Une approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN

Résumé

La détection rapide et la quantification fiable des événements d’édition de l’ARN à l’échelle génomique restent difficiles et reposent actuellement sur des méthodes de séquençage direct de l’ARN. Le protocole décrit ici utilise l’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) comme méthode simple, rapide et portable de détection de l’édition de l’ARN.

Résumé

L’édition de l’ARN est un processus qui conduit à des altérations de séquence posttranscriptionnelles dans les ARN. La détection et la quantification de l’édition de l’ARN reposent principalement sur les techniques de séquençage et de séquençage de l’ARN de Sanger. Cependant, ces méthodes peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps. Dans ce protocole, un système portable d’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) est utilisé comme approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN. Le processus est basé sur le principe de l’électrophorèse, qui utilise des températures élevées pour dénaturer les échantillons d’acides nucléiques lorsqu’ils se déplacent sur un gel de polyacrylamide. Sur une plage de températures, un fragment d’ADN forme un gradient d’ADN entièrement double brin vers des brins partiellement séparés, puis vers un ADN simple brin entièrement séparé. Les sites d’ARN avec des bases nucléotidiques distinctes produisent différents profils de fusion dans les analyses μTGGE. Nous avons utilisé l’approche basée sur μTGGE pour caractériser les différences entre les profils de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités (de type sauvage) correspondants. Les scores de similitude des modèles (PaSS) ont été calculés en comparant les modèles de bande produits par les ARN édités et non édités et ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Dans l’ensemble, la plate-forme décrite ici permet de détecter même des mutations de base unique dans les ARN de manière directe, simple et rentable. On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire.

Introduction

Les variantes mononucléotidiques (SNV) dans l’ARN génomique, y compris les variantes A-to-I, C-to-U et U-to-C, peuvent indiquer des événements d’édition de l’ARN. Cependant, la détection des SNV dans l’ARN reste une tâche techniquement difficile. Classiquement, le rapport entre l’ARN modifié et l’ARN non modifié est déterminé par séquençage direct, réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel spécifique à l’allèle ou par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) dénaturante 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ne sont pas particulièrement rapides ou rentables, et leur faible précision, causée par des niveaux élevés de bruit, pose des goulots d’étranglement technologiques pour la détection du SNV à base d’ARN ^7,8. Ici, nous décrivons un protocole basé sur l’électrophorèse sur gel à gradient de température (TGGE) pour identifier les polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) comme une méthode alternative qui élimine le besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN pour les analyses d’édition de l’ARN.

L’électrophorèse est une méthode privilégiée pour la séparation et l’analyse des biomolécules dans les laboratoires de sciences de la vie. TGGE permet la séparation de fragments d’ADN double brin de la même taille mais ayant des séquences différentes. La technique repose sur des différences liées à la séquence dans les températures de fusion des fragments d’ADN et les changements ultérieurs dans leurs mobilités dans les gels poreux avec un gradient de température linéaire^{de 9,10}. La fusion de fragments d’ADN génère des profils de fusion spécifiques. Une fois que le domaine avec la température de fusion la plus basse atteint la température correspondante à une position particulière dans le gel, la transition d’une structure hélicoïdale à une structure partiellement fondue se produit et la migration de la molécule s’arrêtera pratiquement. Par conséquent, TGGE utilise à la fois la mobilité (informations sur la taille) et les transitions structurelles induites par la température des fragments d’ADN (informations dépendantes de la séquence), ce qui en fait une approche puissante pour la caractérisation des fragments d’ADN. Les points caractéristiques d’un motif de fusion TGGE, qui correspondent à trois transitions structurelles de la molécule d’ADN, sont le point de dissociation initiale du brin, le point de dissociation intermédiaire du brin et le point de dissociation finale du brin (Figure 1). Les variations de séquence au sein des domaines, même les différences de base unique, affectent la température de fusion, par conséquent, les molécules avec des séquences différentes montreront des modèles de fusion discrets (dénaturation) dans les analyses TGGE. Par conséquent, TGGE peut être utilisé pour analyser les SNV dans l’ARN génomique et peut être une méthode inestimable à haut débit pour détecter l’édition de l’ARN. Ce gain à haut débit est perdu lorsque le TGGE traditionnel à base d’électrophorèse sur gel est utilisé. Cependant, une version miniaturisée de TGGE, nommée microTGGE (μTGGE), peut être utilisée pour raccourcir le temps électrophorétique du gel et accélérer l’analyse avec une augmentation de 100 fois de la productivité¹¹. La simplicité et la compacité de la méthode μTGGE ont été améliorées par l’introduction de PalmPAGE¹², un système d’électrophorèse sur gel applicable sur le terrain, portable et abordable.

Ici, un nouveau protocole basé sur TGGE est utilisé pour examiner trois types de sites d’édition d’ARN (A-to-I, C-to-U et U-to-C) dans quatre gènes, dont deux provenant de tissus d’Arabidopsis thaliana et deux exprimés dans des cellules HEK293 de mammifères (Figure 1A). Le protocole intègre l’utilisation de PalmPAGE (matériel), un système portable pour la détection rapide de l’édition d’ARN, et uMelt (logiciel)¹³. Avec une durée d’exécution moyenne de 15 à 30 minutes, ce protocole permet une identification rapide, fiable et facile de l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN.

Protocole

1. Optimisation du fragment cible

NOTE: Quatre gènes modifiés ont été utilisés dans le développement de ce protocole, y compris deux gènes nucléaires (AT2G16586 et AT5G02670) d’A. thaliana, et les gènes codant pour la protéine fluorescente bleue (BFP) et la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) exprimée dans les cellules HEK293.

1. Pour identifier les fragments de gènes avec différents profils de fusion, représentant des régions modifiées ou non éditées, générez des courbes de fusion prédites à l’aide de l’outil Web uMelt HETS, une extension du logiciel uMelt original¹³.
   REMARQUE: Cet outil prédit les formes des courbes de fusion pour les produits hétéroduplex et homoduplex.
2. Pour chaque gène cible, concevez trois paires de fragments de gènes (300-324 bp de longueur). Chaque paire comprend un fragment avec un site édité et un fragment de type sauvage correspondant avec un site non édité, situé à l’extrémité 5'-terminal, à la position médiane ou à l’extrémité 3'-terminale.
3. Sélectionnez la paire non modifiée/modifiée qui a montré la différence maximale entre les régions de fusion sur l’axe d’hélicité pour une analyse plus approfondie. Pour l’analyse μTGGE, synthétiser le fragment de gène sélectionné par amplification PCR, comme décrit à la rubrique 2 ci-dessous.
4. Concevez les amorces avant et arrière à l’aide du logiciel DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) et vérifiez à l’aide de l’outil NCBI Primer-BLAST.
5. Diluer les amorces dans un tampon TE (10 mM de Tris-HCl contenant 1 mM d’EDTA· Na₂) et les conserver à une concentration de 100 pmol/μL. Avant utilisation, diluer chaque apprêt à une concentration de 10 pmol/μL à l’aide d’eau distillée.

2. Extraction de l’ARN et amplification RT-PCR du fragment cible

1. Extraction de l’ARN
   1. Extraire l’ARN total de la source des gènes modifiés et non édités à l’aide de méthodes standard, telles que l’extraction TRIzol¹⁴ ou des kits disponibles dans le commerce.
   2. Effectuer la synthèse de l’ADNc correspondant à l’aide d’un protocole RT-PCR standard tel que décrit à l’étape 2.2.
2. Transcription inverse
   1. Ajouter 1 μL d’amorce oligo(dT), 1 μL de mélange de dNTP de 10 mM, 10 μL d’ARN total et 10 μL d’eau distillée stérile dans un tube de microcentrifugation sans nucléase.
   2. Chauffer le mélange à 65 °C pendant 5 min puis incuber sur de la glace pendant au moins 1 min.
   3. Recueillir le contenu du tube par centrifugation à la vitesse maximale (12 000 x g) pendant 2-3 s, et ajouter 4 μL de tampon ReverTra Ace 5x, 1 μL de 0,1 M TNT et 1 μL de transcriptase inverse M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (200 U/μL, Table des matières).
   4. Mélanger en pipetant doucement vers le haut et vers le bas. Si vous utilisez des amorces aléatoires, incuber le tube à 25 °C pendant 5 min.
   5. Incuber le tube à 55 °C pendant 60 min, puis inactiver la réaction en chauffant à 70 °C pendant 15 min, dans un bain sec numérique/bloc chauffant.
   6. Mesurer la concentration d’ADNc à l’aide d’un spectrophotomètre et la stocker à -25 °C.
3. Amplification par PCR et séquençage de confirmation des produits
   1. Ajouter les réactifs suivants à un tube de microcentrifugation sans nucléase : 4 μL de 5x tampon de polymérase Taq, 2 μL de mélange dNTP de 2 mM, 2 μL de 25 mM_MgCl2, 1,6 μL de l’ensemble d’amorce (avant et arrière; chacun 10 mM), 2 μL de gabarit d’ADNc, 0,1 μL de polymérase Taq (2,5 U/μL) et 8,3 μL d’eau distillée stérile (volume final, 20 μL).
   2. Effectuer la PCR dans les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min ; 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 2 min, de recuit à une température appropriée (en fonction de l’ensemble d’apprêt spécifique utilisé) pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 2 min; puis une dernière prolongation à 72 °C pendant 7 min.
   3. Pour purifier les produits de PCR, ajouter 2 U d’exonucléase I et 0,5 U de phosphatase alcaline de crevette (ExoSAP). Incuber le tube dans un cycleur thermique à 37 °C pendant 1 h, puis à 80 °C pendant 15 min, puis maintenir à 4 °C jusqu’à l’étape suivante.
   4. Pour le séquençage de confirmation, ajouter 11,5 μL d’eau distillée stérile, 2,5 μL d’apprêt avant ou arrière et 1 μL de produits PCR (avec ExoSAP) à un nouveau tube de microcentrifugation.
      REMARQUE: Utilisez les services de séquençage de l’ADN (par exemple, Eurofins Genomics) pour l’analyse du séquençage.
   5. Pour valider la spécificité des produits PCR, effectuez le séquençage avec des amorces avant et arrière. Les paires d’amorces utilisées dans l’analyse représentative sont données dans le tableau 1.
   6. Diluer les produits PCR purifiés à une concentration de 200 ng/μL avec de l’eau désionisée. Ensuite, mélangez 6 μL du produit purifié avec 3 μL de colorant à chargement de gel 6x dans un tube de 250 μL et augmentez le volume total à 12 μL avec de l’eau stérile. Conservez le produit PCR (à -25 °C) jusqu’à ce qu’il soit prêt à procéder avec μTGGE comme décrit ci-dessous.

3. Analyse μTGGE

REMARQUE: L’analyse μTGGE est effectuée à l’aide d’un système miniaturisé et économique. La figure 2 présente une vue d’ensemble du système complet, y compris les cassettes en gel, le support de cassette en gel, la plate-forme d’électrophorèse horizontale sur gel, l’alimentation et le système d’imagerie sur gel.

1. Assemblage des cassettes de gel
   1. La cassette de gel utilisée pour l’analyse μTGGE est illustrée à la figure 2A. La conception se compose de trois plaques de gel de 1 pouce: une plaque de gel inférieure, une plaque de gel supérieure et une plaque de séparation. Sandwich la plaque de gel supérieure entre les deux autres plaques et assembler dans le support de cassette de gel pour la polymérisation du gel.
2. Préparation de gel de polyacrylamide
   1. Ajouter 7,2 g d’urée dans un tube de 50 mL et dissoudre dans 10 mL d’eau stérile. Chauffer l’échantillon au micro-ondes pendant 20 à 30 s, puis le ramener à température ambiante (RT).
   2. Ajouter à la solution 3 mL de tampon 5x Tris/borate/EDTA (TBE) (Table des matériaux), 2,25 mL d’acrylamide/bis à 40 % (p/v) (19:1), 75 μL de persulfate d’ammonium 10x et 15 μL de tétraméthyléthylènediamine.
   3. Versez immédiatement la solution de gel dans le support de cassette de gel lentement, en évitant la formation de bulles d’air.
3. Génération de profils de fusion à l’aide de l’unité μTGGE
   1. Utilisez la version miniaturisée et économique de l’appareil μTGGE illustré à la figure 2 avec un gradient de température (25-65 °C) fixé perpendiculairement à la direction de la migration de l’ADN.
   2. Faire tremper les tampons tampons d’électrophorèse supérieurs et inférieurs (0,5 cm x 2,5 cm) dans 2 mL de tampon 1x TBE.
   3. Placez la cassette de gel dans l’unité de la chambre d’électrophorèse horizontale et positionnez les tampons tampons supérieurs et inférieurs en conséquence, comme illustré à la figure 2.
   4. Ensuite, chargez 10 μL du produit PCR dans le puits central (plus long) et 1 μL du produit PCR dans chaque puits latéral.
   5. Après 1 min d’attente, branchez l’unité d’alimentation et alimentez 100 V pendant 12 min à un gradient de température linéaire de 25 à 65 °C.
   6. Une fois l’exécution terminée, retirez la cassette et retirez le couvercle supérieur en verre.
   7. Versez 300 μL de 10x SYBR Gold sur le gel. Visualisez les profils de fusion à l’aide de la lampe de poche LED bleue installée dans le dispositif électrophorétique de la taille d’une paume.
      REMARQUE: Un fichier souple de l’image de gel doit être enregistré pour le calcul du score de similitude de modèle (PaSS).
   8. Répétez chaque expérience électrophorétique 3x pour confirmer la reproductibilité des données.

4. Calculs PaSS

REMARQUE: Les calculs sont effectués à l’aide du logiciel μTGGE Analyzer.

1. Téléchargez et ouvrez le logiciel.
2. Ouvrez le fichier JPEG contenant l’image gel. Notez que le logiciel n’acceptera que les fichiers au format JPEG.
3. Cliquez sur le bouton Cadre et sélectionnez la zone appropriée (cadre) de l’image gel.
4. Cliquez sur le bouton Correction de coordonnées et ajoutez deux points de référence, comme illustré à la figure 1B.
5. Cliquez sur le bouton Ajout de points d’entité et ajoutez des points d’échantillonnage comme illustré à la figure 1B. Enregistrez ensuite les données d’image de gel traitées au format μTGGE (*.tgg).
6. Cliquez sur le bouton Exemple et sélectionnez l’option Rechercher des points simples pour comparer deux images ou plus.

Résultats

Utilisation de μTGGE pour identifier les changements de base nucléotidique unique dans les événements d’édition de l’ARN
Quatre gènes modifiés ont été utilisés pour ce protocole (tableau 1), y compris le gène BFP produit dans les cellules HEK293 (avec l’édition de l’ARN C à U par les enzymes désaminases du complexe enzymatique d’édition de l’ARNm apolipoprotéine B; APOBEC1¹⁵), le gène EGFP contenant le codon stop ocre (TAA) produit ...

Discussion

L’édition de l’ARN joue un rôle important en biologie; cependant, les méthodes actuelles de détection de l’édition de l’ARN, telles que la chromatographie et le séquençage, présentent plusieurs défis en raison de leur coût élevé, de leurs exigences de temps excessives et de leur complexité. Le protocole décrit ici est une méthode simple, rapide et rentable de détection de l’édition de l’ARN qui utilise un système portable, microdimensionnel et basé sur TGGE. Ce système peut être utilisé ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65