JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لا يزال الكشف السريع والقياس الكمي الموثوق به لأحداث تحرير الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم أمرا صعبا ويعتمدان حاليا على طرق تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة (μTGGE) كطريقة بسيطة وسريعة ومحمولة للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي.

Abstract

تحرير الحمض النووي الريبي هو عملية تؤدي إلى تغييرات تسلسل ما بعد النسخ في الحمض النووي الريبي. يعتمد الكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي وتحديده كميا بشكل أساسي على تقنيات تسلسل Sanger وتسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطرق مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام نظام الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة المحمول (μTGGE) كنهج غير تسلسلي للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي. وتستند العملية إلى مبدأ الرحلان الكهربائي، الذي يستخدم درجات حرارة عالية لتشويه عينات الأحماض النووية أثناء تحركها عبر هلام بولي أكريلاميد. عبر مجموعة من درجات الحرارة ، تشكل شظية الحمض النووي تدرجا من الحمض النووي المزدوج بالكامل إلى خيوط منفصلة جزئيا ثم إلى حمض نووي منفصل تماما. تنتج المواقع التي تم تحريرها بواسطة الحمض النووي الريبي مع قواعد النيوكليوتيدات المتميزة ملفات تعريف ذوبان مختلفة في تحليلات μTGGE. استخدمنا النهج القائم على μTGGE لتوصيف الاختلافات بين ملفات تعريف الذوبان لأربعة أجزاء من الحمض النووي الريبي المحررة والأجزاء المقابلة غير المحررة (من النوع البري). تم حساب درجات تشابه النمط (PaSSs) من خلال مقارنة أنماط النطاق التي تنتجها الحمض النووي الريبي المحرر وغير المحرر وتم استخدامها لتقييم قابلية تكرار الطريقة. بشكل عام ، تتيح المنصة الموضحة هنا اكتشاف طفرات قاعدة واحدة في الحمض النووي الريبي بطريقة مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة. ومن المتوقع أن تساعد أداة التحليل هذه في التوصل إلى نتائج جديدة في البيولوجيا الجزيئية.

Introduction

يمكن أن تشير متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs) في الحمض النووي الريبي الجينومي ، بما في ذلك متغيرات A-to-I و C-to-U و U-to-C ، إلى أحداث تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، فإن اكتشاف SNVs في الحمض النووي الريبي لا يزال مهمة صعبة تقنيا. تقليديا ، يتم تحديد نسبة الحمض النووي الريبي المحرر إلى الحمض النووي الريبي غير المعدل عن طريق التسلسل المباشر ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) الخاص بالأليل ،أو تغيير طبيعة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى 1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب ليست فعالة من حيث الوقت أو التكلفة بشكل خاص ، ودقتها المنخفضة ، الناجمة عن ارتفاع مستويات الضوضاء ، تشكل اختناقات تكنولوجية للكشف عن SNV القائم على الحمض النووي الريبي 7,8. هنا ، نصف بروتوكولا يعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة (TGGE) لتحديد تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة (SNPs) كطريقة بديلة تلغي الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة لتحليلات تحرير الحمض النووي الريبي.

الرحلان الكهربائي هو الطريقة المفضلة لفصل وتحليل الجزيئات الحيوية في مختبرات علوم الحياة. يتيح TGGE فصل شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي هي بنفس الحجم ولكن لها تسلسلات مختلفة. تعتمد هذه التقنية على الاختلافات المرتبطة بالتسلسل في درجات حرارة انصهار شظايا الحمض النووي والتغيرات اللاحقة في تحركاتها في المواد الهلامية المسامية مع تدرج درجة حرارة خطي 9,10. ذوبان شظايا الحمض النووي يولد ملامح ذوبان محددة. بمجرد أن يصل المجال ذو أدنى درجة حرارة انصهار إلى درجة الحرارة المقابلة في موضع معين في الجل ، يحدث الانتقال من بنية حلزونية إلى بنية مذابة جزئيا ، وسيتوقف ترحيل الجزيء عمليا. لذلك ، يستخدم TGGE كلا من التنقل (معلومات الحجم) والتحولات الهيكلية الناجمة عن درجة الحرارة لشظايا الحمض النووي (المعلومات المعتمدة على التسلسل) ، مما يجعلها نهجا قويا لتوصيف شظايا الحمض النووي. نقاط السمة في نمط انصهار TGGE ، والتي تتوافق مع ثلاثة تحولات هيكلية لجزيء الحمض النووي ، هي نقطة التفكك الأولي للحبلا ، ونقطة التفكك منتصف الخيط ، ونقطة التفكك النهائية للحبلا (الشكل 1). تؤثر اختلافات التسلسل داخل المجالات ، حتى الاختلافات أحادية القاعدة ، على درجة حرارة الانصهار ، وبالتالي ، فإن الجزيئات ذات التسلسلات المختلفة ستظهر أنماط ذوبان منفصلة (تمسخ) في تحليلات TGGE. لذلك ، يمكن استخدام TGGE لتحليل SNVs في الحمض النووي الريبي الجينومي ويمكن أن يكون طريقة عالية الإنتاجية لا تقدر بثمن للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي. يتم فقدان هذا الكسب عالي الإنتاجية عند استخدام TGGE التقليدي القائم على الرحلان الكهربائي الهلامي. ومع ذلك ، يمكن استخدام نسخة مصغرة من TGGE ، تسمى microTGGE (μTGGE) ، لتقصير الوقت الكهربائي الهلامي وتسريع التحليل مع زيادة 100 ضعف في الإنتاجية11. تم تحسين بساطة واكتناز طريقة μTGGE من خلال إدخال PalmPAGE12 ، وهو نظام هرهلام كهربائي قابل للتطبيق في الميدان ومحمولة باليد وبأسعار معقولة.

هنا ، يتم استخدام بروتوكول جديد قائم على TGGE لفحص ثلاثة أنواع من مواقع تحرير الحمض النووي الريبي (A-to-I و C-to-U و U-to-C) في أربعة جينات ، بما في ذلك اثنان من أنسجة Arabidopsis thaliana واثنان معبرا عنهما في خلايا HEK293 الثديية (الشكل 1A). يدمج البروتوكول استخدام PalmPAGE (الأجهزة) ، وهو نظام محمول للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي ، و uMelt (برنامج)13. مع متوسط وقت تشغيل يتراوح بين 15 و 30 دقيقة ، يتيح هذا البروتوكول التعرف السريع والموثوق والسهل على تحرير الحمض النووي الريبي دون الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر.

Protocol

1. تحسين الجزء المستهدف

ملاحظة: تم استخدام أربعة جينات معدلة في تطوير هذا البروتوكول ، بما في ذلك جينان نوويان (AT2G16586 و AT5G02670) من A. thaliana ، والجينات المشفرة بروتين الفلورسنت الأزرق (BFP) وبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) المعبر عنه في خلايا HEK293.

  1. لتحديد شظايا الجينات ذات ملفات تعريف الذوبان المختلفة ، التي تمثل المناطق المحررة مقابل المناطق غير المحررة ، قم بإنشاء منحنيات ذوبان متوقعة باستخدام الأداة المستندة إلى الويب uMelt HETS ، وهي امتداد لبرنامج uMelt الأصلي13.
    ملاحظة: تتنبأ هذه الأداة بأشكال منحنيات الانصهار لمنتجات التباين والتجانس المتجانسة.
  2. لكل جين مستهدف ، صمم ثلاثة أزواج من شظايا الجينات (300-324 نقطة أساس في الطول). يتكون كل زوج من جزء مع موقع تم تحريره وجزء من النوع البري المقابل مع موقع غير محرر ، يقع إما في النهاية الطرفية 5 أو الموضع الأوسط أو النهاية الطرفية 3 بوصة.
  3. حدد الزوج غير المحرر/المحرر الذي أظهر الفرق الأقصى بين مناطق الانصهار على محور الهيلية لمزيد من التحليل. لتحليل μTGGE ، قم بتوليف الجزء الجيني المحدد عن طريق تضخيم PCR ، كما هو موضح في القسم 2 أدناه.
  4. صمم الاشعال الأمامي والعكسي باستخدام برنامج DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) وتحقق باستخدام أداة NCBI Primer-BLAST .
  5. تمييع الاشعال في المخزن المؤقت TE (10 mM Tris-HCl يحتوي على 1 mM EDTA· Na2) وتخزينها بتركيز 100 pmol / μL. قبل الاستخدام ، قم بتخفيف كل تمهيدي تم ضبطه على تركيز 10 pmol / μL باستخدام الماء المقطر.

