Un approccio non sequenziale per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA

Riepilogo

Il rilevamento rapido e la quantificazione affidabile degli eventi di modifica dell'RNA su scala genomica rimangono impegnativi e attualmente si basano su metodi di sequenziamento diretto dell'RNA. Il protocollo qui descritto utilizza l'elettroforesi su gel a gradiente di microtemperatura (μTGGE) come metodo semplice, rapido e portatile per rilevare l'editing dell'RNA.

Abstract

L'editing dell'RNA è un processo che porta ad alterazioni della sequenza posttrascrittiva negli RNA. Il rilevamento e la quantificazione dell'editing dell'RNA si basano principalmente sulle tecniche di sequenziamento Sanger e di sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, questi metodi possono essere costosi e dispendiosi in termini di tempo. In questo protocollo, un sistema portatile di elettroforesi su gel a gradiente di microtemperatura (μTGGE) viene utilizzato come approccio non sequenziale per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA. Il processo si basa sul principio dell'elettroforesi, che utilizza alte temperature per denaturare i campioni di acido nucleico mentre si muovono attraverso un gel di poliacrilammide. Attraverso una gamma di temperature, un frammento di DNA forma un gradiente di DNA completamente a doppio filamento in filamenti parzialmente separati e quindi in DNA a singolo filamento completamente separato. I siti modificati con RNA con basi nucleotidiche distinte producono diversi profili di fusione nelle analisi μTGGE. Abbiamo usato l'approccio basato su μTGGE per caratterizzare le differenze tra i profili di fusione di quattro frammenti di RNA modificati e i loro corrispondenti frammenti non modificati (wild-type). I Pattern Similarity Score (PaSS) sono stati calcolati confrontando i pattern di banda prodotti dagli RNA modificati e non modificati e sono stati utilizzati per valutare la riproducibilità del metodo. Nel complesso, la piattaforma qui descritta consente il rilevamento anche di singole mutazioni di base negli RNA in modo diretto, semplice ed economico. Si prevede che questo strumento di analisi aiuterà i nuovi risultati della biologia molecolare.

Introduzione

Le varianti a singolo nucleotide (SNV) nell'RNA genomico, comprese le varianti A-to-I, C-to-U e U-to-C, possono indicare eventi di modifica dell'RNA. Tuttavia, il rilevamento di SNV nell'RNA rimane un compito tecnicamente impegnativo. Convenzionalmente, il rapporto tra RNA modificato e non modificato è determinato dal sequenziamento diretto, dalla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) specifica per l'allele o dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) che si avvicina^a 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, questi approcci non sono particolarmente efficaci in termini di tempo o di costi e le loro basse precisioni, causate da alti livelli di rumore, pongono colli di bottiglia tecnologici per il rilevamento SNV basato su RNA ^7,8. Qui, descriviamo un protocollo basato sull'elettroforesi su gel a gradiente di temperatura (TGGE) per identificare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) come metodo alternativo che elimina la necessità di approcci diretti di sequenziamento dell'RNA alle analisi di editing dell'RNA.

L'elettroforesi è un metodo preferito per la separazione e l'analisi delle biomolecole nei laboratori di scienze della vita. TGGE consente la separazione di frammenti di DNA a doppio filamento che hanno le stesse dimensioni ma hanno sequenze diverse. La tecnica si basa sulle differenze legate alla sequenza nelle temperature di fusione dei frammenti di DNA e sui successivi cambiamenti nella loro mobilità in gel porosi con un gradiente di temperatura lineare ^9,10. La fusione di frammenti di DNA genera specifici profili di fusione. Una volta che il dominio con la temperatura di fusione più bassa raggiunge la temperatura corrispondente in una particolare posizione nel gel, si verifica la transizione da una struttura elicoidale a una struttura parzialmente fusa e la migrazione della molecola si fermerà praticamente. Pertanto, TGGE utilizza sia la mobilità (informazioni sulle dimensioni) che le transizioni strutturali indotte dalla temperatura dei frammenti di DNA (informazioni dipendenti dalla sequenza), rendendolo un potente approccio alla caratterizzazione dei frammenti di DNA. I punti caratteristici in un modello di fusione TGGE, che corrispondono a tre transizioni strutturali della molecola di DNA, sono il punto di dissociazione iniziale del filamento, il punto di dissociazione medio del filamento e il punto di dissociazione finale del filamento (Figura 1). Le variazioni di sequenza all'interno dei domini, anche le differenze a base singola, influenzano la temperatura di fusione, quindi le molecole con sequenze diverse mostreranno modelli di fusione discreti (denaturazione) nelle analisi TGGE. Pertanto, TGGE può essere utilizzato per analizzare gli SNV nell'RNA genomico e può essere un metodo inestimabile ad alto rendimento per rilevare l'editing dell'RNA. Questo guadagno ad alta produttività viene perso quando si utilizza il tradizionale TGGE basato sull'elettroforesi su gel. Tuttavia, una versione miniaturizzata di TGGE, denominata microTGGE (μTGGE), può essere utilizzata per abbreviare il tempo elettroforetico del gel e accelerare l'analisi con un aumento di 100 volte della produttivit๹. La semplicità e la compattezza del metodo μTGGE sono state migliorate dall'introduzione di PalmPAGE¹², un sistema di elettroforesi su gel applicabile sul campo, portatile e conveniente.

Qui, un nuovo protocollo basato su TGGE viene utilizzato per esaminare tre tipi di siti di editing dell'RNA (A-to-I, C-to-U e U-to-C) in quattro geni, tra cui due da tessuti Arabidopsis thaliana e due espressi in cellule HEK293 di mammiferi (Figura 1A). Il protocollo integra l'uso di PalmPAGE (hardware), un sistema portatile per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA, e uMelt (software)¹³. Con un tempo di esecuzione medio di 15-30 minuti, questo protocollo consente un'identificazione rapida, affidabile e facile dell'editing dell'RNA senza la necessità di approcci diretti di sequenziamento dell'RNA.

Protocollo

1. Ottimizzazione del frammento target

NOTA: Quattro geni modificati sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo, tra cui due geni nucleari (AT2G16586 e AT5G02670) di A. thaliana e i geni che codificano per la proteina fluorescente blu (BFP) e la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) espressa nelle cellule HEK293.

1. Per identificare frammenti di geni con diversi profili di fusione, che rappresentano regioni modificate rispetto a quelle non modificate, generare curve di fusione previste utilizzando lo strumento basato sul web uMelt HETS, un'estensione del software uMelt^{originale 13}.
   NOTA: questo strumento prevede le forme delle curve di fusione per i prodotti heteroduplex e homoduplex.
2. Per ogni gene bersaglio, progettare tre coppie di frammenti genici (300-324 bp di lunghezza). Ogni coppia comprende un frammento con un sito modificato e un corrispondente frammento wild-type con un sito non modificato, situato all'estremità 5'-terminale, posizione centrale o 3'-terminale.
3. Selezionate la coppia non modificata/modificata che ha mostrato la differenza massima tra le regioni di fusione sull'asse dell'elicità per un'ulteriore analisi. Per l'analisi μTGGE, sintetizzare il frammento genetico selezionato mediante amplificazione PCR, come descritto nella sezione 2 di seguito.
4. Progettare i primer avanti e indietro utilizzando il software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) e verificare utilizzando lo strumento NCBI Primer-BLAST.
5. Diluire i primer in tampone TE (10 mM Tris-HCl contenente 1 mM EDTA· Na₂) e conservarli ad una concentrazione di 100 pmol/μL. Prima dell'uso, diluire ogni primer impostato ad una concentrazione di 10 pmol/μL utilizzando acqua distillata.

2. Estrazione dell'RNA e amplificazione RT-PCR del frammento bersaglio

1. Estrazione dell'RNA
   1. Estrarre l'RNA totale dalla fonte di geni modificati e non modificati utilizzando metodi standard, come l'estrazione di TRIzol¹⁴ o kit disponibili in commercio.
   2. Eseguire la sintesi del cDNA corrispondente utilizzando un protocollo RT-PCR standard come descritto nel passaggio 2.2.
2. Trascrizione inversa
   1. Aggiungere 1 μL di primer oligo(dT), 1 μL di miscela dNTP da 10 mM, 10 μL di RNA totale e 10 μL di acqua distillata sterile in un tubo microcentrifugato privo di nucleasi.
   2. Riscaldare la miscela a 65 °C per 5 minuti e poi incubare sul ghiaccio per almeno 1 minuto.
   3. Raccogliere il contenuto del tubo mediante centrifugazione alla massima velocità (12.000 x g) per 2-3 s e aggiungere 4 μL di 5x tampone ReverTra Ace, 1 μL di 0,1 M DTT e 1 μL di M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) trascrittasi inversa (200 U/μL, Tabella dei materiali).
   4. Mescolare pipettando su e giù delicatamente. Se si utilizzano primer casuali, incubare il tubo a 25 °C per 5 minuti.
   5. Incubare il tubo a 55 °C per 60 minuti e quindi inattivare la reazione riscaldando a 70 °C per 15 minuti, in un bagno secco digitale/riscaldatore a blocchi.
   6. Misurare la concentrazione di cDNA utilizzando uno spettrofotometro e memorizzarla a -25 °C.
3. Amplificazione PCR e sequenziamento confermativo dei prodotti
   1. Aggiungere i seguenti reagenti a un tubo di microcentrifuga senza nucleasi: 4 μL di 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL di 2 mM dNTP mix, 2 μL di 25 mM MgCl₂, 1,6 μL del set di primer (avanti e indietro; ciascuno 10 mM), 2 μL di modello di cDNA, 0,1 μL di Taq polimerasi (2,5 U/μL) e 8,3 μL di acqua distillata sterile (volume finale, 20 μL).
   2. Eseguire pcr con le seguenti condizioni di ciclo: denaturazione iniziale a 95 °C per 2 min; 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 2 min, ricottura ad una temperatura adeguata (a seconda del set di primer specifico utilizzato) per 30 s, ed estensione a 72 °C per 2 min; e poi un'estensione finale a 72 °C per 7 min.
   3. Per purificare i prodotti PCR, aggiungere 2 U di esonucleasi I e 0,5 U di fosfatasi alcalina di gamberetti (ExoSAP). Incubare il tubo in un termociclatore a 37 °C per 1 ora, seguito da 80 °C per 15 minuti, quindi mantenere a 4 °C fino alla fase successiva.
   4. Per il sequenziamento di conferma, aggiungere 11,5 μL di acqua distillata sterile, 2,5 μL di primer avanti o indietro e 1 μL di prodotti PCR (con ExoSAP) a un nuovo tubo microcentrifuga.
      NOTA: Utilizzare i servizi di sequenziamento del DNA (ad esempio, Eurofins Genomics) per l'analisi del sequenziamento.
   5. Per convalidare la specificità dei prodotti PCR, eseguire il sequenziamento con primer sia in avanti che in retromarcia. Le coppie di primer utilizzate nell'analisi rappresentativa sono riportate nella Tabella 1.
   6. Diluire i prodotti PCR purificati ad una concentrazione di 200 ng/μL con acqua deionizzata. Quindi, mescolare 6 μL del prodotto purificato con 3 μL di colorante di carico gel 6x in un tubo da 250 μL e aumentare il volume totale a 12 μL con acqua sterile. Conservare il prodotto PCR (a -25 °C) fino al momento di procedere con μTGGE come descritto di seguito.

3. Analisi μTGGE

NOTA: L'analisi μTGGE viene eseguita utilizzando un sistema miniaturizzato ed economico. Una panoramica del sistema completo, comprese le cassette in gel, il supporto per cassette in gel, la piattaforma orizzontale per elettroforesi in gel, l'alimentatore e il sistema di imaging in gel, è mostrata nella Figura 2.

1. Assemblaggio delle cassette di gel
   1. La cassetta di gel utilizzata per l'analisi μTGGE è mostrata nella Figura 2A. Il design è costituito da tre piastre di gel da 1 pollice: una piastra gel inferiore, una piastra gel superiore e una piastra lane-former. Inserire la piastra di gel superiore tra le altre due piastre e assemblare nel supporto della cassetta di gel per la polimerizzazione del gel.
2. Preparazione del gel di poliacrilammide
   1. Aggiungere 7,2 g di urea in un tubo da 50 ml e sciogliere in 10 ml di acqua sterile. Riscaldare il campione in un forno a microonde per 20-30 s e poi portarlo a temperatura ambiente (RT).
   2. Aggiungere alla soluzione 3 mL di tampone Tris/borato/EDTA (TBE) (Tabella dei materiali), 2,25 mL di acrilammide/bis al 40% (p/v) (19:1), 75 μL di 10x persolfato di ammonio e 15 μL di tetrametiletilendiammina.
   3. Versare immediatamente la soluzione gel nel supporto della cassetta di gel lentamente, evitando la formazione di bolle d'aria.
3. Generazione di profili di fusione utilizzando l'unità μTGGE
   1. Utilizzare la versione miniaturizzata ed economica dell'apparato μTGGE mostrata in Figura 2 con un gradiente di temperatura (25-65 °C) impostato perpendicolarmente alla direzione di migrazione del DNA.
   2. Immergere i tamponi per elettroforesi superiore e inferiore (0,5 cm x 2,5 cm) in 2 mL di 1x tampone TBE.
   3. Posizionare la cassetta di gel nell'unità della camera di elettroforesi orizzontale e posizionare di conseguenza i tamponi superiore e inferiore, come mostrato nella Figura 2.
   4. Quindi, caricare 10 μL del prodotto PCR nel pozzetto centrale (più lungo) e 1 μL del prodotto PCR in ciascun pozzetto laterale.
   5. Dopo un'attesa di 1 minuto, collegare l'unità di alimentazione e fornire 100 V per 12 minuti a un gradiente di temperatura lineare da 25-65 °C.
   6. Al termine della corsa, estrarre la cassetta e rimuovere il coperchio superiore in vetro.
   7. Versare 300 μL di 10x SYBR Gold macchia sul gel. Visualizza i profili di fusione utilizzando la torcia a LED blu installata nel dispositivo elettroforetico delle dimensioni di un palmo.
      NOTA: è necessario salvare un file soft dell'immagine gel per il calcolo del punteggio di somiglianza del modello (PaSS).
   8. Ripeti ogni esperimento elettroforetico 3 volte per confermare la riproducibilità dei dati.

4. Calcoli PaSS

NOTA: i calcoli vengono eseguiti utilizzando il software μTGGE Analyzer.

1. Scarica e apri il software.
2. Aprire il file JPEG contenente l'immagine gel. Si noti che il software accetta solo file in formato JPEG.
3. Fare clic sul pulsante Frame e selezionare l'area appropriata (frame) dell'immagine gel.
4. Fate clic sul pulsante Correzione coordinate (Coordinate Correction ) e aggiungete due punti di riferimento, come illustrato nella Figura 1B.
5. Fate clic sul pulsante Aggiunta punti feature (Addition of Feature Points ) e aggiungete punti campione come illustrato nella Figura 1B. Quindi salvare i dati dell'immagine gel elaborati in formato μTGGE (*.tgg).
6. Fare clic sul pulsante Campione e selezionare l'opzione Cerca punti semplici per confrontare due o più immagini.

Risultati

Uso di μTGGE per identificare i cambiamenti della base a singolo nucleotide negli eventi di modifica dell'RNA
Quattro geni modificati sono stati utilizzati per questo protocollo (Tabella 1), incluso il gene BFP prodotto in cellule HEK293 (con editing C-to-U RNA da parte degli enzimi deaminasi del complesso enzimatico di editing dell'mRNA apolipoproteina B; APOBEC1¹⁵), il gene EGFP contenente il codone di arresto ocra (TAA) prodotto in cellule HEK293 (con editi...

Discussione

L'editing dell'RNA svolge un ruolo importante in biologia; tuttavia, gli attuali metodi di rilevamento dell'editing dell'RNA, come la cromatografia e il sequenziamento, presentano diverse sfide a causa del loro costo elevato, dei requisiti di tempo eccessivi e della complessità. Il protocollo qui descritto è un metodo semplice, rapido ed economico per rilevare l'editing dell'RNA che utilizza un sistema portatile, microdimensionato, basato su TGGE. Questo sistema può essere utilizzato per distinguere tra geni modificat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65