Brust der Maus auf und führen Sie dann den Katheter und den Draht vorsichtig unter Ultraschallkontrolle durch den RCCA und die aufsteigende Aorta.

4. Punktion der Aortenklappen unter Ultraschallkontrolle

1. Erfassen Sie basale Ultraschalldaten im Farbdopplermodus und im Pulswellen-Doppler-Modus, bevor der Kunststoffkatheter und der Metalldraht die Aortenöffnung erreichen.
2. Während der Ultraschall gleichzeitig und deutlich die aufsteigende Aorta, den LV-Ausflusstrakt, den Katheter und den Draht zeigt, ragen der Katheter und der Draht, wenn der Katheter und der Draht die Aortenöffnung erreichen, die Spitze des Drahtes aus dem Katheter heraus und punktieren die Aortenklappen (Abbildung 1).
   HINWEIS: Wenn die Aortenklappe perforiert ist, sollte der Chirurg in der Lage sein, diesen Bruch zu spüren.
3. Ziehen Sie den Katheter und den Draht leicht aus der Aortenöffnung zurück und sammeln Sie Ultraschalldaten nach der Perforation im Farbdopplermodus und im Pulswellendopplermodus nach der Punktion der Aortenklappen. Der Regurgitationsfluss ist während des Herzdiastolen-in-Farb-Doppler-Modus rot gefärbt und kann im Pulswellen-Doppler-Modus quantitativ bestätigt werden.
4. Betrachten Sie eine maximale diastolische Geschwindigkeit des Aortenflusses (PSVa) zwischen 300 und 500 mm/s als zufriedenstellend. Wenn der Grad des Regurgitationsblutflusses nicht zufriedenstellend ist, wiederholen Sie Schritt 4.2.
5. Optional: Wenden Sie ein Mikromanometer vor und unmittelbar nach der Perforation der Aortenklappen an, um das Vorhandensein eines Regurgitationsflusses weiter zu bestätigen. Zur Überprüfung wird sowohl der aortale enddiastolische Druck (AEDP) gedrückt als auch der Aortenpulsdruck um etwa 20 mmHg erhöht.
   HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung der Verwendung eines Mikromanometer-Katheters zur Durchführung invasiver hämodynamischer LV-Messungen wurde an anderer Stelle elegant vorgestellt^10,11.

5. Entnahme des Kunststoffkatheters und des Metalldrahtes und perioperative Betreuung

1. Entfernen Sie das Ultraschallgel und trocknen Sie die Maus mit steriler Gaze oder Gewebe nach Bestätigung der erfolgreichen Perforation der Aortenklappen, dann ziehen Sie den Kunststoffkatheter vorsichtig mit dem zentralen Metalldraht heraus, bevor Sie die RCCA ligieren.
2. Verschließen Sie die Haut mit einer 5-0-Seidennaht in einem durchgehenden Nahtmuster und tragen Sie Povidon-Jod-Lösung auf die Nahtstelle auf. Verabreichen Sie der Maus subkutan Meloxicam (0,13 mg) zur Analgesie und legen Sie die Maus in einen vorgewärmten Käfig unter wärmendes Licht, bis sie zur Genesung vollständig wach ist.

6. Schein-OP

1. Führen Sie die Abschnitte 1-3 wie beschrieben aus. Führen Sie bei der scheinbetriebenen Maus ähnliche Verfahren wie in Abschnitt 4 durch, ohne die Aortenklappen zu stören.
2. Führen Sie Abschnitt 5 wie beschrieben durch, obwohl AR bei keiner der scheinoperierten Mäuse vorhanden sein sollte.

7. Beurteilung der Aortenklappenperforation, der kardialen Morphologie und Funktion mittels Echokardiographie und invasiver hämodynamischer Messung

1. Verwenden Sie nach 4 Wochen AR den echokardiographischen B-Modus, den Farbdoppler-Modus und den Pulswellen-Doppler-Modus, um den Blutfluss des Aortenbogens in der Aortenbogenansicht zu beurteilen und PDVa gemäß Schritt 4.1 und an anderer Stelle^{zu messen 1,12}.
2. Verwenden Sie den echokardiographischen B-Modus und den M-Modus, um die LV-Dimension und die Kontraktilität in der parasternalen Längsachsenansicht zu beurteilen, wobei die enddiastolischen (LVEDD) und endsystolischen (LVESD) Dimensionen, die enddiastolische (LVPWTd) und endsystolische (LVPWTs) Dicke der LV-Hinterwand, die LV-Ejektionsfraktion (LVEF) und die fraktionelle Verkürzung (LVFS) abgeleitet werden.
   HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung der Verwendung des Ultraschallgeräts und der Manipulation von Ultraschallansichten wurde zuvor elegant beschrieben¹².
3. Nach der echokardiographischen Bildgebung ist eine invasive hämodynamische Messung durchzuführen, ähnlich wie in Schritt 4.3 und an anderer Stelle¹⁰. Notieren Sie die maximale Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit (+dp/dt und -dp/dt). Führen Sie das Mikromanometer in die linke Arteria carotis communis (LCCA, nicht RCCA) ein, da die RCCA während der AR-Operation dauerhaft ligiert wurde.
4. Nach der invasiven hämodynamischen Messung wird die Maus über eine Zervixluxation eingeschläfert. Öffnen Sie den Brustkorb, spülen Sie das Herz mit 10 % Formalin, gefolgt von 0,9 % iger Natriumchloridlösung, entfernen Sie das Herz, indem Sie die Aorta abschneiden, und schneiden Sie quer auf Höhe des unteren Randes der linken Ohrmuschel. Erfassen Sie Bilder mit Hilfe der Lichtmikroskopie.

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Ergebnisse

Um eine erfolgreiche AR zu gewährleisten, haben wir den Blutfluss mit Neuinsuffizienz mittels Farbdoppler und Pulswellen-Doppler-Echokardiographie validiert. Bei Mäusen mit AR zeigte das Farbdopplerspektrum des Aortenbogens unmittelbar nach der Operation einen Regurgitantenfluss (rot), der bei Scheinmäusen fehlte (kein Fluss in der Diastole; Abbildung 3A). Konsistent zeigte der Pulswellen-Doppler einen robust erhöhten Regurgitantenfluss in AR-Mäusen (

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Diskussion

Die chirurgische Induktion von AR in der Maus ist eine technisch anspruchsvolle, neue Technik, die jedoch eine signifikante translationale Relevanz hat. Um die Technik zu beherrschen, sollte ein Chirurg zumindest im Vorfeld mit der Gebärmutterhalsanatomie und dem Herzensanatomie, dem Umgang mit Mäusen und der Echokardiographie vertraut sein. Eine geschickte Bedienung bei der invasiven hämodynamischen Messung ist ein Pluspunkt. Für einen erfolgreichen AR-Betrieb sollte auf mehrere kri...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper plate	JD.com Inc.	Customized	20 X 15 cm or bigger is prefeered
Curved Tying forceps	66 Vision Tech	53324A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Heating pad	JD.com Inc.	Changzhi 55	warm the copper plate and mouse by the way
Long-handed Curved Tying Forceps	MECHENIC	TS-15	to stretch vessel
Metal Wire (stainless steel)	JD.com Inc.	0.18 mm in diametter	work with a plastic catheter to puncture aortic valves
Needle Holder	Shanghai Jinzhong	131110	suture of skin
Plastic Catheter	Anilab software & instruments	PE-0402	work with a metal wire to puncture aortic valves
Pressure Catheter	Millar Instruments	SPR 835	1.4F in size
Pressure Data Acquisition Device and Analog/Digital Converter	AD Instruments	Labchart 5	connected with pressure catherter
Scissor	Suzhou Shiqiang	Stronger 13Cr	to cut skin
Smallpinch Scissors	Shanghai Jinzhong	YBE030	to cut vessel
Stereomicroscope	Olympus Corporation	SMZ845	for incision and intubation of vessel
Straight Tying forceps	66 Vision Tech	53320A	to stretch and isolate muscle, tissue, and vessel
Thumbforceps	Suzhou Shiqiang	5307B	to clamp and stretch skin and muscle
Ultrasound Gel	PARKER	Aquasonic-100	to transfer ultrasound signal
Ultrasound Imaging System	VisualSonics	2100	includes B-mode, M-model, color Doppler and pulse wave Dopper
Vaporizer	RWD Life Science	R540	for anesthesia