2. استخراج الحمض النووي الريبي وتضخيم RT-PCR للجزء المستهدف

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من مصدر الجينات المحررة وغير المحررة باستخدام الطرق القياسية ، مثل استخراج TRIzol14 أو المجموعات المتاحة تجاريا.
    2. قم بإجراء توليف cDNA المقابل باستخدام بروتوكول RT-PCR قياسي كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  2. النسخ العكسي
    1. أضف 1 ميكرولتر من التمهيدي oligo (dT) ، و 1 ميكرولتر من مزيج dNTP 10 mM ، و 10 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي ، و 10 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النوكلياز.
    2. سخني الخليط على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم احتضنيه على الثلج لمدة 1 دقيقة على الأقل.
    3. اجمع محتويات الأنبوب عن طريق الطرد المركزي بسرعة قصوى (12000 × جم) لمدة 2-3 ثوان ، وأضف 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت ReverTra Ace 5x ، و 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT ، و 1 ميكرولتر من M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) النسخ العكسي (200 U / μL ، جدول المواد).
    4. اخلطي عن طريق السحب لأعلى ولأسفل بلطف. إذا كنت تستخدم الاشعال العشوائية، احتضن الأنبوب عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. احتضن الأنبوب عند 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ثم قم بتعطيل التفاعل عن طريق التسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، في سخان حمام جاف / كتلة رقمية.
    6. قياس تركيز cDNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه عند -25 درجة مئوية.
  3. تضخيم PCR والتسلسل التأكيدي للمنتجات
    1. أضف الكواشف التالية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النوكلياز: 4 ميكرولتر من 5x Taq Polymerase Buffer ، و 2 ميكرولتر من مزيج dNTP 2 mM ، و 2 ميكرولتر من 25 mM MgCl 2 ، و 1.6 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي (إلى الأمام والخلف ؛ كل 10 mM) ، و 2 ميكرولتر من قالب cDNA ، و 0.1 ميكرولتر من بوليميراز Taq (2.5 U / μL) ، و 8.3 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم (الحجم النهائي ، 20 ميكرولتر).
    2. أداء PCR مع ظروف ركوب الدراجات التالية: تمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 35 دورة من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، والتلدين عند درجة حرارة مناسبة (اعتمادا على مجموعة التمهيدي المحددة المستخدمة) لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ ثم تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. لتنقية منتجات PCR ، أضف 2 U من Exonuclease I و 0.5 U من فوسفاتيز الروبيان القلوي (ExoSAP). احتضن الأنبوب في جهاز تدوير حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، متبوعا ب 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم حافظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
    4. للتسلسل التأكيدي ، أضف 11.5 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ، و 2.5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي أو الخلفي ، و 1 ميكرولتر من منتجات PCR (مع ExoSAP) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
      ملاحظة: استخدم خدمات تسلسل الحمض النووي (على سبيل المثال، Eurofins Genomics) لتحليل التسلسل.
    5. للتحقق من خصوصية منتجات PCR ، قم بإجراء التسلسل باستخدام كل من الاشعال الأمامي والخلفي. وترد في الجدول 1 أزواج التمهيدي المستخدمة في التحليل التمثيلي.
    6. قم بتخفيف منتجات PCR النقية إلى تركيز 200 نانوغرام / ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، امزج 6 ميكرولتر من المنتج النقي مع 3 ميكرولتر من صبغة تحميل هلام 6x في أنبوب 250 ميكرولتر وارفع الحجم الإجمالي إلى 12 ميكرولتر بالماء المعقم. قم بتخزين منتج PCR (عند -25 درجة مئوية) حتى يصبح جاهزا للمتابعة مع μTGGE كما هو موضح أدناه.

3. تحليل μTGGE

ملاحظة: يتم إجراء تحليل μTGGE باستخدام نظام مصغر واقتصادي. يوضح الشكل 2 نظرة عامة على النظام الكامل ، بما في ذلك أشرطة الجل ، وحامل كاسيت الجل ، ومنصة الرحلان الكهربائي الهلامي الأفقي ، وإمدادات الطاقة ، ونظام التصوير الهلامي.

  1. تجميع أشرطة الجل
    1. يظهر كاسيت الجل المستخدم في تحليل μTGGE في الشكل 2A. يتكون التصميم من ثلاثة ألواح هلام مقاس 1 بوصة: لوحة هلام سفلية ، لوحة هلام علوية ، ولوحة سابقة للحارة. شطيرة لوحة الجل العلوي بين الطبقين الآخرين وتجميعها في حامل كاسيت الجل لبلمرة الهلام.
  2. إعداد هلام بولي أكريلاميد
    1. أضف 7.2 جم من اليوريا إلى أنبوب سعة 50 مل وتذوب في 10 مل من الماء المعقم. سخني العينة في الميكروويف لمدة 20-30 ثانية ثم أحضريها إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. أضف 3 مل من 5x Tris / borate / EDTA (TBE) العازلة (جدول المواد) ، و 2.25 مل من 40٪ (ث / v) أكريلاميد / مكرر (19: 1) ، و 75 ميكرولتر من 10x بيرسلفات الأمونيوم ، و 15 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين إلى المحلول.
    3. صب محلول الجل على الفور في حامل كاسيت الجل ببطء ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء.
  3. توليد ملفات تعريف الانصهار باستخدام وحدة μTGGE
    1. استخدم النسخة الاقتصادية المصغرة من جهاز μTGGE الموضح في الشكل 2 مع تدرج درجة حرارة (25-65 درجة مئوية) مضبوط عموديا على اتجاه هجرة الحمض النووي.
    2. انقع وسادات العازلة للرحلان الكهربائي العلوية والسفلية (0.5 سم × 2.5 سم) في 2 مل من المخزن المؤقت 1x TBE.
    3. ضع كاسيت الجل في وحدة غرفة الرحلان الكهربائي الأفقي وضع الوسادات العازلة العلوية والسفلية وفقا لذلك ، كما هو موضح في الشكل 2.
    4. بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من منتج PCR في البئر الأوسط (الأطول) و 1 ميكرولتر من منتج PCR في كل جانب بئر.
    5. بعد انتظار لمدة 1 دقيقة ، قم بتوصيل وحدة الطاقة وتزويد 100 فولت لمدة 12 دقيقة عند تدرج درجة حرارة خطية من 25-65 درجة مئوية.
    6. بعد اكتمال الجري ، أخرج الكاسيت وأزل الغطاء الزجاجي العلوي.
    7. صب 300 ميكرولتر من 10x صبغة SYBR Gold على الجل. تصور ملامح الذوبان باستخدام مصباح LED الأزرق المثبت في الجهاز الكهربائي بحجم راحة اليد.
      ملاحظة: يجب حفظ ملف ناعم لصورة الجل لحساب درجة تشابه النمط (PaSS).
    8. كرر كل تجربة كهروفيرية 3x لتأكيد قابلية تكرار البيانات.

4. حسابات PaSS

ملاحظة: يتم إجراء العمليات الحسابية باستخدام برنامج μTGGE Analyzer.

  1. قم بتنزيل البرنامج وفتحه.
  2. افتح ملف JPEG الذي يحتوي على صورة الجل. لاحظ أن البرنامج سيقبل ملفات تنسيق JPEG فقط.
  3. انقر فوق الزر " إطار" وحدد المنطقة المناسبة (الإطار) لصورة الهلام.
  4. انقر فوق الزر تصحيح الإحداثيات وأضف نقطتين مرجعيتين، كما هو موضح في الشكل 1B.
  5. انقر على زر إضافة نقاط المعالم وأضف نقاط عينة كما هو موضح في الشكل 1B. ثم احفظ بيانات صورة الهلام المعالجة بتنسيق μTGGE (*.tgg).
  6. انقر فوق الزر " عينة" وحدد خيار البحث عن نقاط بسيطة لمقارنة صورتين أو أكثر.

النتائج

استخدام μTGGE لتحديد تغيرات قاعدة النيوكليوتيدات المفردة في أحداث تحرير الحمض النووي الريبي
تم استخدام أربعة جينات معدلة لهذا البروتوكول (الجدول 1) ، بما في ذلك جين BFP المنتج في خلايا HEK293 (مع تحرير الحمض النووي الريبي C-to-U بواسطة إنزيمات deaminase من مركب تحرير البروتين الشحمي...

Discussion

يلعب تحرير الحمض النووي الريبي دورا مهما في علم الأحياء. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي ، مثل الكروماتوغرافيا والتسلسل ، تمثل العديد من التحديات بسبب تكلفتها العالية ، ومتطلبات الوقت المفرطة ، والتعقيد. البروتوكول الموضح هنا هو طريقة بسيطة وسريعة وفعالة من...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل منحة معونة للبحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (17H02204 و 18K19288). تم دعم روتشيكا ماليا من قبل الحكومة اليابانية (منحة MEXT). نشكر السيدة راديكا بياني (مختبر تاكاغي، JAIST) والدكتورة كيرتي شارما (شركة BioSeeds Corporation) على المساعدة في التجارب المتعلقة بالرحلان الكهربائي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2U ExoITakara2650AExonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)Thermo fisherAM9022
Ammonium persulfate (APS)Thermo Fisher17874
Centrifuge Mini spineppendorf5452000034
Digital dry bath/ block heaterThermo fisherNA
Gold Taq Polymerase Master mixturePromegaM7122
LATaq DNA polymeraseTAKARARR002ATaq Polymerase
micro-TGGE  cassette holderBioSeeds Corp.BS-GE-CH
micro-TGGE apparatusLifetech Corp.TG
micro-TGGE gel cassetteBioSeeds Corp.BS-TGGE-C
NanoDrop 1000Thermo fisherND-1000Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kitQiagen74904
ReverTra Ace Master MixTOYOBOTRT101M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kitQiagen74104
Shrimp Alkaline PhosphataseTakara2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stainThermo fisherS11494
TBE bufferThermo fisherB52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Nacalai tesque33401-72
Urea, Nuclease and protease testedNacalai tesque35940-65

References

  1. Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
  2. Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
  3. Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
  4. Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
  5. Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
  6. Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
  7. Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
  8. Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
  9. Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
  10. Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
  11. Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
  12. Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
  13. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  14. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  15. Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
  16. Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
  17. Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
  18. Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved