JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نهج معالجة الصور القائم على iSCAT وتتبع الجسيمات المفردة الذي يتيح التحقيق المتزامن للكتلة الجزيئية والسلوك المنتشر للجزيئات الكبيرة التي تتفاعل مع الأغشية الدهنية. يتم توفير إرشادات خطوة بخطوة لإعداد العينات، والتحويل من الكتلة إلى التباين، والحصول على الأفلام، وما بعد المعالجة جنبا إلى جنب مع الاتجاهات لمنع المزالق المحتملة.

Abstract

التفاعلات قصيرة العمر أو العابرة للجزيئات الكبيرة في الأغشية الدهنية ومعها ، وهي واجهة تحدث فيها العديد من التفاعلات البيولوجية الأساسية ، يصعب بطبيعتها تقييمها باستخدام الطرق الفيزيائية الحيوية القياسية. ويشكل إدخال تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة (MSPT) خطوة هامة نحو توصيف كمي شامل لهذه العمليات. من الناحية الفنية ، أصبح هذا ممكنا من خلال ظهور المجهر التشتت التداخل (iSCAT) القائم على القياس الضوئي الشامل (MP). عندما يتم تحسين استراتيجية إزالة الخلفية للكشف عن الحركة ثنائية الأبعاد للجسيمات المرتبطة بالغشاء ، تسمح هذه التقنية بالتحليل في الوقت الفعلي لكل من الانتشار والكتلة الجزيئية للجزيئات الكبيرة غير المصنفة على الأغشية البيولوجية. هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لإجراء وتحليل تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة للأنظمة المرتبطة بالغشاء. تحقق القياسات التي يتم إجراؤها على مقياس ضوئي للكتلة التجارية دقة زمنية في نظام المللي ثانية ، واعتمادا على نظام MP ، حد للكشف عن الكتلة يصل إلى 50 kDa. لعرض إمكانات MSPT للتحليل المتعمق لديناميات الجزيئات الكبيرة المحفزة بالأغشية بشكل عام ، يتم تقديم النتائج التي تم الحصول عليها لأنظمة البروتين المثالية مثل ملحق متفاعل الغشاء الأصلي V .

Introduction

مرة واحدة ينظر إليها فقط على أنها حاجز ضد مجموعة واسعة من الظروف الفيزيائية المحيطة ، تعتبر الأغشية البيولوجية في الوقت الحاضر كيانات وظيفية ومنصات حفازة 1,2. استنادا إلى قدرتها على توطين الإشارات وتضخيمها وتوجيهها استجابة لتفاعلات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء ، تشكل واجهات الدهون عنصرا حاسما لمجموعة واسعة من العمليات الخلوية مثل الاتجار بالأغشية وشلالات الإشارات3،4،5. يعمل كموقع نواة لتجميع المجمعات المستقرة ، وغالبا ما يعتمد ارتباط الغشاء على توازن ديناميكي بين الأشكال المرتبطة بالغشاء والخلوية للجزيئات الكبيرة ، وبالتالي فهو ذو طبيعة عابرة 6,7.

على الرغم من أهميتها الكبيرة في علم الأحياء ، فقد كان من الصعب حتى الآن تطوير طرق يمكن أن توفر الوصول إلى عدم التجانس التركيبي والمكاني والزمني لتفاعلات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء في الوقت الفعلي 7,8. لحل العمليات الجزيئية الأساسية ، هناك جانبان تجريبيان حاسمان: دقة الوقت الكافي وحساسية الجسيمات المفردة. لذلك ، فإن تقنيات متوسط المجموعة مثل استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) ولكن أيضا التحليل الطيفي لارتباط التألق الأكثر حساسية (FCS) لها قيود ، لأنها تفصل إلى حد كبير المعلومات المكانية عن المعلومات الزمنية9. وبالتالي ، كانت الخطوة المهمة نحو توصيف ديناميكيات الجزيئات الفردية هي ظهور تتبع الجسيمات المفردة (SPT) بالاقتران مع الفحص المجهري شديد الحساسية. وعلى وجه الخصوص، أثبت نهجان للجنة الفرعية لتيمور الشرقية فعاليتهما في هذا الصدد. أولا ، مهد استخدام الفلوروفورات كملصقات وأنظمة الكشف عن التألق المقابلة الطريق لدقة النانومتر ودقة المرة المللي ثانية 10،11،12. ثانيا، أدى الكشف القائم على التشتت باستخدام جسيمات الذهب النانوية إلى تحسين كل من دقة التوطين ودقة الوقت إلى نطاق النانومتر الفرعي والميكروثانية، على التوالي13،14،15،16. على الرغم من المزايا العديدة لكلا النهجين ومساهماتهما الكبيرة فيما يتعلق بالفهم الميكانيكي للأنظمة المرتبطة بالأغشية 17,18 ، إلا أن كلتا التقنيتين كانتا محدودتين حتى الآن: فهما تتطلبان وضع علامات على الجزيئات ذات الأهمية ، مما قد يزعج سلوكها الأصلي وغير حساس للتركيب الجزيئي للجسيمات المرتبطة بالغشاء 19,20.

وقد تم التغلب على هذين القيدين مؤخرا من خلال إدخال نهج جديد قائم على تشتت التداخل (iSCAT) يسمى القياس الضوئي الكتلي (MP)21،22،23. تسمح هذه التقنية بتحديد التوزيعات الجماعية داخل المحلول للجزيئات الحيوية وفقا لتباين iSCAT عند الهبوط على واجهة زجاجية. ومع ذلك ، للكشف عن وتوصيف الجزيئات المتنقلة المنتشرة على الأغشية الدهنية ، كان لا بد من تطوير نهج تحليل الصور أكثر تطورا. وفي الوقت نفسه ، تم تنفيذ هذا بنجاح ويسمح باكتشاف وتتبع وتحديد الكتلة الجزيئية للجزيئات الحيوية المفردة غير المصنفة المنتشرة على واجهة دهنية24,25. يشار إلى هذه التقنية باسم القياس الضوئي للكتلة الديناميكية أو تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة (MSPT) ، وتمكن الآن من تقييم تفاعلات الجزيئات الكبيرة المعقدة عن طريق التسجيل المباشر للتغيرات في الكتلة الجزيئية للكيانات المتعقبة ، وبالتالي تفتح إمكانيات جديدة للتحليل الميكانيكي للديناميكيات الجزيئية المرتبطة بالغشاء.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد العينات والتصوير وخط أنابيب تحليل البيانات المطلوب ل MSPT. على وجه الخصوص ، تتم مناقشة متطلبات العينة والمشاكل المحتملة التي قد تحدث أثناء القياس والتحليل. علاوة على ذلك ، يتم عرض الإمكانات التي لا مثيل لها لتحليل أنظمة الجزيئات الكبيرة المتفاعلة مع الأغشية من خلال نتائج تمثيلية مختلفة.

Protocol

1. إعداد العينات

  1. توليد الحويصلات متعددة الصفائح (MLVs)
    1. احسب كمية الدهون المذابة بالكلوروفورم وفقا لخليط الدهون المطلوب وحجم التعليق المطلوب.
      ملاحظة: يوصى بتركيز حويصلة نهائي من الدهون 4 ملغم / مل للمخزن المؤقت لإعادة التعليق (التفاعل).
    2. ماصة الحجم المحسوب من الدهون في قارورة زجاجية 1.5 مل باستخدام ماصات إزاحة إيجابية مجهزة بأطراف زجاجية.
    3. تبخر مذيب الدهون تحت تيار خافت من النيتروجين وتدوير القارورة باستمرار لضمان التوزيع المتساوي للدهون على الجدران الزجاجية.
    4. ضمان تبخر المذيبات بالكامل عن طريق وضع القارورة تحت تيار ثابت من النيتروجين لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بإزالة الآثار المتبقية من الكلوروفورم عن طريق التجفيف بالتفريغ في مجفف فراغ لمدة ساعة إضافية.
    6. قم بإعادة ترطيب خليط الدهون في المخزن المؤقت المطلوب لإعادة التعليق (التفاعل) ودوامة التعليق تماما حتى يتم إذابة فيلم الدهون من جدران القارورة.
      ملاحظة: يجب أن يضمن المخزن المؤقت للتفاعل نشاط البروتين واستقراره. يحتوي المخزن المؤقت للتفاعل المستخدم في هذه الدراسة على 50 mM Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5) ، و 150 mM KCl ، و 5 mM MgCl2. لاحظ أن أي مخزن مؤقت يستخدم لتخفيف الدهون أو البروتينات يحتاج إلى تصفية لإزالة شوائب الجسيمات المتداخلة (انظر الخطوة 5).
  2. جيل من الحويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة (SUVs)
    1. لدورات التجميد والذوبان المتتالية لإعادة تعليق الدهون (الخطوة 1.1.6) ، قم بغلي 500 مل من الماء في كوب على صفيحة ساخنة (بين 70 درجة مئوية إلى 99 درجة مئوية) وقم بإعداد حاوية تحتوي على النيتروجين السائل.
    2. قم بتجميد إعادة تعليق الدهون في النيتروجين السائل بصدمة. انقل القارورة إلى الكأس بالماء الساخن حتى يذوب المحلول تماما. كرر دورة التجميد والذوبان هذه 8-10 مرات أو حتى يظهر الخليط العكر السابق واضحا.
      تحذير: استخدم ملابس ومعدات السلامة المناسبة مثل النظارات الواقية والقفازات والملقط لمنع أي اتصال مباشر بالنيتروجين السائل أو قارورة الدهون المجمدة أو الماء المغلي.
    3. لتوليد توزيع حويصلة أحادية التشتت ، قم بتجميع طارد الدهون واختبار سلامته باستخدام مخزن مؤقت للتفاعل لضمان عدم تسربه.
      ملاحظة: إذا لوحظ حدوث تسرب، فأعد تجميع جهاز بثق الدهون بعناية حتى لا يتضح أي انسكاب عازل.
    4. يمر بثق تعليق الدهون لمدة 37 عبر غشاء نيوكليوبور بحجم مسام 50 نانومتر26. يجب أن يكون عدد التمريرات غير متساو لضمان عبور خليط SUV النهائي لغشاء النيوكليوبور وبالتالي فهو خال من مجاميع الدهون أو الحويصلات متعددة الصفائح. سيتم استخدام الحويصلات المبثوقة لاحقا لتشكيل طبقات ثنائية الدهون المدعومة (انظر الخطوتين 6 و 7).
      ملاحظة: يمكن أيضا تشكيل سيارات الدفع الرباعي عن طريق صوتنة خليط الدهون المعاد ترطيبه. ومع ذلك ، فإن التحضير عن طريق البثق يوفر توزيعا أحادي التشتت أكثر لسيارات الدفع الرباعي ، مما يسهل تمزق الحويصلة أثناء تكوين الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة. يمكن تخزين الحويصلات المبثوقة في الثلاجة لمدة أقصاها 3 أيام.

2. تنظيف شرائح المجهر

  1. توزيع عدد متساو من شرائح المجهر (رقم #1.5؛ سمك 0.17 مم) بأبعاد 24 مم × 60 مم و 24 مم × 24 مم في حاملات المجهر متعدد التترافلور إيثيلين (PTFE).
  2. انقل حاملات PTFE إلى أكواب تحتوي على مياه فائقة النقاء وقم بصوتنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: اعتمادا على الدورق ، يجب ضبط حجم الماء لتغطية حامل PTFE بالكامل.
  3. استخدم الملقط لإزالة الحاملات من الكأس واستبدال الماء بالأيزوبروبانول فائق النقاء. أدخل الحامل في الكأس الذي يحتوي على الأيزوبروبانول والسونيكات مرة أخرى لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: اعتمادا على الكأس ، يجب ضبط حجم الأيزوبروبانول لتغطية حامل PTFE بالكامل.
  4. استبدل الأيزوبروبانول بماء فائق النقاء وقم بسونيك الكأس الذي يحتوي على الحاملات لمدة 15 دقيقة.
  5. قم بإزالة حاملات PTFE من الأكواب وجفف شرائح المجهر في الحامل تحت تيار ثابت من غاز النيتروجين أو الهواء المضغوط.
    ملاحظة: تأكد من التنظيف السليم لشرائح الغطاء باستخدام القفازات والأكواب النظيفة وفيلم البارافين لتغطية كل دورق. خلاف ذلك ، قد يتسبب الغبار المتبقي في تقلبات كبيرة في الخلفية أثناء قياسات MSPT.

3. الفيلبة المائية لشرائح المجهر

ملاحظة: للحصول على طبقة ثنائية الدهون متجانسة ومدعومة بالسوائل ، يعد التحلل المائي للشرائح أمرا ضروريا ويجب إجراؤه قبل تجميع غرفة التدفق مباشرة.

  1. ضع حوامل PTFE التي تحتوي على شرائح مجهرية 24 مم × 60 مم فقط في منظف بلازما مع الأكسجين كغاز معالجة ونظف شرائح المجهر بالبلازما (المعلمات المستخدمة في هذا العمل: طاقة 30٪ ، ضغط أكسجين 0.3 مللي بار لمدة 30 ثانية ؛ انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل منظف البلازما المستخدم).
    ملاحظة: للحصول على أغشية السوائل، يجب ضبط معلمات تنظيف البلازما مثل الطاقة وضغط الأكسجين ووقت التنظيف لكل أداة. لهذا الغرض ، يوصى باستخدام الدهون ذات العلامات الفلورية لضمان سيولة الغشاء ، والتي يمكن تحديدها كميا مع استعادة التألق بعد تجارب التبييض الضوئي (FRAP)27. إذا لم يتم تحسين المعلمات للإعداد المعني ، فقد يضعف انتشار الغشاء بسبب انخفاض سيولة الغشاء.

4. تجميع غرف التدفق

  1. قبل تجميع غرفة التدفق ، احتفظ بالمكونات التالية جاهزة: شرائح المجهر النظيفة (24 مم × 24 مم) ، وشرائح المجهر المحب للماء (24 مم × 60 مم) ، ورقائق الألومنيوم ، والورق المقوى المسطح ، والمشرط ، والشريط على الوجهين.
  2. لف الورق المقوى المسطح بورق الألومنيوم.
  3. انشر شرائح المجهر المنظفة مقاس 24 مم × 24 مم على رقائق الألومنيوم مع مسافة كافية بين بعضها البعض.
  4. قم بتوصيل شرائط الشريط على الوجهين بالحواف العلوية والسفلية للشرائح.
  5. قم باستئصال كل شريحة مجهرية باستخدام المشرط ، بحيث يمكن إزالتها من رقائق الألومنيوم. ونتيجة لذلك، يجب أن تحتوي كل شريحة على خطوط من الشريط على الوجهين متصلة بالحواف العلوية والسفلية للشريحة (انظر الشكل 1).
  6. قم بتوصيل الشريحة مقاس 24 مم × 24 مم بشريطي الشريط على الوجهين بشريحة 24 مم × 60 مم المحبة للماء لتشكيل مسار تدفق بين شرائح المجهر الأصغر والأكبر.
    ملاحظة: لضمان غرف تدفق نظيفة، ارتد القفازات باستمرار وتأكد من أن طاولة العمل خالية من الغبار.

5. ترشيح المخازن المؤقتة للتفاعل

  1. تصفية معقمة لجميع المخازن المؤقتة للتفاعل من خلال أغشية خلات السليلوز 0.45 ميكرومتر لضمان الحد الأدنى من إشارة الخلفية أثناء قياسات MSPT.
    ملاحظة: إذا كان وجود النيوكليوتيدات، مثل ATP، ضروريا لنجاح التجربة، فكن على دراية بزيادة محتملة في إشارة الخلفية. يوصى باستخدام الحد الأدنى فقط من الكميات التي لا تزال تضمن نشاط البروتين.

6. دعم الدهون ثنائي الطبقة (SLB) تشكيل

ملاحظة: يوصى بإجراء تكوين طبقات ثنائية الدهون المدعومة على مقياس الكتلة الضوئي لضمان انتشار الحويصلة بنجاح الحويصلة بصريا والإزالة الكاملة للحويصلات غير المنصهرة.

  1. قم بتخفيف سيارات الدفع الرباعي المبثوقة حديثا (انظر الخطوة 1 لمزيد من التفاصيل) إلى تركيز نهائي قدره 0.4 مجم / مل في مخزن التفاعل المطلوب. اختياريا، لتعزيز تمزق الحويصلة، أضف 2 mM CaCl2 إلى تعليق الحويصلة.
    ملاحظة: قد تتسبب الكاتيونات الثنائية في تجميع بعض الدهون مثل PiP2. بالنسبة للمخاليط التي تحتوي على مثل هذه الدهون ، امتنع عن استخدام CaCl2 لتعزيز تمزق الحويصلة أو الكاتيونات الثنائية الأخرى في المخزن المؤقت لإعادة التعليق. إذا لزم الأمر للتجربة ، يمكن إضافة الكاتيونات الثنائية بعد التكوين الناجح للطبقة الثنائية الدهنية المدعومة.
  2. اغسل 50 ميكرولتر من تعليق الحويصلة في غرفة التدفق (الخطوة 4) واحتضن الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن مسح المخازن المؤقتة أو الحويصلات أو محاليل البروتين عبر غرفة التدفق بقطعة صغيرة من أنسجة النقع. ومع ذلك ، من الممكن أيضا استخدام نظام مضخة ميكانيكية.
  3. قم بإزالة الحويصلات غير المنصهرة من خلال الغسيل المتكرر (ثلاث مرات على الأقل) لغرفة التدفق باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل في كل مرة.
    ملاحظة: يجب غسل الحويصلات جيدا خارج غرفة التدفق لضمان إشارة خلفية مستقرة أثناء قياسات MSPT.

7. توليد منحنى المعايرة

ملاحظة: لتحويل تباين الجسيمات المكتشفة إلى كتلة جزيئية، يجب معايرة إشارتها باستخدام بروتينات ذات أحجام معروفة. يوصى بضبط نظام حجم البروتين القياسي لتغطية نطاق الكتل الجزيئية المتوقعة لنظام الاهتمام.

  1. البيوتينيل للبروتينات القياسية مع بقايا السيستين
    1. احسب الكمية المناسبة من ماليميد-بيوتين للبروتين القياسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. احتضن البروتين القياسي مع الحجم المحدد من ماليميد البيوتين لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    3. لإزالة ماليميد-بيوتين غير مقترن من مركب بروتين البيوتين المترافق ، قم بإجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم على عمود مناسب للبروتين محل الاهتمام.
    4. حدد تركيز البروتين باستخدام فحص برادفورد.
      ملاحظة: لتخزين البروتين القياسي لمزيد من القياسات ، قم بتجميد البروتين في أليكوتس للاستخدام الواحد في النيتروجين السائل وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  2. قياس البروتينات القياسية لمنحنى المعايرة
    1. في غرفة التدفق ، قم بإعداد طبقة ثنائية الدهون مدعومة مع سيارات الدفع الرباعي المبثوقة 0.4 مجم / مل (انظر الخطوتين 1 و 6 لمزيد من التفاصيل) التي تحتوي على 0.01 mol٪ (v / v) Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl).
    2. أضف 50 ميكرولتر من الستربتافيدين الثنائي 2.5 نانومتر إلى الطبقة الثنائية في غرفة التدفق واحتضنها لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: تم التعبير عن الستربتافيدين الثنائي وتنقيته على النحو المبين في Howarth et al.28. وبالمثل يمكن استخدام الستربتافيدين رباعي التكافؤ. ومع ذلك ، فإن استخدام الستربتافيدين الثنائي يمكن أن يقلل من التفاعل المحتمل بين الدهون البيوتينيل والبروتينات القياسية التي تقترن بمويتي البيوتين من أجل تسهيل تعيين الأنواع.
    3. إزالة الستربتافيدين الثنائي غير المرتبط مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل.
    4. أضف 50 ميكرولتر من البروتين القياسي المترافق مع البيوتين 100 نانومتر إلى الطبقة الثنائية في غرفة التدفق واحتضنها لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على كفاءة البيوتينيل وما إذا كان يتم استخدام الستربتافيدين ثنائي أو رباعي التكافؤ، قد تختلف التركيزات المثلى للبروتين القياسي المقترن بالبيوتين والستربتافيدين.
    5. قم بإجراء قياس MSPT وفقا للتفاصيل الموضحة في الخطوة 8.
      تنبيه: يجب أن تكون ظروف التصوير متطابقة لكل من معايير العينة والمعايرة.

8. التصوير

  1. تشكيل SLB وإعداد العينات
    1. كما هو موضح بمزيد من التفصيل في الخطوة 6 ، أدخل سيارات الدفع الرباعي من خليط الدهون المطلوب (25 ميكرولتر) إلى غرفة تدفق العينة وشكل طبقة ثنائية الدهون مدعومة. اغسل الغرفة جيدا (ثلاث مرات) باستخدام 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل لإزالة جميع الحويصلات غير المنصهرة.
    2. أضف 50 ميكرولتر من البروتين الذي يهم إلى غرفة العينة.
      ملاحظة: نظرا لأن MSPT هي طريقة أحادية الجسيم ، يجب الاحتفاظ بتركيز البروتين في نطاق pM إلى nM للسماح باكتشاف الجسيمات وتتبعها دون عائق.
  2. الحصول على الفيديو
    1. قم بتعيين ظروف التصوير المطلوبة مثل حجم مجال الرؤية (FOV) ومعدل الإطارات ووقت التعرض ووقت الاكتساب في برنامج الاستحواذ.
      ملاحظة: أثبتت الإعدادات التالية أنها تعمل مع MSPT على مقياس ضوئي تجاري للكتلة (انظر جدول المواد): FOV من 128 بكسل × 35 بكسل ، ومعدل إطارات يبلغ 1 كيلو هرتز مما يؤدي إلى ما يقرب من 200 إطار في الثانية بعد متوسط إطار 5 أضعاف لاحق ، ووقت تعرض يبلغ 0.95 مللي ثانية.
    2. اضبط التركيز البؤري تلقائيا أو يدويا. إذا لزم الأمر ، حرك FOV إلى موضع به غشاء متجانس باستخدام التحكم الجانبي.
    3. قم بإنشاء مجلد مشروع وابدأ تسجيل الفيلم. عند الانتهاء من التسجيل، حدد اسم ملف في مربع الحوار الذي يطلبه برنامج الاستحواذ. ثم يتم حفظ الفيلم تلقائيا في مجلد المشروع كملف MP للتحليل اللاحق.
      ملاحظة: سجل ما لا يقل عن ثلاث نسخ متماثلة في غرف تدفق مختلفة لضمان سلامة الأغشية الفردية وإمكانية تكرار النتائج. يمكن تحديد مدة الفيلم مقدما ويعتمد على نوع التجربة. في معظم الحالات ، يوصى بوقت اكتساب يتراوح بين 5 دقائق و 7 دقائق.
      تنبيه: بشكل افتراضي، يتم ضغط تسجيلات الأفلام على برنامج اقتناء مقياس الصور الضخم التجاري قبل حفظها لتقليل مساحة التخزين. ومع ذلك، يجب إيقاف تشغيل ضغط الملفات لتمكين تحليل البيانات المخصصة كما هو موضح في هذا البروتوكول. يمكن العثور على تفاصيل حول كيفية إيقاف ضغط الملفات في دليل المستخدم الخاص بالشركة المصنعة.

9. تحليل البيانات

ملاحظة: يرافق خط أنابيب تحليل البيانات دفتري جوبيتر تفاعليان (MSPT analysis.ipynb, Movie visualization.ipynb). تتوفر دفاتر ملاحظات Jupyter ووحدات Python المكتوبة خصيصا اللازمة لإجراء تحليل MSPT الموضح أدناه في مستودع عام: https://github.com/MSPT-toolkit/MSPT-toolkit. للحصول على تعليمات مفصلة حول التحليل أدناه ، تتم إحالة القراء إلى MSPT analysis.ipynb الذي تم الوصول إليه باستخدام الرابط أعلاه.

  1. معالجة الفيديو
    1. أزل التشتت الثابت المهيمن للضوء باستخدام خوارزمية تقدير الخلفية من حيث البكسل باستخدام الدالة image_processing.mp_reader.
      1. لتطبيق إزالة الخلفية، حدد الخيار continuous_median لوضع المعلمة وقم بتعيين طول مناسب للنافذة الوسطية المنزلقة (window_length) في مقطع دفتر الملاحظات B.1. اختياريا، احفظ الأفلام بعد إزالة الخلفية لاستخدامها في اكتشاف الجسيمات وربط المسار (عن طريق تعيين المعلمة save_processed_movies إلى True).
        ملاحظة: اضبط حجم النافذة (window_length) على القيم بين 101 و 2001 اعتمادا على كثافة الجسيمات على الغشاء ومعامل الانتشار المتوقع ومعدل إطار الاكتساب وسرعة المعالجة المطلوبة.
        تنبيه: تعمل استراتيجية إزالة الخلفية بشكل جيد إذا لم يكن الغشاء مكتظا بكثافة كبيرة وإذا كان انتشار الجسيمات سريعا بما فيه الكفاية (أي أن كل بكسل غير مشغول في معظم الأحيان بجسيم). خلاف ذلك ، سيتم التقليل من شأن تباين الجسيمات بشكل منهجي لأنه لا يمكن تمييزها بشكل صحيح عن إشارة الخلفية. يمكن تعويض ذلك عن طريق زيادة متوسط حجم النافذة على حساب السرعة الحسابية. ومع ذلك ، كن على علم بأن تعيين حجم النافذة كبير جدا قد يؤثر سلبا على الإخراج بسبب انحراف العينة. يعد الفحص البصري لمقاطع الفيديو المعالجة أمرا بالغ الأهمية.
    2. اكتشف الجسيمات وموقعها طوال الفيلم باستخدام الوظيفة particle_fitting.particle_fitter (انظر قسم دفتر الملاحظات B.2).
      1. اضبط حساسية اكتشاف الجسيمات باستخدام معلمة العتبة (الدرس ؛ انظر قسم دفتر الملاحظات B.1) ، والذي يستخدم لتسليط الضوء على البقع المرشحة عن طريق ثنائية الصورة. يمكن فحص تأثير معلمات العتبة المختلفة على حساسية اكتشاف البقع في دفتر ملاحظات منفصل (Movie visualization.ipynb). يتم حفظ نتائج اكتشاف الجسيمات تلقائيا في ملفات CSV في دليل فرعي لملف الفيلم.
        ملاحظة: لا ينصح بتعيين معلمة العتبة منخفضة بشكل تعسفي (على سبيل المثال، بالنسبة للأفلام الملتقطة باستخدام مقياس الكتلة الضوئي المستخدم، معلمة عتبة أقل من 0.0005) لأن البقع المرشحة ستهيمن عليها ضوضاء زائفة وبالتالي إطالة وقت المعالجة.
  2. ربط الجسيمات في إطارات متتالية في مسارات باستخدام مسار حزمة بايثون (v.0.5.0)29.
    ملاحظة: يتم إجراء ربط المسار على الطاير بعد اكتشاف البقعة. ونتيجة لذلك، يتم تخزين ملف CSV إضافي يحتوي على معلومات المسار في دليل فرعي لملف CSV للكشف عن الجسيمات.
    1. قم بإزالة المسارات ذات النقاط القليلة جدا باستخدام المعلمة minimum_trajectory_length (انظر قسم دفتر الملاحظات B.1) لتمكين تحديد قوي لمعاملات الانتشار. للحصول على تفسيرات مفصلة بشأن المعلمات الأخرى لوظائف trackpy ، راجع وثائق trackpy.
  3. تحليل المسار
    1. في قسم دفتر الملاحظات C.1، حدد معدل الإطارات (frame_rate) وحجم البكسل بالنانومتر (pixel_size)، اللذين تم استخدامهما للحصول على الأفلام. أنشئ قائمة بملفات CSV التي تحتوي على معلومات المسار التي تم إرجاعها بواسطة trackpy (راجع الخطوة 9.2) باستخدام الدالة trajectory_analysis.get_csv_files (مقطع دفتر الملاحظات C.2).
    2. بالإضافة إلى ذلك، حدد اسم ملف إخراج لحاوية HDF5، والذي يستخدم لتخزين نتائج التركيب على القرص (مقطع دفتر الملاحظات C.3). قم بتحليل جميع المسارات باستخدام الدالة trajectory_analysis.fit_trajectories في قسم دفتر الملاحظات C.4 ، والذي يتكرر من خلال قائمة ملفات CSV. تستخدم هذه الدالة توزيع مسافة القفز (JDD)30 وتحليل متوسط الإزاحة التربيعية (MSD)31 لتقدير معامل الانتشار لكل مسار.
    3. قم بتحويل التباين الوسيط لكل مسار إلى كتلته المقابلة باستخدام علاقة التباين والكتلة التي تم الحصول عليها من معايرة MSPT (انظر القسم 7). حدد الميل (المنحدر) و y-intercept (الإزاحة) لخط المعايرة ، والذي يربط تباين iSCAT بالكتلة الجزيئية (الدالة trajectory_analysis.apply_calibration ؛ انظر قسم دفتر الملاحظات C.5). تضيف هذه الدالة عمودا بالكتلة الوسيطة للمسار إلى كل إطار بيانات.
    4. قم بتقييم كثافة الجسيمات الظاهرية على الغشاء باستخدام الدالة trajectory_analysis.membrane_density، والتي ترجع قيمة الكثافة المتوسطة من حيث الجسيمات المكتشفة والمسارات الحالية خلال كل إطار (انظر قسم دفتر الملاحظات C.6) كأعمدة إضافية في إطار البيانات.
      ملاحظة: نظرا لأن جزءا من الجسيمات سيفقد أثناء كل من عملية الكشف وربط المسار ، فقد تكون كثافة الجسيمات الفعلية أعلى. للحصول على نتائج موثوقة فيما يتعلق بكثافات الجسيمات وكذلك المدرج التكراري للكتلة، افحص بصريا لقطات الأفلام التمثيلية للتحقق من أن ظروف القياس معقولة لتتبع الجسيمات المفردة (انظر الخطوة 9.1.1).

10. تصور البيانات

  1. توضيح العلاقة بين الكتلة ومعامل الانتشار مع تقدير كثافة النواة ثنائي الأبعاد (KDE) ، والذي يعتمد على حزمة Python fastkde (v.1.0.19 ؛ https://pypi.org/project/fastkde/).
  2. لإنشاء المؤامرة، حدد ملف HDF5 الذي يحتوي على نتائج MSPT (راجع الخطوة 9.3.2 ومقطع دفتر الملاحظات D.1) وحدد واحدا (مقطع دفتر الملاحظات D.2) أو إطار بيانات متسلسلة (مقطع دفتر الملاحظات D.3) كبيانات إدخال لدالة plotting.generate_2D_KDE (مقطع دفتر الملاحظات D.4).
    ملاحظة: يجب أن تحتوي كل مجموعة بيانات مرسومة بشكل مثالي على أكثر من 1000 مسار للحصول على 2D-KDE موثوق.

النتائج

باتباع البروتوكول المفصل الوارد هنا لإعداد الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة (SLBs) في غرف التدفق (الشكل 1) ، يمكن للمرء أن يتعرف بوضوح على نمط يشبه البقع في العرض الأصلي لجميع الظروف المعروضة (الشكل 2). يحدث هذا التأثير بسبب خشونة سطح الزجاج ، والتي تهيمن بشكل عام على إشارة التشتت وتؤدي إلى ظروف لا يمكن تمييزها بصريا (الزجاج ، الزجاج مع SLB ، أو الزجاج مع SLB والبروتينات المرفقة). ومع ذلك ، فإن وجود الحويصلات متميز بوضوح بسبب المقطع العرضي الكبير المتناثر للحويصلات ويتيح ملاحظة تمزق الحويصلات وانصهارها في أغشية متجانسة (الشكل 2B والفيلم التكميلي 1). عند إزالة إشارة التشتت الثابتة للسطح الزجاجي باستخدام نهج نسبي يؤكد على العناصر الديناميكية داخل مجال الرؤية 24,25 ، يمكن للمرء أن يكشف عن البروتينات غير المصنفة المنتشرة على الغشاء (الشكل 2D) بينما يظهر SLB فارغ (الشكل 2C) أو الزجاج نفسه (الشكل 2A) كصورة صاخبة.

يمكن تقدير الخلفية المتأصلة لقياسات MSPT محليا عن طريق قسمة كل قيمة بكسل من خلال متوسط n السابق والتالي للفيلم في نفس موضع الصورة (الشكل 3). ونتيجة لذلك، تظهر الجزيئات الكبيرة كدوال انتشار نقطية متساوية الخواص (PSFs) يمكن ملاحظة حركتها على الغشاء وتتبعها وتحديدها كميا. في الواقع، يتيح توفر كل من التباين والسلوك الديناميكي العلاقة المباشرة للحجم الجزيئي للجسيم بسلوكه المنتشر، وكل ذلك دون الحاجة إلى تسمية الجسيم. ومع ذلك ، لتفسير تباين iSCAT الذي تم تحديده خلال تجارب MSPT ، من الضروري إجراء معايرة تترجم سعة الإشارة إلى كتلة جزيئية. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق ربط الجزيئات الحيوية ذات الكتلة المعروفة ب SLB عن طريق مركب البيوتين-ستربتافيدين-البيوتين (الشكل 4A). كاستراتيجية مثالية ، يمكن للمرء استخدام المتغيرات البيوتينيل من ألبومين مصل البقر (BSA) ، والبروتين A (PRA) ، والفوسفاتيز القلوي (AP) ، والفيبرونيكتين (FN) ، والتي ترتبط بالستربتافيدين (STP) الذي يرتبط في حد ذاته بالدهون المحتوية على البيوتين (Biotinyl Cap PE) في الغشاء. وكما هو مبين في الشكل 4 ألف، فإن التباين المتزايد الوضوح لهذه الجزيئات الكبيرة النموذجية يعكس الوزن الجزيئي المتزايد للمعايير البيوتينيل ذات الصلة. من خلال تعيين كل قمة من المخططات المجسمة للتباين (الشكل 4B) إلى الكتلة المقابلة لحالة أوليغومر البروتين القياسي ، يتم الكشف عن علاقة خطية بين التباين والكتلة21,22 ويمكن استخدامها لاحقا لتحليل أنظمة الجزيئات الكبيرة غير المعروفة (الشكل 4C).

ومن الأمثلة الجيدة التي توضح قابلية تطبيق MSPT وقدراته على تحليل الأوزان الجزيئية وبالتالي دراسة حالات oligomer وأحداث oligomerization هو النظر في الألدولاز البيوتينيل و IgG البيوتينيل (الشكل 5). ويقال عادة أن الألدولاز هو هوموتترامر32. ومع ذلك ، فإن التوزيع الشامل الذي تم حله بواسطة MSPT يتميز بأربع قمم متميزة ، مما يسلط الضوء على وجود مجموعات سكانية متعددة (الشكل 5A). في حين أن الذروة الثانوية الأولى تتوافق مع الستربتافيدين غير المشغول ويمكن توقعها بسبب التكوين في هذا النوع من التجارب ، يمكن أيضا اكتشاف مجمعات الألدولاز التي تحتوي على وحدتين فرعيتين فقط (2SU) أو ست وحدات فرعية (6SU) (الشكل 5B). ومن المثير للاهتمام أن مجمعات الألدولاز-ستربتافيدين رباعية وهيكسامريك تظهر معامل انتشار منخفضا بالمقارنة مع ألدولاز ديمريك والستربتافيدين وحدهما، مما يشير إلى زيادة السحب اللزج، على سبيل المثال، عن طريق ربط دهون بيوتينيل ثانية بالستربتافيدين. وبالمثل ، يظهر IgG البيوتينيل ثلاث قمم في توزيع الكتلة ، مع أول قمة تتطابق مرة أخرى مع كتلة ستربتافيدين واحد. تتوافق كتلة الذروة الأكثر وفرة مع كتلة سلسلة خفيفة واحدة وسلسلة ثقيلة واحدة (1SU) ، أي نصف الجسم المضاد IgG. تم الكشف عن الجسم المضاد الكامل مع نصفين متطابقين (2SU) في حوالي 11 ٪ من الحالات. يشير انخفاض معامل الانتشار مع زيادة الأحجام المعقدة إلى تفاعلات الستربتافيدين مع أكثر من دهون بيوتينيل واحدة أو سحب إضافي ناتج عن IgG المرفق ، أو كليهما.

إلى جانب التحليل الوحيد لحالات القلة المعتمدة على الغشاء ، يمنح MSPT أيضا ميزة خاصة تتمثل في ربط السلوك المنتشر لجزيء كبير ذي أهمية بحالة oligomer الخاصة به. وتظهر النتائج التمثيلية لهذا النوع من التحليل بالنسبة للملحق الخامس (AnV) والوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (CTxB)، التي ترتبط بثنائي oleoylphosphatidylserine (DOPS) أو الدهون الغليكوزفينغولية (GM1)، على التوالي، المدمجة في الغشاء (الشكل 6A). يتميز كل من تقديرات كثافة النواة (KDEs) بتوزيعات أحادية الواسطة للكتلة والانتشار ، مما يشير إلى وجود نوع واحد وفير له سلوك انتشاري مماثل. وجد أن موقع الذروة للكتلة الجزيئية ومعامل الانتشار هو 49.8 ± 2.2 kDa و 1.4 ± 0.1 μm 2 / s ، على التوالي ، ل AnV وكذلك 62.7 ± 3.1 kDa و 0.4 ± 0.1 ميكرومتر2 / ثانية ، على التوالي ، ل CTxB. معاملات الانتشار المقاسة قابلة للمقارنة مع القيم المبلغ عنها سابقا التي تم الحصول عليها من AFM عالي السرعة و FRAP33,34. قد تشير الكتلة المنخفضة قليلا مقارنة بكتلة الجزيء الكبير المتوقع (52 kDa لأداة تقليم AnV ، و 65 kDa ل CTxB pentamer) إلى وجود مجمعات أصغر مع وحدات فرعية أقل في المجموعة. في حين أن فرق الكتلة بين البروتينات صغير وقريب من حد الكشف المحدد للمجهر (≈50 kDa) ، فإن معاملات انتشارها تختلف اختلافا كبيرا. في خليط متساوي المولي، على سبيل المثال، من خلال مقارنة انتشار الخليط بتوزيع AnV و CTxB وحدهما، يمكن للمرء أن يستنتج أن AnV أكثر وفرة على الغشاء من CTxB (الشكل 6B). ومع ذلك ، إذا تضاعف تركيز CTxB مقارنة بتركيز AnV ، يتم تحويل التوازن نحو CTxB باعتباره البروتين السائد على الغشاء. كما هو موضح بالنسبة لمخاليط AnV و CTxB ، لا يسمح MSPT فقط بتمييز الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء وفقا لوزنها الجزيئي ولكنه يتيح أيضا التمييز بين مجموعات الجزيئات الكبيرة المختلفة وفقا لسلوكها المنتشر.

كما هو الحال مع جميع تقنيات الفحص المجهري ، فإن بعض المتطلبات التجريبية حاسمة من أجل تحقيق الجودة المطلوبة للبيانات. مثال مهم في هذا السياق هو أغطية نظيفة تماما. بشكل عام ، يعتبر هذا شرطا أساسيا لتجارب الجزيء الواحد المتعلقة بالفحص المجهري ، ولكن MSPT حساس بشكل خاص لشوائب العينات. يمنع التشتت المتزايد الناشئ عن السطح الزجاجي لقسائم الغطاء غير النظيفة أي قياس iSCAT كمي. ومن الجدير بالذكر أنه حتى الأوساخ المتبقية أو جزيئات الغبار الموجودة على الزجاج غير النظيف بشكل كاف يمكن أن تسبب تشوهات ملحوظة في الصورة ، يمكن التعرف عليها كنقاط مضيئة في وضع التصوير الأصلي (الشكل 7A). على الرغم من إزالة هذه العيوب عن طريق تقدير الخلفية بسبب طبيعتها الثابتة ، إلا أن التحديد الدقيق لتباين الجسيم قد يضعف وبالتالي يؤثر سلبا على تحليله الكمي. مشكلة شائعة أخرى تمت مواجهتها في تجارب MSPT هي الحويصلات المتبقية التي إما تطفو (محاطة باللون البرتقالي) عبر مجال الرؤية أو الحويصلات غير المنصهرة العالقة (المحاطة باللون الأزرق) في موضع محدد على الغشاء وتظهر على شكل مبعثرات نابضة كبيرة (الشكل 7B). لتقليل حدوثها وتدخلها في الحصول على الأفلام ، يوصى بغسل SLB جيدا قبل إضافة البروتين واستخدام مخاليط طازجة من الحويصلات أحادية الصفيحات الصغيرة (SUVs) والكاتيونات الثنائية.

أحد العوامل التي يجب مراعاتها لتصميم تجارب تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة هو كثافة الجزيئات الكبيرة المرتبطة بواجهة الغشاء. يمكن أن تسبب كثافات الجسيمات العالية على الغشاء في الواقع مشاكل لسببين: i) يصبح ربط اكتشافات الجسيمات من الإطارات المتتالية إلى المسارات غامضا وبالتالي يزيد من احتمال حدوث أخطاء ومعاملات انتشار خاطئة. ب) تصبح كتلة الجسيمات، التي تستخرج من سعة ملاءمة PSF المقابلة لها، أقل من قيمتها بشكل منهجي وتتسع قمم الكتلة لأن فصل إشارة الخلفية الثابتة عن إشارة الجسيمات الديناميكية يزداد صعوبة (الشكل 7C). في الوقت الحالي ، يصعب التقييم البصري لجودة البيانات في عملية الحصول على مقاطع فيديو MSPT على المجاهر التجارية المتاحة لأن عرض قياس النسبة المنفذ في برنامج الاقتناء يستخدم إزالة الخلفية المحددة للقياس الضوئي الجماعي21 بدلا من الخوارزمية الوسيطة الموضحة هنا وفي المراجع24,25 (الشكل 7D ). تؤدي إزالة الخلفية المستمرة القائمة على المتوسط المستخدمة لتصور جزيئات الهبوط في القياس الضوئي الشامل إلى ظهور الجسيمات المنتشرة كواجهات مظلمة ذات ذيول ساطعة ، مما يجعل البقع تبدو متباينة للغاية وتتداخل مع تركيب PSF أثناء إجراء الكشف. وبالتالي ، فإن استخدام معالجة الصور القائمة على المتوسط المنفذة في برنامج الاقتناء غير مناسب لتحليل الجزيئات الحيوية المنتشرة على الأغشية.

figure-results-8619
الشكل 1: مخطط تدفق العملية للخطوات الفردية المطلوبة لتحليل تفاعلات غشاء البروتين مع تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة (MSPT). لإعداد عينات لقياسات MSPT ، يجب تنظيف شرائح الغطاء الزجاجي جيدا وتنشيطها باستخدام بلازما الأكسجين. بعد تجميعها في غرف تدفق العينات، يتم إعداد حويصلات أحادية الصفيحة الصغيرة (SUVs) لتشكيل الطبقة الثنائية للدهون المدعومة (SLB) ويتم ترشيح جميع المخازن المؤقتة للتفاعل لتقليل تشتت الخلفية. تضاف سيارات الدفع الرباعي لتشكيل طبقات ثنائية الدهون في غرف التدفق. اختياريا ، يمكن إضافة الكاتيونات الثنائية مثل أيونات Ca2 + إلى سيارات الدفع الرباعي لتعزيز تمزق الحويصلة. أخيرا ، يتم مسح تركيزات منخفضة من البروتين محل الاهتمام في غرفة التفاعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9627
الشكل 2: العرض الأصلي والنسبي للأسطح النموذجية ذات الصلة بقياسات MSPT. صور تمثيلية لخشونة سطح شريحة الغطاء الزجاجي (A) ، أثناء تكوين طبقة ثنائية الدهون المدعومة (B) ، مع طبقة ثنائية الدهون المدعومة سليمة (C) والبروتينات المثالية المعاد تشكيلها على SLB (D). يتم عرض جميع الأمثلة الأربعة في الوضع الأصلي ، والذي يمكن الوصول إليه أثناء القياس نفسه ، وكصور قياس النسبة المعالجة بعد إزالة الخلفية المستندة إلى الوسيط. تمثل أشرطة المقياس 1 ميكرومتر. لتحليل البيانات (انظر دفتر ملاحظات Jupyter المصحوب؛ الخطوة 9)، تم استخدام المعلمات التالية: متوسط حجم النافذة (window_length) = 1001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10633
الشكل 3: رسم تخطيطي خطوة بخطوة للمراحل المطلوبة لجمع بيانات MSPT وتحليلها. بعد الحصول على البيانات للعينة ذات الأهمية على مقياس الكتلة الضوئي ، تتم معالجة الأفلام لإزالة الخلفية الثابتة من خلال نهج متوسط منزلق من خلال البكسل. بعد ذلك، يتم تحديد الجسيمات المرشحة وتركيبها بواسطة دالة انتشار النقطة (PSF) قبل ربطها بمسارات الجسيمات. لتمكين تحديد معامل الانتشار لكل جسيم ، يتم استخدام تحليل متوسط الإزاحة التربيعية (MSD) أو توزيع مسافة القفز (JDD). في هذه المرحلة ، يمكن تحويل قيم التباين إلى كتل جزيئية وفقا لعلاقة التباين والكتلة المحددة من خلال استراتيجية المعايرة. كخطوة أخيرة ، يمكن تصفية المسارات بناء على طولها أو كثافة جسيمات الغشاء وتصورها من خلال تقدير كثافة النواة ثنائي الأبعاد (2D-KDE). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-11673
الشكل 4: معايرة علاقة الكتلة إلى التباين لقياسات MSPT. (أ) الإطارات التمثيلية النسبية التي تم الحصول عليها لمجمعات البروتين النموذجية القياسية للستربتافيدين المنتشرة على طبقة ثنائية الدهون المدعومة تحتوي على نسبة مئوية صغيرة من الدهون البيوتينيل (DOPC:DOPG:Biotinyl Cap PE نسبة 70:29.99:0.01 مول). كمعايير نموذجية للوزن الجزيئي ، يتم عرض الستربتافيدين 28 أحادي التكافؤ (STP فقط) أو الستربتافيدين28 ثنائي التكافؤ في المركب مع ألبومين مصل البقر الحيوي (BSA) أو البروتين البيوتينيل A (PRA) أو الفوسفاتيز القلوي البيوتينيل (AP) أو الفيبرونيكتين الحيوي (FN). يتم تمييز البقع المرشحة باللون البرتقالي (الدوائر المتقطعة) ويتم تمييز اكتشافات الجسيمات الناجحة باللون الأحمر (الدوائر الصلبة). تمثل أشرطة المقياس 1 ميكرومتر (B) توزيعات الكثافة الاحتمالية لقيم التباين التي تم الحصول عليها للبروتينات القياسية الخمسة النموذجية. تمثل جميع البيانات المعروضة توزيعات مجمعة لثلاث تجارب مستقلة لكل شرط: STP n فقط = 82,719; BSA n = 9,034; prA n = 22,204; AP n = 69,065 ، و FN n = 71,759 مسار. بالمقارنة مع أعداد الجسيمات المحددة للأغشية التي تحتوي على بروتينات ، فإن عدد الجسيمات المكتشفة على طبقة ثنائية فارغة لا يكاد يذكر عند كثافات غشاء معتدلة (الشكل التكميلي 1). يتم تمييز قمم التباين التي يتم النظر فيها لمعايرة الكتلة من خلال خطوط مستمرة بينما تمثل القمم المتقطعة حالات oligomer غير المدروسة. (ج) منحنى معايرة التباين إلى الكتلة المستمد من تباينات الذروة في اللوحة D وكتل التسلسل الخاصة بكل من المجمعات. تعرض أشرطة الخطأ الخطأ القياسي لمواقع الذروة المقدرة بواسطة bootstrapping (100 عملية إعادة تشكيل مع 1000 مسار لكل منها). لتحليل البيانات (انظر دفتر ملاحظات Jupyter ؛ الخطوة 9) ، تم استخدام المعلمات التالية: متوسط حجم النافذة (window_length) = 1001 إطار ، عتبة الكشف (الدرس) = 0.00055 ، نطاق البحث (dmax) = 4 بكسل ، الذاكرة (max_frames_to_vanish) = 0 إطار ، الحد الأدنى لطول المسار (minimum_trajectory_length) = 7 إطارات (STP فقط) ، 9 إطارات (BSA / FN) ، 15 إطارا (prA) ، 10 إطارات (AP). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-14130
الشكل 5: فك رموز حالات الأوليغومر للبروتينات المرتبطة بالغشاء. (أ) تقديرات كثافة النواة 2D لكل من الكتلة ومعامل الانتشار للستربتافيدين رباعي التكافؤ في مجمع مع ألدولاز البيوتينيل (اللوحة اليسرى) أو مع جسم مضاد للأرنب IgG معدل بالبيوتين (اللوحة اليمنى). تم إجراء إعادة تكوين كلا المعقدين على طبقة ثنائية الدهون مدعومة تحتوي على DOPC و DOPG و Biotinyl Cap PE بنسبة 70: 29.99: 0.01 mol ٪ ، على التوالي. في المجموع ، تم تضمين 116,787 مسارا لثلاثة تكرارات مستقلة لمركب streptavidin-aldolase (كثافة الجسيمات 0.1 ميكرومتر - 2) و 348،405 لمركب streptavidin-IgG (كثافة الجسيمات 0.1 ميكرومتر - 2). تم تضمين الجسيمات فقط التي يبلغ طول مسارها خمسة إطارات على الأقل. يتم عرض التوزيعات الاحتمالية الهامشية لكل من الكتلة الجزيئية (أعلى) ومعامل الانتشار (يمين). يمثل اللون الأسود x في كلتا اللوحتين الحد الأقصى المحلي لكل من KDE. (ب) مقارنة كتل القلة المحددة لمركب الستربتافيدين رباعي التكافؤ مع الألدولاز المعدل بالبيوتين (اللوحة اليسرى) أو IgG البيوتينيل (اللوحة اليمنى) مع الأوزان الجزيئية المتوقعة، وفقا لكتل التسلسل. يتم تقديم الاختصار SU نيابة عن الوحدة الفرعية لبروتين المصالح. تعرض أشرطة الخطأ الخطأ القياسي لمواقع الذروة المقدرة بواسطة bootstrapping (100 عملية إعادة تشكيل مع 1000 مسار لكل منها). لتحليل البيانات (انظر دفتر ملاحظات Jupyter المصحوب؛ الخطوة 9)، تم استخدام المعلمات التالية: متوسط حجم النافذة (window_length) = 1001 إطار، عتبة الكشف (درس) = 0.00055، نطاق البحث (dmax) = 4 بكسل، الذاكرة (max_frames_to_vanish) = 0 إطارات، الحد الأدنى لطول المسار (minimum_trajectory_length) = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-16099
الشكل 6: إذابة السلوك المنتشر للبروتينات الأصلية المتفاعلة مع الأغشية الملحقة V (AnV) والوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (CTxB). (A) تقديرات كثافة النواة 2D لكل من الكتلة ومعامل الانتشار للملحق V (اللوحة اليسرى) والوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (اللوحة اليمنى). لإعادة تكوين غشاء AnV و CTxB ، تم استخدام تركيبات دهنية من 80: 20 mol٪ DOPC إلى DOPS و 99.99: 0.01 mol٪ DOPC إلى GM1 ، على التوالي. في المجموع ، تم تضمين 206,819 مسارا لثلاثة نسخ متماثلة مستقلة ل AnV (كثافة الجسيمات 0.1 ميكرومتر-2) و 142,895 مسارا ل CTxB (كثافة الجسيمات 0.2 ميكرومتر-2). (ب) تقديرات كثافة النواة ثنائية الأبعاد لمخاليط CTxB و AnV بنسبة 1: 1 (اللوحة اليسرى) أو 2: 1 (اللوحة اليمنى) ، على التوالي. تم إجراء إعادة تكوين مخاليط البروتين على طبقة ثنائية الدهون مدعومة تحتوي على دهون DOPC و DOPS و GM1 بنسبة 80: 19.99: 0.01 مول٪. في المجموع ، تم تضمين 42,696 مسارا لثلاثة تكرارات مستقلة للخليط 1: 1 (كثافة الجسيمات 0.1 ميكرومتر -2) و 264,561 مسارا لنسبة 2: 1 (كثافة الجسيمات 0.3 ميكرومتر -2). بالنسبة لكل من (A) و (B) ، تم تضمين الجسيمات التي يبلغ طول مسارها خمسة إطارات على الأقل فقط. يتم عرض التوزيعات الاحتمالية الهامشية لكل من الكتلة الجزيئية (أعلى) ومعامل الانتشار (يمين). يمثل الحرف الأبيض x في كل لوحة الحد الأقصى العالمي ل KDE. لتحليل البيانات (انظر دفتر ملاحظات Jupyter المصحوب؛ الخطوة 9)، تم استخدام المعلمات التالية: متوسط حجم النافذة (window_length) = 1001 إطار، عتبة الكشف (درس) = 0.00055، نطاق البحث (dmax) = 4 بكسل، الذاكرة (max_frames_to_vanish) = 0 إطار، الحد الأدنى لطول المسار (minimum_trajectory_length) = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-18143
الشكل 7: المضاعفات المحتملة في سياق قياسات MSPT أو أثناء تحليل البيانات . (أ) صور تمثيلية لخشونة السطح المعروضة في كل من العرض الأصلي والمعالج (إزالة الخلفية على أساس وسيط) عرض متري لشريحة زجاجية غير نظيفة. وفي كلتا الحالتين، تشكل البقع المضيئة شوائب سطحية متبقية تعوق القياسات الخالية من القطع الأثرية. (ب) صور نموذجية للحويصلات المتبقية في مجال الرؤية بعد عدم كفاية غسل الغشاء. كل من الحويصلات الثابتة (المميزة باللون الأزرق) والمنتشرة (المميزة باللون البرتقالي) ستضعف جودة القياس إما بسبب النبض والتذبذب أو بسبب حركتها الاتجاهية ، على التوالي. (ج) يتطلب MSPT ، كتقنية جسيم واحد ، كثافات جسيمات منخفضة (صورة تمثيلية ، لوحة علوية) لتمكين الربط السليم وتحديد الكتلة لكل جسيم. في حالة كثافات الجسيمات الغشائية العالية (اللوحة الوسطى) ، يضعف تركيب الجسيمات ، مما يؤثر على تحديد الكتلة (انظر اللوحة السفلية). (د) الصور التمثيلية النسبية للمجزيئات المنتشرة على واجهة غشائية بعد إزالة الخلفية القائمة على المتوسط (اللوحة العلوية) أو القائمة على الوسط. بالنسبة للجسيمات المنتشرة، تنتج استراتيجية إزالة الخلفية القائمة على المتوسط صورا مشوهة ل PSF للجسيم كما يمكن رؤيته في الإدخالات الصغيرة بين اللوحة العلوية والوسطى. وعلى النقيض من ذلك، يمكن الحصول على الجسيمات غير المشوهة PSFs من خلال النهج القائم على الوسيط. اللوحة السفلية: مقارنة ملفات تعريف الخط من خلال مركز PSF التي تم الحصول عليها بعد إزالة الخلفية المتوسطة أو المتوسطة. بالنسبة لجميع الصور الأصلية والنسبة المعروضة في هذا الشكل ، تمثل أشرطة المقياس 1 ميكرومتر. لتحليل البيانات (انظر دفتر ملاحظات Jupyter المصحوب؛ الخطوة 9)، تم استخدام المعلمات التالية: متوسط حجم النافذة (window_length) = 1001 إطار، عتبة الكشف (درس) = 0.00055، نطاق البحث (dmax) = 4 بكسل، الذاكرة (max_frames_to_vanish) = 0 إطارات، الحد الأدنى لطول المسار (minimum_trajectory_length) = 5. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: مقارنة بين الأغشية الخالية من البروتين والأغشية المشغولة. صور تمثيلية لطبقة ثنائية الدهون مدعومة سليمة قبل (A) وبعد (B) إضافة الستربتافيدين النقي (STP). يتم تطويق مواقع المرشحين التي تم ملاءمتها بنجاح لنموذج PSF باللون الأحمر. (ج) التوزيعات الاحتمالية المتباينة للجسيمات المكتشفة على غشاء فارغ (خلفية غشائية، رمادية) وعلى طبقة ثنائية مع جسيمات ستربتافيدين منتشرة (أزرق). يمثل كلا التوزيعين الاحتماليين البيانات المجمعة لثلاث تجارب مستقلة مع معلمات متطابقة للحصول على الأفلام وتحليلها. لتحليل البيانات (انظر دفتر ملاحظات Jupyter المصحوب؛ الخطوة 9)، تم استخدام المعلمات التالية: متوسط حجم النافذة (window_length) = 1001 إطار، عتبة الكشف (درس) = 0.00055، نطاق البحث (dmax) = 4 بكسل، الذاكرة (max_frames_to_vanish) = 0 إطار، الحد الأدنى لطول المسار (minimum_trajectory_length) = 7 إطارات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيلم التكميلي 1: فيلم مثالي يظهر تمزق الحويصلات وانصهارها في غشاء متجانس مسجل باستخدام مقياس الكتلة الضوئية. متوسط حجم نافذة معالجة الصور (window_length) = 1001 إطار. شريط المقياس: 1 ميكرومتر. نطاق عدد الكاميرات: أسود = 16,892; أبيض = 65,408. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

الفيلم التكميلي 2: أفلام نموذجية تظهر انتشار مجمعات الملحق V (أعلى) والألدولاز البيوتينيل (السفلي) على طبقة ثنائية كما تم الحصول عليها من قياسات MSPT. متوسط حجم نافذة معالجة الصور (window_length) = 1001 إطار. شريط المقياس: 1 ميكرومتر. نطاق تباين تشتت التداخل: أسود = -0.0075; أبيض = 0.0075. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

Discussion

يمتد البروتوكول المقدم إلى قياس الكتلة الضوئية21 ، وهي تقنية تحلل كتلة الجزيئات الحيوية المفردة التي تمتص على الزجاج ، إلى أداة أكثر تنوعا قادرة على قياس كتلة وانتشار الجزيئات الحيوية المتفاعلة مع الأغشية غير المصنفة في وقت واحد. يتم تحقيق امتداد التحليل هذا من خلال تنفيذ استراتيجية إزالة خلفية معدلة تتكيف مع الحركة الجانبية للجزيئات24,25. بشكل عام ، تعد إزالة الخلفية ذات أهمية قصوى للنهج القائمة على iSCAT ، نظرا لأن التشتت القوي لخشونة سطح الزجاج يمثل عائق التحليل الرئيسي ، والتحديد الدقيق للخلفية المحلية لكل بكسل أمر ضروري لتحديد كتلة الجسيمات وموقعها. إلى جانب تحليل الصور المتكيف مع حركة الجسيمات ، فإن اكتشاف الجسيمات اللاحق ، وربط المسار ، وتحليل البيانات يكمل التوسع الجديد ل MP في تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة (MSPT).

بشكل عام ، تعد شرائح الغطاء الزجاجي التي تم تنظيفها جيدا وبيئة العمل النظيفة متطلبات حاسمة للأداء الناجح لتجارب MSPT. نظرا لعدم وجود علامات على الجزيئات الكبيرة ، فإن الإشارة المكتسبة غير انتقائية بطبيعتها. ومن ثم فإن العينات النظيفة، فضلا عن المعالجة السليمة للعينات، أمران حاسمان لضمان عدم إساءة تفسير الملاحظات. على وجه الخصوص ، عندما يتم فحص جزيئات ذات وزن جزيئي منخفض ، يتم اعتماد قياسات التحكم في الأغشية الخالية من البروتين لتقييم المساهمات الأساسية (الشكل التكميلي 1). إلى جانب إدراج قياسات التحكم ، يوصى بالتالي باتباع خطوات التحضير الموضحة في الشكل 2 لكل غرفة تدفق. عند الجمع بين تدابير السلامة هذه ، ستضمن أن الإشارة المكتشفة تنشأ من الجزيء الحيوي محل الاهتمام وليس ، على سبيل المثال ، غرفة تدفق ملوثة أو عازلة أو غشاء.

إلى جانب الاحتياطات المتعلقة بالتصميم التجريبي ، يجب أيضا توخي الحذر أثناء معالجة صور MSPT. أثناء معالجة الفيديو، ينبغي اختيار قيمة ثلاثة معلمات بعناية لضمان النتائج الصحيحة: أ) طول النافذة الوسيطة لإزالة الخلفية، ب) عتبة اكتشاف الجسيمات، و ج) الحد الأقصى لنصف قطر البحث أثناء مهمة الربط. تسهل النافذة الوسيطة الأكبر (i) بشكل عام فصل الجسيمات المنتشرة عن الخلفية شبه الثابتة المتراكبة. ومع ذلك ، بالنسبة لأحجام النوافذ الكبيرة جدا ، سيصبح انجراف العينة ملحوظا في النهاية ويقلل من دقة تقدير الخلفية. تعتمد الإعدادات المثلى بشكل كبير على خصائص العينة وظروف القياس. ومع ذلك، يمكن استخدام قيمة 1001 كنقطة انطلاق قوية. يجب ضبط معلمة العتبة (ii) اعتمادا على أدنى كتلة جزيئية متوقعة في العينة. لا ينصح باستخدام قيمة أقل من 0.0005 للقياسات المأخوذة باستخدام مقياس الكتلة الضوئي المستخدم في هذه الدراسة. لتسريع أوقات التحليل ، يمكن اختيار قيم أعلى إذا كان من المتوقع عينة ذات وزن جزيئي مرتفع. يحدد نصف قطر البحث في ربط المسار (iii) المسافة الشعاعية القصوى بالبكسل التي سيتم فيها البحث عن موقع الجسيم المتحول في إطارات متتالية. وينبغي تكييفه مع أسرع جسيم في العينة، وإذا فضل ذلك، يمكن استخدام نطاق بحث تكيفي (انظر وثائق trackpy) بدلا من ذلك لتقليل وقت الحساب. خاصة خلال المرحلة الأولية من المشروع ، يوصى بإعادة تحليل الأفلام بمعلمات مختلفة للتحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها.

في ضوء طبيعة الجزيء الواحد ل MSPT ، يجب تجنب القياس عند كثافات جسيمات غشائية عالية لأن تلك يمكن أن تتداخل مع التباين الدقيق وتحديد الكتلة. وقد تبين أن الكثافات التي تقل عن جسيم واحد لكل ميكرومتر مربع مواتية لقياسات MSPT24. وهناك اعتبار إضافي هو معاملات الانتشار المتوقعة في العينة. على الرغم من انطباقه على مجموعة واسعة من معاملات الانتشار ، إلا أن MSPT لديه حد أدنى من معاملات الانتشار التي يمكن الوصول إليها. يؤدي الحبس المحلي إلى منطقة قليلة البكسل خلال جزء كبير من فترة النافذة المتوسطة إلى دمج الجسيم مع الخلفية الثابتة. بالنسبة لظروف التصوير المستخدمة في هذا البروتوكول ، لا ينصح بقياس معاملات الانتشار أقل من 0.01 ميكرومتر2 / ثانية. عند سرعة الانتشار هذه، على سبيل المثال، يبلغ متوسط الإزاحة التربيعية للجسيم خلال النافذة المتوسطة نصف الحجم حوالي 4 بكسل، وبالتالي يكون حجمها مشابها لمدى PSF. ونتيجة لذلك، من المرجح أن يحتوي تقدير الخلفية الثابتة على مساهمات إشارة من الجسيم نفسه، مما يؤدي إلى تباين منخفض على ما يبدو للجسيم حتى يقترب في النهاية من مستوى الضوضاء. ومع ذلك ، يمكن بوضوح حل معاملات انتشار الجزيئات الكبيرة التي تتراوح بين 0.05 و 10 ميكرومتر2 / ثانية.

لتوسيع نطاق تطبيقات MSPT ، يمكن للمرء أن يتصور تقدما في خوارزمية الخلفية المستندة إلى الوسيط من خلال القضاء على وحدات البكسل التي تشغل مؤقتا بجسيم ، أو عن طريق تصحيح انحراف العينة مما يتيح أحجام نوافذ وسيطة أكبر. ومن شأن كلا النهجين أن يخفف من المشاكل المتعلقة بالقياسات عند كثافات الجسيمات العالية والانتشار البطيء. تلوح في الأفق تحسينات من حيث حساسية الكتلة المنخفضة مع جيل جديد من مقاييس الكتلة الضوئية ، والتي قد توفر الوصول إلى جزيئات حيوية أصغر من 50 كيلو دالتون. لذلك ، ستكون تجارب MSPT المستقبلية قادرة على دراسة ديناميكيات الجزيء الواحد والتفاعلات المتعلقة بالغشاء لمجموعة أوسع من محاكيات الأغشية مثل الطبقات الثنائية المبطنة والأنظمة الجزيئية الكبيرة.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن نقدر بصدق الدعم المقدم من فيليب كوكورا وجافين يونغ وفريق برامج Refeyn ونعترف بمساعدتهم من خلال مشاركة أجزاء من رمز تحليل الصور. نشكر مرفق Cryo-EM MPIB Core على توفير الوصول إلى مقياس الفوتومتر الضوئي الجماعي Refeyn التجاري. ويعرب ف. س. عن امتنانه للدعم والتمويل اللذين منحهما يورغن بليتزكو وفولفغانغ بوميستر. تلقى T.H. و P.S. تمويلا من خلال Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) - 201269156 معرف المشروع - SFB 1032 (A09). تم دعم N.H. من خلال منحة عودة DFG HU 2462/3-1. PS تعترف بالدعم من خلال شبكة الأبحاث MaxSynBio من خلال مبادرة التمويل المشترك بين الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (BMBF) وجمعية ماكس بلانك.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
annexin VSigma Aldrich#SRP8026examplary membrane-interacting protein
Bio-Rad Protein AssayBio-Rad Laboratories Inc.#5000006bradford assay kit to determine protein stock concentrations
biotin labeled bovine albuminSigma Aldrich#A8549examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
cholera toxin subunit BSigma Aldrich#SAE0069examplary membrane-interacting protein
cover glasses, #1.5, 24 x 24 mmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG#0102062
cover glasses, #1.5, 24 x 60 mmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG#0102242
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids#850375lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (18:1 Biotinyl Cap PEAvanti Polar Lipids#870273lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DOPG)Avanti Polar Lipids#840475lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS)Avanti Polar Lipids#840035lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
double-sided tapetesa#57912-00000-02needed for the assembly of glass sample chambers
ExtruderAvanti Polar Lipids#610023Lipid extruder to enable monodisperse vesicle distributions
EZ-Link Maleimide-PEG2-BiotinThermo Fisher Scientific#A39261maileimide-fused biotin that can be used to biotinylate standard proteins for MSPT
Fibronectin (Biotinylated)Cytoskeleton Inc.#FNR03-Aexamplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Gel Filtration HMW Calibration KitCytiva#28403842standard proteins, e.g. aldolase that can be biotinylated and used as molecular weight standards for MSPT
GM1 Ganglioside (Brain, Ovine-Sodium Salt)Avanti Polar Lipids#860065lipid - in the form of extruded small unilamellar vesicles required for supported lipid bilayer formation
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, BiotinThermo Fisher Scientific, Waltham, USA)#31820examplary protein to highlight the existence of different protein states
Isopropanol, 99.5%, for spectroscopyThermo Fisher Scientific#10003643
Low Autofluorescence Immersion OilOlympus K.K.#IMMOIL-F30CC
pET21a-Streptavidin-AliveAddgene#20860required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other
pET21a-Streptavidin-DeadAddgene#20859required to express and purify divalent streptavidin in combination with each other
Pierce Alkaline Phosphatase, biotinylatedThermo Fisher Scientific#29339examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Pierce Protein A, BiotinylatedThermo Fisher Scientific#29989examplary protein that can be used as standard protein for MSPT
Refeyn AcquireRefeyn Ltd.control software for Refeyn OneMP
Refeyn OneRefeyn Ltd.-mass photometer
sterile syringe filters 0.45 µm cellulose acetate membraneVWR International#514-0063needed to filter particles from the buffer of interest
tetravalent streptavidinThermo Fisher Scientific#SNN1001tetravalent streptavidin to enable the presence of several biotin binding sites
Whatman Nuclepore Hydrophilic Membrane, 0.05 µm Pore Size, 25 mm CircleCytiva#110603a pore size of 50 nm is recommended for supported lipid bilayer formation in the context of MSPT
Zepto model 2 plasma cleanerDiener electronic GmbH-

References

  1. Robertson, J. L. The lipid bilayer membrane and its protein constituents. Journal of General Physiology. 150 (11), 1472-1483 (2018).
  2. Grecco, H. E., Schmick, M., Bastiaens, P. I. H. Signaling from the Living Plasma Membrane. Cell. 144 (6), 897-909 (2011).
  3. Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 119-151 (2005).
  4. Whited, A. M., Johs, A. The interactions of peripheral membrane proteins with biological membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 192, 51-59 (2015).
  5. Gonzalez, L., Scheller, R. H. Regulation of membrane trafficking: Structural insights from a Rab/effector complex. Cell. 96 (6), 755-758 (1999).
  6. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  7. Bagheri, Y., Ali, A. A., You, M. Current methods for detecting cell membrane transient interactions. Frontiers in Chemistry. 8, 603259(2020).
  8. Miller, H., Zhou, Z., Shepherd, J., Wollman, A. J. M., Leake, M. C. Single-molecule techniques in biophysics: A review of the progress in methods and applications. Reports on Progress in Physics. 81 (2), 024601(2018).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: From methods to biophysical insights. Reports on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).
  10. Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331 (6155), 450-453 (1988).
  11. Funatsu, T., Harada, Y., Tokunaga, M., Saito, K., Yanagida, T. Imaging of single fluorescent molecules and individual ATP turnovers by single myosin molecules in aqueous solution. Nature. 374 (6522), 555-559 (1995).
  12. Schmidt, T., Schütz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (7), 2926-2929 (1996).
  13. Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
  14. Kukura, P., et al. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
  15. Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405(2006).
  16. Ueno, H., et al. Simple dark-field microscopy with nanometer spatial precision and microsecond temporal resolution. Biophysical Journal. 98 (9), 2014-2023 (2010).
  17. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Herold, C., Kruse, K., Schwille, P. Min protein patterns emerge from rapid rebinding and membrane interaction of MinE. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (5), 577-583 (2011).
  18. Bezeljak, U., Loya, H., Kaczmarek, B., Saunders, T. E., Loose, M. Stochastic activation and bistability in a Rab GTPase regulatory network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (12), 6504-6549 (2020).
  19. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63 (1), 595-617 (2012).
  20. Garcia-Parajo, M. F., Segers-Nolten, G. M. J., Veerman, J. A., Greve, J., Van Hulst, N. F. Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7237-7242 (2000).
  21. Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
  22. Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495(2014).
  23. Cole, D., Young, G., Weigel, A., Sebesta, A., Kukura, P. Label-free single-molecule imaging with numerical-aperture-shaped interferometric scattering microscopy. ACS Photonics. 4 (2), 211-216 (2017).
  24. Heermann, T., Steiert, F., Ramm, B., Hundt, N., Schwille, P. Mass-sensitive particle tracking to elucidate the membrane-associated MinDE reaction cycle. Nature Methods. 18 (10), 1239-1246 (2021).
  25. Foley, E. D. B., Kushwah, M. S., Young, G., Kukura, P. Mass photometry enables label-free tracking and mass measurement of single proteins on lipid bilayers. Nature Methods. 18 (10), 1247-1252 (2021).
  26. Voss, O. H., Lee, H. N., Tian, L., Krzewski, K., Coligan, J. E. Liposome preparation for the analysis of lipid-receptor interaction and efferocytosis. Current Protocols in Immunology. 120, 1-21 (2018).
  27. Pincet, F., et al. FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments. PLoS ONE. 11 (7), 0158457(2016).
  28. Howarth, M., et al. A monovalent streptavidin with a single femtomolar biotin binding site. Nature Methods. 3 (4), 267-273 (2006).
  29. Allan, D., et al. soft-matter/trackpy: Trackpy v.0.5.0. Zenodo. , (2021).
  30. Weimann, L., et al. A quantitative comparison of single-dye tracking analysis tools using Monte Carlo simulations. PLoS ONE. 8 (5), 64287(2013).
  31. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4), 041914(2010).
  32. Sygusch, J., Beaudry, D., Allaire, M. Molecular architecture of rabbit skeletal muscle aldolase at 2.7-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (22), 7846-7850 (1987).
  33. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9 (1), 4983(2018).
  34. Day, C. A., Kenworthy, A. K. Mechanisms underlying the confined diffusion of cholera toxin B-subunit in intact cell membranes. PLOS ONE. 7 (4), 34923(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180 iSCAT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved