Uma abordagem não-sequencial para a detecção rápida da edição de RNA

Resumo

A detecção rápida e a quantificação confiável dos eventos de edição de RNA em escala genômica permanecem desafiadoras e atualmente dependem de métodos de sequenciamento direto de RNA. O protocolo descrito aqui usa a eletroforese de gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como um método simples, rápido e portátil de detectar a edição de RNA.

Resumo

A edição de RNA é um processo que leva a alterações de sequência pós-transcricional em RNAs. A detecção e quantificação da edição de RNA dependem principalmente de técnicas de sequenciamento de Sanger e sequenciamento de RNA. No entanto, esses métodos podem ser caros e demorados. Neste protocolo, um sistema portátil de eletroforese de gel de microtemperature (μTGGE) é usado como uma abordagem de não-sequenciamento para a rápida detecção da edição de RNA. O processo é baseado no princípio da eletroforese, que usa altas temperaturas para desnaturar amostras de ácido nucleico enquanto se movem através de um gel de poliacrilamida. Através de uma série de temperaturas, um fragmento de DNA forma um gradiente de DNA totalmente duplo para fios parcialmente separados e, em seguida, para DNA totalmente separado de uma única cadeia. Sites editados por RNA com bases nucleotídeas distintas produzem diferentes perfis de fusão em análises μTGGE. Utilizamos a abordagem baseada em μTGGE para caracterizar as diferenças entre os perfis de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não ditados correspondentes (tipo selvagem). Os Escores de Similaridade do Padrão (PaSSs) foram calculados comparando-se os padrões de banda produzidos pelas RNAs editadas e não diutadas e foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. No geral, a plataforma descrita aqui permite a detecção de mutações de base única em RNAs de forma simples, simples e econômica. Espera-se que esta ferramenta de análise ajude novas descobertas de biologia molecular.

Introdução

Variantes de nucleotídeos únicos (SNVs) em RNA genômica, incluindo variantes A-to-I, C-to-U e U-to-C, podem indicar eventos de edição de RNA. No entanto, a detecção de SNVs no RNA continua sendo uma tarefa tecnicamente desafiadora. Convencionalmente, a razão de RNA editado para RNA não diquedado é determinada por sequenciamento direto, reação em cadeia de polimerase em tempo real (PCR) específica de alelo ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) se aproxima^de 1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens não são particularmente tempo ou custo-benefício, e suas baixas precisãos, causadas por altos níveis de ruído, representam gargalos tecnológicos para a detecção de SNV baseada em RNA ^7,8. Aqui, descrevemos um protocolo baseado na eletroforese de gel gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) como um método alternativo que elimina a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA para análises de edição de RNA.

A eletroforese é um método preferido para a separação e análise de biomoléculas em laboratórios de ciências da vida. O TGGE permite a separação de fragmentos de DNA de duplas vertentes que têm o mesmo tamanho, mas têm sequências diferentes. A técnica conta com diferenças relacionadas à sequência nas temperaturas de fusão dos fragmentos de DNA e mudanças subsequentes em suas mobilidades em géis porosos com um gradiente linear de temperatura ^9,10. O derretimento de fragmentos de DNA gera perfis específicos de fusão. Uma vez que o domínio com a menor temperatura de fusão atinge a temperatura correspondente em uma posição particular no gel, a transição de uma estrutura helicoidal para uma estrutura parcialmente derretida ocorre, e a migração da molécula praticamente parará. Portanto, o TGGE utiliza tanto a mobilidade (informação de tamanho) quanto transições estruturais induzidas pela temperatura de fragmentos de DNA (informações dependentes de sequências), tornando-se uma abordagem poderosa para a caracterização de fragmentos de DNA. Os pontos de característica em um padrão de fusão TGGE, que correspondem a três transições estruturais da molécula de DNA, são o ponto de dissociação inicial da cadeia, o ponto de dissociação do fio médio e o ponto de dissociação final do fio (Figura 1). Variações sequenciais dentro dos domínios, mesmo diferenças de base única, afetam a temperatura de fusão, portanto, moléculas com diferentes sequências mostrarão padrões discretos de fusão (desnaturação) nas análises TGGE. Portanto, o TGGE pode ser usado para analisar SNVs no RNA genômico e pode ser um método inestimável de alto rendimento de detectar edição de RNA. Este ganho de alta produtividade é perdido quando o TGGE tradicional baseado em eletroforese em gel é usado. No entanto, uma versão miniaturizada de TGGE, chamada microTGGE (μTGGE), pode ser usada para encurtar o tempo eletroforético do gel e acelerar a análise com um aumento de 100 vezes na produtividade¹¹. A simplicidade e compactação do método μTGGE foram melhoradas com a introdução do PalmPAGE¹², um sistema de eletroforese gel aplicável em campo, portátil e acessível.

Aqui, um novo protocolo baseado em TGGE é usado para examinar três tipos de sites de edição de RNA (A-to-I, C-to-U e U-to-C) em quatro genes, incluindo dois de tecidos arabidopsis thaliana e dois expressos em células de mamíferos HEK293 (Figura 1A). O protocolo integra o uso do PalmPAGE (hardware), um sistema portátil para detecção rápida de edição de RNA e uMelt (software)¹³. Com um tempo médio de execução de 15-30 minutos, este protocolo permite uma identificação rápida, confiável e fácil da edição de RNA sem a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA.

Protocolo

1. Otimização do fragmento de destino

NOTA: Quatro genes editados foram usados no desenvolvimento deste protocolo, incluindo dois genes nucleares (AT2G16586 e AT5G02670) de A. thaliana, e os genes codificando proteína fluorescente azul (BFP) e proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) expressa em células HEK293.

1. Para identificar fragmentos genéticos com diferentes perfis de fusão, representando regiões editadas versus não diutadas, gerar curvas de fusão previstas usando a ferramenta baseada na web uMelt HETS, uma extensão do software uMelt^{original 13}.
   NOTA: Esta ferramenta prevê as formas de derretimento das curvas para produtos heteroduplex e homoduplex.
2. Para cada gene alvo, projete três pares de fragmentos genéticos (300-324 bp de comprimento). Cada par é composto por um fragmento com um local editado e um fragmento de tipo selvagem correspondente com um local não diutado, localizado na extremidade terminal de 5'terminal, posição média ou 3'-terminal final.
3. Selecione o par não diutado/editado que mostrou a diferença máxima entre as regiões de fusão no eixo de helicidade para análise posterior. Para análise μTGGE, sintetize o fragmento genético selecionado por amplificação PCR, conforme descrito na seção 2 abaixo.
4. Projete os primers para frente e para trás usando o software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) e verifique usando a ferramenta NCBI Primer-BLAST.
5. Diluir os primers no buffer TE (10 mM Tris-HCl contendo 1 mM EDTA· Na₂) e armazená-los a uma concentração de 100 pmol/μL. Antes de usar, diluir cada primer ajustado para uma concentração de 10 pmol/μL usando água destilada.

2. Extração de RNA e amplificação RT-PCR do fragmento de destino

1. Extração de RNA
   1. Extrair RNA total da fonte de genes editados e não ditados usando métodos padrão, como a extração TRIzol¹⁴ ou kits disponíveis comercialmente.
   2. Realize a síntese do cDNA correspondente usando um protocolo RT-PCR padrão, conforme descrito na etapa 2.2.
2. Transcrição reversa
   1. Adicione 1 μL de primer oligo(dT), 1 μL de mistura dNTP de 10 mM, 10 μL de RNA total e 10 μL de água destilada estéril a um tubo de microcentrifuge sem nuclease.
   2. Aqueça a mistura a 65 °C por 5 min e depois incubar no gelo por pelo menos 1 min.
   3. Colete o conteúdo do tubo por centrifugação em velocidade máxima (12.000 x g) para 2-3 s, e adicione 4 μL de tampão 5x ReverTra Ace, 1 μL de 0,1 M DTT e 1 μL de M-MLV (Moloney Murine Leucemia Virus) transcrição reversa (200 U/μL, Tabela de Materiais).
   4. Misture por pipetting para cima e para baixo suavemente. Se usar primers aleatórios, incubar o tubo a 25 °C por 5 min.
   5. Incubar o tubo a 55 °C por 60 min e, em seguida, inativar a reação aquecendo a 70 °C por 15 min, em um aquecedor digital seco/bloco.
   6. Meça a concentração de cDNA usando um espectotômetro e armazene-a a -25 °C.
3. Amplificação pcr e sequenciamento confirmatório de produtos
   1. Adicione os seguintes reagentes a um tubo de microcentrifuge sem nuclease: 4 μL de 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL de 2 mM dNTP mix, 2 μL de 25 mM MgCl₂, 1,6 μL do conjunto primer (para frente e para trás; cada 10 mM), 2 μL de modelo cDNA, 0,1 μL de polimerase Taq (2,5 U/μL) e 8,3 μL de água destilada estéril (volume final, 20 μL).
   2. Realizar PCR com as seguintes condições de ciclismo: desnaturação inicial a 95 °C por 2 min; 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 2 min, ressarnamento a uma temperatura adequada (dependendo do conjunto específico de primer utilizado) para 30 s, e extensão a 72 °C por 2 min; e, em seguida, uma extensão final a 72 °C para 7 min.
   3. Para purificar os produtos PCR, adicione 2 U de Exonuclease I e 0,5 U de fosfatase alcalina de camarão (ExoSAP). Incubar o tubo em um cicloviário térmico a 37 °C por 1h, seguido de 80 °C por 15 min e, em seguida, manter a 4 °C até o próximo passo.
   4. Para sequenciamento confirmatório, adicione 11,5 μL de água destilada estéril, 2,5 μL de primer dianteiro ou reverso e 1 μL de produtos PCR (com ExoSAP) a um novo tubo de microcentrifuge.
      NOTA: Use serviços de sequenciamento de DNA (por exemplo, Genômica Eurofins) para análise de sequenciamento.
   5. Para validar a especificidade dos produtos PCR, realize o sequenciamento com primers dianteiros e invertidos. Os pares de primer utilizados na análise representativa são dados na Tabela 1.
   6. Diluir os produtos PCR purificados a uma concentração de 200 ng/μL com água deionizada. Em seguida, misture 6 μL do produto purificado com 3 μL de corante de carregamento de gel de 6x em um tubo de 250 μL e eleve o volume total para 12 μL com água estéril. Armazene o produto PCR (a -25 °C) até que esteja pronto para prosseguir com o μTGGE conforme descrito abaixo.

3. análise μTGGE

NOTA: A análise μTGGE é realizada utilizando um sistema miniaturizado e econômico. Uma visão geral do sistema completo, incluindo as fitas de gel, porta-fitas de gel, plataforma horizontal de eletroforese de gel, fonte de alimentação e sistema de imagem de gel, é mostrada na Figura 2.

1. Montagem das fitas de gel
   1. O de gel usado para análise μTGGE é mostrado na Figura 2A. O design consiste em três placas de gel de 1 polegada: uma placa de gel inferior, uma placa de gel superior, e uma placa de pista anterior. Sanduiche a placa de gel superior entre as outras duas placas e monte no porta-fitas de gel para polimerização de gel.
2. Preparação de gel de poliacrilamida
   1. Adicione 7,2 g de ureia a um tubo de 50 mL e dissolva em 10 mL de água estéril. Aqueça a amostra em um micro-ondas para 20-30 s e, em seguida, leve-a à temperatura ambiente (RT).
   2. Adicione 3 mL de tampão tris/borate/EDTA (TBE) (Tabela de Materiais), 2,25 mL de 40% (w/v) acrilamida/bis (19:1), 75 μL de persulor de amônio 10x e 15 μL de tetrametilenodiamina à solução.
   3. Despeje imediatamente a solução de gel no suporte de de gel lentamente, evitando a formação de bolhas de ar.
3. Geração de perfis de fusão usando a unidade μTGGE
   1. Use a versão miniaturizada e econômica do aparelho μTGGE mostrado na Figura 2 com um gradiente de temperatura (25-65 °C) definido perpendicular à direção da migração de DNA.
   2. Mergulhe as almofadas tampão de eletroforese superior e inferior (0,5 cm x 2,5 cm) em 2 mL de tampão TBE 1x.
   3. Coloque o de gel na unidade horizontal de câmara de eletroforese e posicione as almofadas tampão superior e inferior em conformidade, conforme mostrado na Figura 2.
   4. Em seguida, carregue 10 μL do produto PCR no meio (mais longo) bem e 1 μL do produto PCR em cada lado bem.
   5. Após uma espera de 1 minuto, conecte a unidade de alimentação e forneça 100 V por 12 minutos a um gradiente linear de temperatura de 25-65 °C.
   6. Depois que a corrida tiver sido concluída, retire o e remova a tampa superior do vidro.
   7. Despeje 300 μL de 10x mancha de ouro SYBR no gel. Visualize os perfis de fusão usando a lanterna LED azul instalada no dispositivo eletroforético do tamanho da palma da mão.
      NOTA: Um arquivo macio da imagem em gel deve ser salvo para o cálculo de Pontuação de Similaridade padrão (PaSS).
   8. Repita cada experimento eletroforético 3x para confirmar a reprodutibilidade dos dados.

4. Cálculos pass

NOTA: Os cálculos são realizados utilizando o software μTGGE Analyzer.

1. Baixe e abra o software.
2. Abra o arquivo JPEG contendo a imagem em gel. Observe que o software só aceitará arquivos de formato JPEG.
3. Clique no botão Quadro e selecione a área apropriada (quadro) da imagem em gel.
4. Clique no botão De correção de coordenadas e adicione dois pontos de referência, como mostrado na Figura 1B.
5. Clique no botão Adição de Pontos de Recurso e adicione pontos de amostra conforme mostrado na Figura 1B. Em seguida, salve os dados de imagem de gel processados no formato μTGGE (*.tgg).
6. Clique no botão Amostrar e selecione a opção Pesquisar por Pontos Simples para comparar duas ou mais imagens.

Resultados

Uso de μTGGE para identificar mudanças de base de nucleotídeos únicos em eventos de edição de RNA
Quatro genes editados foram usados para este protocolo (Tabela 1), incluindo o gene BFP produzido em células HEK293 (com edição de RNA C-to-U pelas enzimas desaminase do complexo de enzimas de edição de mRNA apolipoproteína B; APOBEC1¹⁵), o gene EGFP contendo o codon ocre stop (TAA) produzido em células HEK293 (com edição de RNA A-to-I por adenosina ...

Discussão

A edição de RNA desempenha um papel importante na biologia; no entanto, os métodos atuais de detecção da edição de RNA, como cromatografia e sequenciamento, apresentam vários desafios devido ao seu alto custo, exigências de tempo excessivo e complexidade. O protocolo descrito aqui é um método simples, rápido e econômico de detectar a edição de RNA que usa um sistema portátil, microdimensionado, baseado em TGGE. Este sistema pode ser usado para diferenciar entre genes editados e não dilatados antes do seq...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65