JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ゲノム規模でのRNA編集イベントの迅速な検出と信頼性の高い定量化は依然として困難であり、現在は直接RNAシーケンシング法に依存しています。ここで説明するプロトコルは、RNA編集を検出するための簡単で迅速でポータブルな方法として、微小温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)を使用しています。

要約

RNA編集は、RNAにおける転写後配列変化をもたらすプロセスである。RNA編集の検出と定量は、主にサンガーシーケンシングとRNAシーケンシング技術に依存しています。ただし、これらの方法はコストと時間がかかる場合があります。このプロトコルでは、ポータブルマイクロ温度勾配ゲル電気泳動(μTGGE)システムが、RNA編集の迅速な検出のための非シーケンシングアプローチとして使用されます。このプロセスは電気泳動の原理に基づいており、核酸サンプルがポリアクリルアミドゲル上を移動する際に高温を使用して変性します。さまざまな温度にわたって、DNA断片は、完全に分離された二本鎖DNAから部分的に分離された鎖への勾配を形成し、次いで完全に分離された一本鎖DNAへの勾配を形成する。異なるヌクレオチド塩基を有するRNA編集部位は、μTGGE分析において異なる融解プロファイルを生成する。我々は、μTGGEベースのアプローチを使用して、4つの編集されたRNA断片とそれらに対応する非編集(野生型)断片の融解プロファイルの違いを特徴付けた。パターン類似性スコア(PaSS)は、編集されたRNAと編集されていないRNAによって生成されたバンドパターンを比較することによって計算され、方法の再現性を評価するために使用された。全体として、ここで説明するプラットフォームは、RNA中の一塩基変異でさえも、簡単でシンプルで費用対効果の高い方法で検出することを可能にします。この解析ツールは、新しい分子生物学の知見の一助となることが期待されます。

概要

ゲノムRNA中の一塩基変異体(SNV)は、A対I、C対U、およびU対C変異体を含むが、RNA編集事象を示し得る。しかし、RNA中のSNVの検出は依然として技術的に困難な作業である。従来、編集済みRNAと非編集RNAの比率は、直接シークエンシング、対立遺伝子特異的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または変性高速液体クロマトグラフィー(HPLC)アプローチによって決定される1、2、3、4、5、6に近づく。しかし、これらのアプローチは特に時間的または費用対効果が高くなく、高レベルのノイズによって引き起こされるそれらの低い精度は、RNAベースのSNV検出の技術的ボトルネックを引き起こします7,8。ここでは、RNA編集解析への直接RNAシーケンシングアプローチの必要性を排除する代替方法として、一塩基多型(SNP)を同定するための温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)に基づくプロトコルについて説明します。

電気泳動は、生命科学実験室における生体分子の分離および分析のための好ましい方法である。TGGEは、同じサイズでありながら配列が異なる二本鎖DNA断片の分離を可能にする。この技術は、DNA断片の融解温度における配列関連の違いと、それに続く線形温度勾配9,10を有する多孔質ゲルにおけるそれらの移動度の変化に依存する。DNA断片の融解は、特異的な融解プロファイルを生成する。最も低い融解温度を有するドメインがゲル内の特定の位置で対応する温度に達すると、らせん構造から部分的に融解した構造への移行が起こり、分子の遊走は実質的に停止する。したがって、TGGEはDNA断片の移動度(サイズ情報)と温度誘起構造遷移(配列依存性情報)の両方を利用し、DNA断片の特性評価への強力なアプローチとなっています。DNA分子の3つの構造遷移に対応するTGGE融解パターンの特徴点は、鎖初期解離点、鎖中間解離点、鎖末端解離点です(図1)。ドメイン内の配列の変動は、たとえ一塩基の違いであっても、融解温度に影響を与えるため、異なる配列を持つ分子はTGGE分析において離散的な融解(変性)パターンを示します。したがって、TGGEはゲノムRNA中のSNVを分析するために使用でき、RNA編集を検出するための非常に貴重なハイスループット方法となり得る。このハイスループットゲインは、従来のゲル電気泳動ベースのTGGEを使用すると失われます。しかし、microTGGE(μTGGE)と名付けられたTGGEの小型化バージョンは、ゲル電気泳動時間を短縮し、生産性を100倍向上させて分析を加速するために使用できます11。μTGGE法のシンプルさとコンパクトさは、現場で適用可能なハンドヘルドで手頃な価格のゲル電気泳動システムであるPalmPAGE12の導入によって改善されました。

