Un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN

Resumen

La detección rápida y la cuantificación confiable de los eventos de edición de ARN a escala genómica siguen siendo un desafío y actualmente dependen de métodos de secuenciación directa de ARN. El protocolo descrito aquí utiliza la electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un método simple, rápido y portátil para detectar la edición de ARN.

Resumen

La edición de ARN es un proceso que conduce a alteraciones de la secuencia posttranscripcional en los ARN. La detección y cuantificación de la edición de ARN se basa principalmente en la secuenciación de Sanger y las técnicas de secuenciación de ARN. Sin embargo, estos métodos pueden ser costosos y llevar mucho tiempo. En este protocolo, se utiliza un sistema portátil de electroforesis en gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como un enfoque no secuenciador para la detección rápida de la edición de ARN. El proceso se basa en el principio de electroforesis, que utiliza altas temperaturas para desnaturalizar muestras de ácido nucleico a medida que se mueven a través de un gel de poliacrilamida. A través de un rango de temperaturas, un fragmento de ADN forma un gradiente de ADN de doble cadena a hebras parcialmente separadas y luego a ADN de cadena simple completamente separado. Los sitios editados por ARN con distintas bases de nucleótidos producen diferentes perfiles de fusión en los análisis de μTGGE. Utilizamos el enfoque basado en μTGGE para caracterizar las diferencias entre los perfiles de fusión de cuatro fragmentos de ARN editados y sus correspondientes fragmentos no editados (tipo salvaje). Las puntuaciones de similitud de patrones (PaSS) se calcularon comparando los patrones de banda producidos por los ARN editados y no editados y se utilizaron para evaluar la reproducibilidad del método. En general, la plataforma descrita aquí permite la detección de mutaciones incluso de base única en ARN de una manera directa, simple y rentable. Se prevé que esta herramienta de análisis ayudará a nuevos hallazgos de biología molecular.

Introducción

Las variantes de nucleótido único (SNV) en el ARN genómico, incluidas las variantes de A a I, C a U y U a C, pueden indicar eventos de edición de ARN. Sin embargo, la detección de SNVs en el ARN sigue siendo una tarea técnicamente desafiante. Convencionalmente, la proporción de ARN editado a no editado se determina mediante secuenciación directa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real específica del alelo o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de desnaturalización 1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques no son particularmente efectivos en tiempo o costo, y sus bajas precisiones, causadas por altos niveles de ruido, plantean cuellos de botella tecnológicos para la detección de SNV basada en ARN ^7,8. Aquí, describimos un protocolo basado en la electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) como un método alternativo que elimina la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN para los análisis de edición de ARN.

La electroforesis es un método preferido para la separación y el análisis de biomoléculas en laboratorios de ciencias de la vida. TGGE permite la separación de fragmentos de ADN de doble cadena que son del mismo tamaño pero tienen diferentes secuencias. La técnica se basa en las diferencias relacionadas con la secuencia en las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN y los cambios posteriores en sus movilidades en geles porosos con un gradiente de temperatura lineal ^9,10. La fusión de fragmentos de ADN genera perfiles de fusión específicos. Una vez que el dominio con la temperatura de fusión más baja alcanza la temperatura correspondiente en una posición particular en el gel, se produce la transición de una estructura helicoidal a una estructura parcialmente fundida, y la migración de la molécula prácticamente se detendrá. Por lo tanto, TGGE utiliza tanto la movilidad (información de tamaño) como las transiciones estructurales inducidas por la temperatura de los fragmentos de ADN (información dependiente de la secuencia), lo que lo convierte en un enfoque poderoso para la caracterización de fragmentos de ADN. Los puntos característicos en un patrón de fusión TGGE, que corresponden a tres transiciones estructurales de la molécula de ADN, son el punto de disociación inicial de la hebra, el punto de disociación media de la hebra y el punto de disociación final de la hebra (Figura 1). Las variaciones de secuencia dentro de los dominios, incluso las diferencias de una sola base, afectan la temperatura de fusión, por lo tanto, las moléculas con diferentes secuencias mostrarán patrones discretos de fusión (desnaturalización) en los análisis TGGE. Por lo tanto, TGGE se puede utilizar para analizar SNV en ARN genómico y puede ser un método invaluable de alto rendimiento para detectar la edición de ARN. Esta ganancia de alto rendimiento se pierde cuando se utiliza TGGE tradicional basado en electroforesis en gel. Sin embargo, una versión miniaturizada de TGGE, llamada microTGGE (μTGGE), se puede utilizar para acortar el tiempo electroforético del gel y acelerar el análisis con un aumento de 100 veces en la productividad¹¹. La simplicidad y la compacidad del método μTGGE se han mejorado con la introducción de PalmPAGE¹², un sistema de electroforesis en gel aplicable en el campo, portátil y asequible.

Aquí, se utiliza un nuevo protocolo basado en TGGE para examinar tres tipos de sitios de edición de ARN (A-to-I, C-to-U y U-to-C) en cuatro genes, incluidos dos de tejidos de Arabidopsis thaliana y dos expresados en células HEK293 de mamíferos (Figura 1A). El protocolo integra el uso de PalmPAGE (hardware), un sistema portátil para la detección rápida de la edición de ARN, y uMelt (software)¹³. Con un tiempo de ejecución promedio de 15-30 min, este protocolo permite una identificación rápida, confiable y fácil de la edición de ARN sin la necesidad de enfoques de secuenciación directa de ARN.

Protocolo

1. Optimización del fragmento objetivo

NOTA: Se utilizaron cuatro genes editados en el desarrollo de este protocolo, incluidos dos genes nucleares (AT2G16586 y AT5G02670) de A. thaliana, y los genes que codifican la proteína fluorescente azul (BFP) y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) expresadas en células HEK293.

1. Para identificar fragmentos de genes con diferentes perfiles de fusión, que representan regiones editadas versus no editadas, genere curvas de fusión predichas utilizando la herramienta basada en la web uMelt HETS, una extensión del software original uMelt¹³.
   NOTA: Esta herramienta predice las formas de las curvas de fusión para productos heterodúplex y homodúplex.
2. Para cada gen objetivo, diseñe tres pares de fragmentos de genes (300-324 pb de longitud). Cada par se compone de un fragmento con un sitio editado y un fragmento de tipo comodín correspondiente con un sitio no editado, ubicado en el extremo terminal de 5', la posición media o el extremo terminal de 3'.
3. Seleccione el par no editado/editado que mostró la diferencia máxima entre las regiones de fusión en el eje de helicidad para un análisis más detallado. Para el análisis μTGGE, sintetice el fragmento de gen seleccionado mediante amplificación por PCR, tal como se describe en la sección 2 siguiente.
4. Diseñe los cebadores hacia adelante y hacia atrás utilizando el software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) y verifique utilizando la herramienta NCBI Primer-BLAST.
5. Diluir los cebadores en tampón TE (10 mM Tris-HCl que contiene 1 mM EDTA· Na₂) y almacenarlos a una concentración de 100 pmol/μL. Antes de su uso, diluya cada imprimación a una concentración de 10 pmol/μL utilizando agua destilada.

2. Extracción de ARN y amplificación RT-PCR del fragmento objetivo

1. Extracción de ARN
   1. Extraiga el ARN total de la fuente de genes editados y no editados utilizando métodos estándar, como la extracción de TRIzol¹⁴ o kits disponibles comercialmente.
   2. Realizar la síntesis del ADNc correspondiente utilizando un protocolo RT-PCR estándar como se describe en el paso 2.2.
2. Transcripción inversa
   1. Agregue 1 μL de imprimación oligo(dT), 1 μL de mezcla de dNTP de 10 mM, 10 μL de ARN total y 10 μL de agua destilada estéril a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasas.
   2. Calentar la mezcla a 65 °C durante 5 min y luego incubar en hielo durante al menos 1 min.
   3. Recoger el contenido del tubo por centrifugación a velocidad máxima (12.000 x g) durante 2-3 s, y añadir 4 μL de tampón ReverTra Ace 5x, 1 μL de 0,1 M TDT y 1 μL de transcriptasa inversa M-MLV (Virus de la Leucemia Murina moloney) (200 U/μL, Tabla de Materiales).
   4. Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo suavemente. Si utiliza cebadores aleatorios, incube el tubo a 25 °C durante 5 min.
   5. Incubar el tubo a 55 °C durante 60 min y luego inactivar la reacción calentando a 70 °C durante 15 min, en un calentador digital de baño seco/bloque.
   6. Mida la concentración de ADNc utilizando un espectrofotómetro y guárdela a -25 °C.
3. Amplificación por PCR y secuenciación confirmatoria de productos
   1. Añadir los siguientes reactivos a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa: 4 μL de tampón de polimerasa Taq 5x, 2 μL de mezcla de dNTP de 2 mM, 2 μL de MgCl_{2 de mM}, 1,6 μL del conjunto de imprimación (adelante y atrás; cada uno 10 mM), 2 μL de plantilla de ADNc, 0,1 μL de Taq polimerasa (2,5 U/μL) y 8,3 μL de agua destilada estéril (volumen final, 20 μL).
   2. Realizar PCR con las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min; 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 2 min, recocido a una temperatura adecuada (dependiendo del juego de imprimación específico utilizado) durante 30 s, y extensión a 72 °C durante 2 min; y luego una extensión final a 72 °C durante 7 min.
   3. Para purificar los productos de PCR, agregue 2 U de exonucleasa I y 0.5 U de fosfatasa alcalina de camarón (ExoSAP). Incubar el tubo en un termociclador a 37 °C durante 1 h, seguido de 80 °C durante 15 min, y luego mantener a 4 °C hasta el siguiente paso.
   4. Para la secuenciación confirmatoria, agregue 11,5 μL de agua destilada estéril, 2,5 μL de imprimación directa o inversa y 1 μL de productos de PCR (con ExoSAP) a un nuevo tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Utilice los servicios de secuenciación de ADN (por ejemplo, Eurofins Genomics) para el análisis de secuenciación.
   5. Para validar la especificidad de los productos de PCR, realice la secuenciación con cebadores hacia adelante y hacia atrás. Los pares de cebadores utilizados en el análisis representativo se dan en la Tabla 1.
   6. Diluya los productos de PCR purificados a una concentración de 200 ng/μL con agua desionizada. A continuación, mezcle 6 μL del producto purificado con 3 μL de 6x colorante de carga de gel en un tubo de 250 μL y eleve el volumen total a 12 μL con agua estéril. Guarde el producto de PCR (a -25 °C) hasta que esté listo para continuar con μTGGE como se describe a continuación.

3. Análisis μTGGE

NOTA: El análisis μTGGE se realiza utilizando un sistema miniaturizado y económico. En la Figura 2 se muestra una descripción general del sistema completo, incluidos los casetes de gel, el soporte de casete de gel, la plataforma de electroforesis de gel horizontal, la fuente de alimentación y el sistema de imágenes de gel.

1. Montaje de los casetes de gel
   1. El casete de gel utilizado para el análisis de μTGGE se muestra en la Figura 2A. El diseño consta de tres placas de gel de 1 pulgada: una placa de gel inferior, una placa de gel superior y una placa de borde de carril. Coloque la placa de gel superior entre las otras dos placas y enséblela en el soporte de cassette de gel para la polimerización del gel.
2. Preparación de gel de poliacrilamida
   1. Añadir 7,2 g de urea a un tubo de 50 ml y disolver en 10 ml de agua estéril. Calentar la muestra en un microondas durante 20-30 s y luego llevarla a temperatura ambiente (RT).
   2. Añadir 3 mL de tampón tris/borato/EDTA (TBE) de 5x (Tabla de materiales), 2,25 ml de acrilamida/bis al 40% (p/v) (19:1), 75 μL de 10x persulfato de amonio y 15 μL de tetrametilendiamina a la solución.
   3. Vierta inmediatamente la solución de gel en el soporte del cassette de gel lentamente, evitando la formación de burbujas de aire.
3. Generación de perfiles de fusión utilizando la unidad μTGGE
   1. Utilice la versión miniaturizada y económica del aparato μTGGE que se muestra en la Figura 2 con un gradiente de temperatura (25-65 °C) establecido perpendicularmente a la dirección de la migración del ADN.
   2. Remoje las almohadillas tampón de electroforesis superior e inferior (0,5 cm x 2,5 cm) en 2 ml de 1 tampón TBE.
   3. Coloque el cassette de gel en la unidad de cámara de electroforesis horizontal y coloque las almohadillas tampón superior e inferior en consecuencia, como se muestra en la Figura 2.
   4. A continuación, cargue 10 μL del producto de PCR en el pozo medio (más largo) y 1 μL del producto de PCR en cada pozo lateral.
   5. Después de una espera de 1 minuto, conecte la unidad de alimentación y suministre 100 V durante 12 minutos a un gradiente de temperatura lineal de 25-65 ° C.
   6. Una vez completada la carrera, saque el cassette y retire la cubierta de vidrio superior.
   7. Vierta 300 μL de 10 veces la mancha SYBR Gold sobre el gel. Visualice los perfiles de fusión utilizando la linterna LED azul instalada en el dispositivo electroforético del tamaño de la palma de la mano.
      NOTA: Se debe guardar un archivo simplificado de la imagen del gel para el cálculo de la puntuación de similitud de patrón (PaSS).
   8. Repita cada experimento electroforético 3x para confirmar la reproducibilidad de los datos.

4. Cálculos de PaSS

NOTA: Los cálculos se realizan utilizando el software μTGGE Analyzer.

1. Descargue y abra el software.
2. Abra el archivo JPEG que contiene la imagen del gel. Tenga en cuenta que el software solo aceptará archivos en formato JPEG.
3. Haga clic en el botón Marco y seleccione el área apropiada (marco) de la imagen del gel.
4. Haga clic en el botón Corrección de coordenadas y agregue dos puntos de referencia, como se muestra en la Figura 1B.
5. Haga clic en el botón Adición de puntos de característica y agregue puntos de muestra como se muestra en la Figura 1B. A continuación, guarde los datos de imagen de gel procesados en formato μTGGE (*.tgg).
6. Haga clic en el botón Ejemplo y seleccione la opción Buscar puntos simples para comparar dos o más imágenes.

Resultados

Uso de μTGGE para identificar cambios en la base de un solo nucleótido en eventos de edición de ARN
Para este protocolo se utilizaron cuatro genes editados (Tabla 1), incluyendo el gen BFP producido en células HEK293 (con edición de ARN C-to-U por las enzimas desaminasas del complejo enzimático de edición de ARNm de apolipoproteína B; APOBEC1¹⁵), el gen EGFP que contiene el codón de parada ocre (TAA) producido en células HEK293 (con edición de ARN A-...

Discusión

La edición de ARN juega un papel importante en la biología; sin embargo, los métodos actuales de detección de edición de ARN, como la cromatografía y la secuenciación, presentan varios desafíos debido a su alto costo, requisitos de tiempo excesivos y complejidad. El protocolo descrito aquí es un método simple, rápido y rentable para detectar la edición de ARN que utiliza un sistema portátil, de tamaño micrométrico y basado en TGGE. Este sistema se puede utilizar para diferenciar entre genes editados y no e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65