ここでは、新しいTGGEベースのプロトコルを使用して、 シロイヌナズナ 組織からの2つと哺乳動物のHEK293細胞で発現された2つを含む4つの遺伝子における3種類のRNA編集部位(A-to-I、C-to-U、およびU-to-C)を調べる。このプロトコルは、RNA編集の迅速な検出のためのポータブルシステムであるPalmPAGE(ハードウェア)とuMelt(ソフトウェア)の使用を統合しています13。平均実行時間は 15 ~ 30 分で、このプロトコルは、直接 RNA シーケンシングアプローチを必要とせずに、RNA 編集の迅速で信頼性が高く、簡単な識別を可能にします。

プロトコル

1. ターゲットフラグメントの最適化

注:このプロトコルの開発には、 A. thalianaの2つの核遺伝子(AT2G16586およびAT5G02670)、およびHEK293細胞で発現する青色蛍光タンパク質(BFP)および増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)をコードする遺伝子を含む、4つの編集された遺伝子が使用された。

  1. 編集領域と非編集領域を表す異なる融解プロファイルを有する遺伝子断片を同定するために、元のuMeltソフトウェア13の拡張であるuMelt HETSウェブベースのツールを使用して予測融解曲線を生成する。
    注: このツールは、ヘテロ二重およびホモデュプレックス製品の融解曲線の形状を予測します。
  2. 各標的遺伝子について、3対の遺伝子断片(長さ300〜324bp)を設計する。各ペアは、編集部位を有する断片と、5'末端、中間位置、または3'末端のいずれかに位置する非編集部位を有する対応する野生型断片とから構成される。
  3. さらなる分析のために、ヘリシティ軸上の融解領域間の最大差を示した非編集/編集ペアを選択します。μTGGE解析の場合、以下のセクション2に記載されるように、PCR増幅によって選択された遺伝子断片を合成する。
  4. DNADynamoソフトウェア(https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm)を使用してフォワードプライマーとリバースプライマーを設計し、NCBI Primer-BLASTツールを使用して検証します。
  5. プライマーをTE緩衝液(1mM EDTA·Na2)を100pmol/μLの濃度で保存し、使用前に、各プライマーセットを蒸留水を用いて10pmol/μLの濃度に希釈する。

2. 標的断片のRNA抽出とRT-PCR増幅

  1. RNA抽出
    1. 編集済みおよび非編集された遺伝子の供給源から、TRIzol抽出14 または市販のキットなどの標準的な方法を用いて全RNAを抽出する。
    2. ステップ2.2で説明したように、標準RT-PCRプロトコルを使用して対応するcDNAの合成を実行します。
  2. 逆転写
    1. 1 μL のオリゴ(dT)プライマー、1 μL の 10 mM dNTP ミックス、10 μL の全 RNA、および 10 μL の滅菌蒸留水をヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブに加えます。
    2. 混合物を65°Cで5分間加熱し、次いで氷上で少なくとも1分間インキュベートする。
    3. 最大速度(12,000 x g)で2~3秒間遠心分離してチューブの内容物を集め、4 μLの5x ReverTra Aceバッファー、1 μLの0.1 M DTT、および1 μLのM-MLV(Moloney Murine 白血病ウイルス)逆転写酵素(200 U/μL、 材料表)を加える。
    4. 優しく上下にピペッティングして混ぜる。ランダムプライマーを使用する場合は、チューブを25°Cで5分間インキュベートする。
    5. チューブを55°Cで60分間インキュベートし、デジタルドライバス/ブロックヒーターで70°Cで15分間加熱して反応を失活させます。
    6. 分光光度計を用いてcDNAの濃度を測定し、-25°Cで保存する。
  3. PCR増幅および産物の確認シーケンシング
    1. ヌクレアーゼフリーの微量遠心チューブに以下の試薬を加える:4 μLの5 Taq Polymerase Buffer、2 μLの2 mM dNTPミックス、2 μLの25 mM MgCl 2、1.6 μLのプライマーセット(正方向と逆方向;各10 mM)、2 μLのcDNAテンプレート、0.1 μLのTaqポリメラーゼ(2.5 U/μL)、および8.3 μLの滅菌蒸留水(最終容量、 20 μL)。
    2. 以下のサイクル条件でPCRを行う:初期変性を95°Cで2分間;95°Cで2分間の変性を35サイクル、適切な温度で(使用する特定のプライマーセットに応じて)30秒間アニーリングし、72°Cで2分間伸長する;その後、72°Cで7分間最終伸長した。
    3. PCR産物を精製するために、2UのエキソヌクレアーゼIおよび0.5Uのエビアルカリホスファターゼ(ExoSAP)を添加する。チューブをサーマルサイクラー中で37°Cで1時間インキュベートし、続いて80°Cで15分間インキュベートし、次いで次のステップまで4°Cに維持する。
    4. 確認シーケンシングのために、11.5 μL の滅菌蒸留水、2.5 μL のフォワードプライマーまたはリバースプライマー、および 1 μL の PCR 産物 (ExoSAP を使用) を新しい微量遠心チューブに追加します。
      注: シーケンシング解析には、DNA シーケンシングサービス(Eurofins Genomics など)を使用してください。
    5. PCR 産物の特異性を検証するには、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方でシーケンシングを実行します。代表的な解析に用いたプライマー対を 表1に示す。
    6. 精製したPCR産物を脱イオン水で200ng/μLの濃度に希釈する。次に、精製物 6 μL と 3 μL の 6 x ゲルローディング色素を 250 μL チューブで混合し、滅菌水で全量を 12 μL に上げます。PCR産物を、以下に説明するようにμTGGEで進行する準備ができるまで(-25°Cで)保存する。

3. μTGGE分析

注:μTGGE分析は、小型化された経済的なシステムを使用して実行されます。ゲルカセット、ゲルカセットホルダー、水平ゲル電気泳動プラットフォーム、電源、およびゲルイメージングシステムを含む完全なシステムの概要を 図2に示します。

  1. ゲルカセットの組み立て
    1. μTGGE分析に用いたゲルカセットを 図2Aに示す。このデザインは、ボトムゲルプレート、トップゲルプレート、レーンフォーマープレートの3つの1インチゲルプレートで構成されています。上部のゲルプレートを他の2つのプレートの間に挟み込み、ゲル重合用のゲルカセットホルダーに組み立てます。
  2. ポリアクリルアミドゲル調製
    1. 50 mLチューブに7.2 gの尿素を加え、10 mLの滅菌水に溶解する。サンプルをマイクロ波で20〜30秒間加熱し、室温(RT)にします。
    2. 3 mL の 5x トリス/ホウ酸塩/EDTA (TBE) バッファー (材料表)、2.25 mL の 40% (w/v) アクリルアミド/ビス (19:1)、75 μL の 10x 過硫酸アンモニウム、および 15 μL のテトラメチルエチレンジアミンを溶液に加えます。
    3. 直ちにゲル溶液をゲルカセットホルダーにゆっくりと注ぎ、気泡の形成を避ける。
  3. μTGGEユニットを使用した融解プロファイルの生成
    1. 図2に示すμTGGE装置の小型で経済的なバージョンを使用し、DNAマイグレーションの方向に対して垂直に設定された温度勾配(25〜65°C)を使用してください。
    2. 上下の電気泳動バッファーパッド (0.5 cm x 2.5 cm) を 2 mL の 1x TBE バッファーに浸します。
    3. 図2に示すように、ゲルカセットを水平電気泳動チャンバーユニットに配置し、それに応じて上下のバッファーパッドを配置します。
    4. 次に、10 μL の PCR 産物を中央 (長い) ウェルに、1 μL の PCR 産物を各サイドウェルにロードします。
    5. 1分間待機した後、電源ユニットを接続し、25~65°Cの直線温度勾配で100Vを12分間供給します。
    6. 走行が完了したら、カセットを取り出し、上部のガラスカバーを取り外します。
    7. 300 μL の 10x SYBR ゴールド染色剤をゲルに注ぎます。手のひらサイズの電気泳動装置に取り付けられた青色LED懐中電灯を使用して、溶融プロファイルを視覚化します。
      メモ: ゲル画像のソフトファイルは、パターン類似度スコア(PaSS)計算のために保存する必要があります。
    8. 電気泳動実験3xごとに繰り返し、データの再現性を確認する。

4. パスSSの計算

メモ:計算はμTGGEアナライザソフトウェアを使用して実行されます。

  1. ソフトウェアをダウンロードして開きます。
  2. ゲル画像を含むJPEGファイルを開きます。ソフトウェアはJPEG形式のファイルのみを受け入れることに注意してください。
  3. [フレーム]ボタンをクリックし、ゲル画像の適切な領域(フレーム)を選択します。
  4. [ 座標補正] ボタンをクリックし、 図1Bに示すように、2つの参照点を追加します。
  5. [ フィーチャ ポイントの追加] ボタンをクリックし、 図 1B に示すようにサンプル ポイントを追加します。次に、処理したゲル画像データをμTGGE(*.tgg)形式で保存する。
  6. [ サンプル] ボタンをクリックし、[ 単純なポイントを検索] オプションを選択して、2つ以上の画像を比較します。

結果

μTGGEを使用してRNA編集イベントにおける一塩基塩基変化を同定
HEK293細胞で産生されたBFP遺伝子を含む4つの編集された遺伝子がこのプロトコル(アポリポタンパク質B mRNA編集酵素複合体のデアミナーゼ酵素によるC-to-U RNA編集;APOBEC115)、HEK293細胞で産生された黄土色終止コドン(TAA)を含むEGFP遺伝子(RNAに作用するアデノシンデアミナーゼによるA-to-I RNA?...

ディスカッション

RNA編集は生物学において重要な役割を果たします。しかし、クロマトグラフィーやシーケンシングなどの現在の RNA 編集の検出方法は、コストが高く、時間要件が大きすぎ、複雑さが増すため、いくつかの課題があります。ここで説明するプロトコルは、ポータブルでマイクロサイズのTGGEベースのシステムを使用する、RNA編集を検出するためのシンプルで迅速で費用対効果の高い方法です。?...

開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金(17H02204, 18K19288)の助成を受けて行われました。ルチカは日本政府(文部科学省奨学金)の資金援助を受けていました。ラディカ・ビヤニ氏(JAIST高木研究室)とキルティ・シャルマ博士(バイオシーズ株式会社)に電気泳動関連の実験に協力していただき、誠にありがとうございます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2U ExoITakara2650AExonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)Thermo fisherAM9022
Ammonium persulfate (APS)Thermo Fisher17874
Centrifuge Mini spineppendorf5452000034
Digital dry bath/ block heaterThermo fisherNA
Gold Taq Polymerase Master mixturePromegaM7122
LATaq DNA polymeraseTAKARARR002ATaq Polymerase
micro-TGGE  cassette holderBioSeeds Corp.BS-GE-CH
micro-TGGE apparatusLifetech Corp.TG
micro-TGGE gel cassetteBioSeeds Corp.BS-TGGE-C
NanoDrop 1000Thermo fisherND-1000Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kitQiagen74904
ReverTra Ace Master MixTOYOBOTRT101M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kitQiagen74104
Shrimp Alkaline PhosphataseTakara2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stainThermo fisherS11494
TBE bufferThermo fisherB52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Nacalai tesque33401-72
Urea, Nuclease and protease testedNacalai tesque35940-65

参考文献

  1. Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
  2. Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
  3. Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
  4. Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
  5. Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
  6. Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
  7. Marian, A. J. The bottleneck in genetic testing. Circulation Research. 117 (7), 586-588 (2015).
  8. Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
  9. Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, 153-165 (2009).
  10. Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
  11. Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
  12. Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
  13. Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
  14. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  15. Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
  16. Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
  17. Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
  18. Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved