RNA Düzenlemenin Hızlı Tespiti için Dizilemesiz Bir Yaklaşım

Özet

RNA düzenleme olaylarının genomik ölçekte hızlı tespiti ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi zorlu olmaya devam etmektedir ve şu anda doğrudan RNA dizileme yöntemlerine dayanmaktadır. Burada açıklanan protokol, RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve taşınabilir bir yöntem olarak mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) kullanır.

Özet

RNA düzenleme, RNA'larda posttranskripsiyonel dizi değişikliklerine yol açan bir süreçtir. RNA düzenlemenin tespiti ve nicelleştirilmesi esas olarak Sanger dizileme ve RNA dizileme tekniklerine dayanır. Ancak, bu yöntemler maliyetli ve zaman alıcı olabilir. Bu protokolde, RNA düzenlemenin hızlı tespiti için sıralanmamış bir yaklaşım olarak taşınabilir bir mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) sistemi kullanılmaktadır. Proses, bir poliakrilamid jel üzerinde hareket ederken nükleik asit numunelerini denatüre etmek için yüksek sıcaklıklar kullanan elektroforez prensibine dayanmaktadır. Bir dizi sıcaklık boyunca, bir DNA fragmanı, kısmen ayrılmış iplikçiklere ve daha sonra tamamen ayrılmış tek sarmallı DNA'ya tamamen çift sarmallı DNA'nın bir gradyanını oluşturur. Farklı nükleotid bazlarına sahip RNA tarafından düzenlenmiş bölgeler, μTGGE analizlerinde farklı erime profilleri üretir. Dört düzenlenmiş RNA fragmanının erime profilleri ile bunlara karşılık gelen düzenlenmemiş (vahşi tip) fragmanlar arasındaki farkları karakterize etmek için μTGGE tabanlı yaklaşımı kullandık. Örüntü Benzerlik Puanları (PaSS'ler), düzenlenmiş ve düzenlenmemiş RNA'lar tarafından üretilen bant desenleri karşılaştırılarak hesaplandı ve yöntemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı. Genel olarak, burada açıklanan platform, RNA'lardaki tek baz mutasyonlarının bile basit, basit ve uygun maliyetli bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu analiz aracının yeni moleküler biyoloji bulgularına yardımcı olacağı öngörülmektedir.

Giriş

A-to-I, C-to-U ve U-to-C varyantları dahil olmak üzere genomik RNA'daki tek nükleotid varyantları (SNV'ler), RNA düzenleme olaylarını gösterebilir. Bununla birlikte, RNA'daki SNV'lerin tespiti teknik olarak zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Geleneksel olarak, düzenlenmiş RNA'nın düzenlenmemiş RNA'ya oranı, doğrudan dizileme, alele özgü gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya denatüre edici yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yaklaşımları 1,2,3,4,5,6 ile belirlenir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar özellikle zaman veya maliyet açısından etkili değildir ve yüksek gürültü seviyelerinin neden olduğu düşük doğrulukları, RNA tabanlı SNV tespiti ^7,8 için teknolojik darboğazlar oluşturmaktadır. Burada, RNA düzenleme analizlerine doğrudan RNA dizileme yaklaşımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldıran alternatif bir yöntem olarak tek nükleotid polimorfizmlerini (SNP'ler) tanımlamak için sıcaklık gradyanı jel elektroforezine (TGGE) dayanan bir protokol tanımlamaktayız.

Elektroforez, yaşam bilimleri laboratuvarlarında biyomoleküllerin ayrılması ve analizi için tercih edilen bir yöntemdir. TGGE, aynı boyutta ancak farklı dizilere sahip çift sarmallı DNA parçalarının ayrılmasını sağlar. Teknik, DNA fragmanlarının erime sıcaklıklarındaki diziye bağlı farklılıklara ve doğrusal sıcaklık gradyanı ^9,10 olan gözenekli jellerdeki hareketliliklerindeki müteakip değişikliklere dayanır. DNA fragmanlarının erimesi, spesifik erime profilleri oluşturur. En düşük erime sıcaklığına sahip alan, jeldeki belirli bir konumda karşılık gelen sıcaklığa ulaştığında, sarmal bir yapıdan kısmen erimiş bir yapıya geçiş gerçekleşir ve molekülün göçü pratik olarak durur. Bu nedenle, TGGE, DNA fragmanlarının (diziye bağlı bilgi) hem hareketliliğini (boyut bilgisi) hem de sıcaklık kaynaklı yapısal geçişlerini kullanır ve bu da onu DNA parçalarının karakterizasyonuna güçlü bir yaklaşım haline getirir. DNA molekülünün üç yapısal geçişine karşılık gelen TGGE erime modelindeki özellik noktaları, iplik başlangıç-ayrışma noktası, iplik orta-ayrışma noktası ve iplik sonu ayrışma noktasıdır (Şekil 1). Etki alanları içindeki dizi değişimleri, hatta tek baz farklılıkları bile, erime sıcaklığını etkiler, bu nedenle, farklı dizilere sahip moleküller, TGGE analizlerinde ayrık erime (denatürasyon) kalıpları gösterecektir. Bu nedenle, TGGE, genomik RNA'daki SNV'leri analiz etmek için kullanılabilir ve RNA düzenlemesini tespit etmek için paha biçilmez bir yüksek verimli yöntem olabilir. Bu yüksek verimli kazanç, geleneksel jel elektroforez bazlı TGGE kullanıldığında kaybolur. Bununla birlikte, TGGE'nin microTGGE (μTGGE) adı verilen minyatür bir versiyonu, jel elektroforetik süresini kısaltmak ve verimlilikte 100 kat artışla analizi hızlandırmak için kullanılabilir¹¹. μTGGE yönteminin basitliği ve kompaktlığı, sahaya uygun, elde taşınabilen ve uygun fiyatlı bir jel elektroforez sistemi olan PalmPAGE^12'nin piyasaya sürülmesiyle geliştirilmiştir.

Burada, ikisi Arabidopsis thaliana dokularından ve ikisi memeli HEK293 hücrelerinde eksprese edilen dört gende üç tip RNA düzenleme bölgesini (A-to-I, C-to-U ve U-to-C) incelemek için yeni bir TGGE tabanlı protokol kullanılmaktadır (Şekil 1A). Protokol, RNA düzenlemenin hızlı tespiti için taşınabilir bir sistem olan PalmPAGE (donanım) ve uMelt (yazılım)¹³ kullanımını entegre eder. Ortalama 15-30 dakikalık çalışma süresine sahip olan bu protokol, doğrudan RNA dizileme yaklaşımlarına gerek kalmadan RNA düzenlemenin hızlı, güvenilir ve kolay bir şekilde tanımlanmasını sağlar.

Protokol

1. Hedef parçanın optimizasyonu

NOT: Bu protokolün geliştirilmesinde, A. thaliana'dan iki nükleer gen (AT2G16586 ve AT5G02670) ve HEK293 hücrelerinde eksprese edilen mavi floresan proteini (BFP) ve gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) kodlayan genler dahil olmak üzere dört düzenlenmiş gen kullanılmıştır.

1. Düzenlenmiş ve düzenlenmemiş bölgeleri temsil eden farklı erime profillerine sahip gen parçalarını tanımlamak için, orijinal uMelt yazılımı^13'ün bir uzantısı olan uMelt HETS web tabanlı aracını kullanarak tahmini erime eğrileri oluşturun.
   NOT: Bu araç, heteroduplex ve homoduplex ürünler için erime eğrilerinin şekillerini tahmin eder.
2. Her hedef gen için, üç çift gen parçası tasarlayın (300-324 bp uzunluğunda). Her çift, düzenlenmiş bir siteye sahip bir parçadan ve 5' terminal ucunda, orta konumda veya 3' terminal ucunda bulunan, düzenlenmemiş bir siteye sahip karşılık gelen vahşi tip bir parçadan oluşur.
3. Daha fazla analiz için helisite eksenindeki erime bölgeleri arasındaki maksimum farkı gösteren düzenlenmemiş/düzenlenmiş çifti seçin. μTGGE analizi için, seçilen gen fragmanını aşağıdaki bölüm 2'de açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu ile sentezleyin.
4. DNADynamo yazılımını (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) kullanarak ileri ve geri primerleri tasarlayın ve NCBI Primer-BLAST aracını kullanarak doğrulayın.
5. Astarları TE tamponunda seyreltin (1 mM EDTA· içeren 10 mM Tris-HCl Na₂) ve bunları 100 pmol / μL'lik bir konsantrasyonda saklayın. Kullanmadan önce, damıtılmış su kullanarak 10 pmol / μL'lik bir konsantrasyona ayarlanmış her astarı seyreltin.

2. RNA ekstraksiyonu ve hedef parçanın RT-PCR amplifikasyonu

1. RNA ekstraksiyonu
   1. TRIzol ekstraksiyonu 14 veya ticari olarak temin edilebilen kitler gibi standart yöntemleri kullanarak düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genlerin kaynağından toplam^RNA'yı çıkarın.
   2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi standart bir RT-PCR protokolü kullanarak karşılık gelen cDNA'nın sentezini gerçekleştirin.
2. Ters transkripsiyon
   1. Nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne 1 μL oligo (dT) primer, 1 μL 10 mM dNTP karışımı, 10 μL toplam RNA ve 10 μL steril damıtılmış su ekleyin.
   2. Karışımı 65 ° C'de 5 dakika ısıtın ve ardından en az 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   3. Tüpün içeriğini 2-3 s için maksimum hızda (12.000 x g) santrifüjleme ile toplayın ve 4 μL 5x ReverTra Ace tamponu, 1 μL 0.1 M DTT ve 1 μL M-MLV (Moloney Murine Lösemi Virüsü) ters transkriptaz (200 U / μL, Malzeme Tablosu) ekleyin.
   4. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın. Rastgele astarlar kullanıyorsanız, tüpü 5 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
   5. Tüpü 60 dakika boyunca 55 °C'de inkübe edin ve ardından dijital kuru banyo/blok ısıtıcıda 15 dakika boyunca 70 °C'de ısıtarak reaksiyonu etkisiz hale getirin.
   6. Bir spektrofotometre kullanarak cDNA konsantrasyonunu ölçün ve -25 ° C'de saklayın.
3. PCR amplifikasyonu ve ürünlerin doğrulayıcı dizilimi
   1. Aşağıdaki reaktifleri nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin: 4 μL 5x Taq Polimeraz Tamponu, 2 μL 2 mM dNTP karışımı, 2 μL 25 mM MgCl 2, primer setinin 1.6 μL (ileri ve geri; her biri 10 mM), 2 μL cDNA şablonu, 0.1 μL Taq polimeraz (_2.5 U / μL) ve 8.3 μL steril damıtılmış su (son hacim, 20 μL).
   2. Aşağıdaki döngü koşullarıyla PCR yapın: 2 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon; 2 dakika boyunca 95 °C'de 35 döngü denatürasyon, 30 s için uygun bir sıcaklıkta tavlama (kullanılan spesifik astar setine bağlı olarak) ve 2 dakika boyunca 72 °C'de uzatma; ve daha sonra 7 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzatma.
   3. PCR ürünlerini saflaştırmak için, 2 U Ekzonükleaz I ve 0.5 U karides alkali fosfataz (ExoSAP) ekleyin. Tüpü 1 saat boyunca 37 ° C'de bir termal döngücüde, ardından 15 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe edin ve ardından bir sonraki adıma kadar 4 ° C'de tutun.
   4. Doğrulayıcı dizileme için, yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 11,5 μL steril damıtılmış su, 2,5 μL ileri veya geri astar ve 1 μL PCR ürünü (ExoSAP ile) ekleyin.
      NOT: Dizileme analizi için DNA dizileme hizmetlerini (örneğin, Eurofins Genomics) kullanın.
   5. PCR ürünlerinin özgüllüğünü doğrulamak için, hem ileri hem de geri astarlarla sıralama yapın. Temsili analizde kullanılan astar çiftleri Tablo 1'de verilmiştir.
   6. Saflaştırılmış PCR ürünlerini deiyonize su ile 200 ng / μL konsantrasyona kadar seyreltin. Daha sonra, arıtılmış ürünün 6 μL'sini 250 μL'lik bir tüpte 3 μL 6x jel yükleme boyası ile karıştırın ve toplam hacmi steril suyla 12 μL'ye yükseltin. PCR ürününü (-25 °C'de) aşağıda açıklandığı gibi μTGGE ile devam etmeye hazır olana kadar saklayın.

3. μTGGE analizi

NOT: μTGGE analizi, minyatür ve ekonomik bir sistem kullanılarak gerçekleştirilir. Jel kasetler, jel kaset tutucu, yatay jel elektroforez platformu, güç kaynağı ve jel görüntüleme sistemi dahil olmak üzere tüm sisteme genel bir bakış Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. Jel kasetlerin montajı
   1. μTGGE analizi için kullanılan jel kaset Şekil 2A'da gösterilmiştir. Tasarım üç adet 1 inçlik jel plakadan oluşur: bir alt jel plaka, bir üst jel plaka ve bir şerit eski plaka. Üst jel plakayı diğer iki plaka arasında sandviç yapın ve jel polimerizasyonu için jel kaset tutucuya monte edin.
2. Poliakrilamid jel preparatı
   1. 50 mL'lik bir tüpe 7.2 g üre ekleyin ve 10 mL steril suda çözün. Numuneyi bir mikrodalgada 20-30 s ısıtın ve ardından oda sıcaklığına (RT) getirin.
   2. Çözeltiye 3 mL 5x Tris/borat/EDTA (TBE) tamponu (Malzeme Tablosu), 2,25 mL %40 (w/v) akrilamid/bis (19:1), 75 μL 10x amonyum persülfat ve 15 μL tetrametilenidiamin ekleyin.
   3. Jel çözeltisini derhal jel kaset tutucuya yavaşça dökün ve hava kabarcıkları oluşumunu önleyin.
3. μTGGE ünitesi kullanılarak eritme profillerinin oluşturulması
   1. Şekil 2'de gösterilen μTGGE cihazının minyatürleştirilmiş, ekonomik versiyonunu, DNA migrasyon yönüne dik olarak ayarlanmış bir sıcaklık gradyanı (25-65 °C) ile kullanın.
   2. Üst ve alt elektroforez tampon pedlerini (0,5 cm x 2,5 cm) 2 mL 1x TBE tamponunda ıslatın.
   3. Jel kaseti yatay elektroforez haznesi ünitesine yerleştirin ve üst ve alt tampon pedlerini Şekil 2'de gösterildiği gibi buna göre konumlandırın.
   4. Daha sonra, PCR ürününün 10 μL'sini orta (daha uzun) kuyuya ve PCR ürününün 1 μL'sini her iki taraftaki kuyuya yükleyin.
   5. 1 dakika bekledikten sonra, güç ünitesini bağlayın ve 25-65 ° C arasındaki doğrusal bir sıcaklık gradyanında 12 dakika boyunca 100 V besleme yapın.
   6. Çalıştırma tamamlandıktan sonra kaseti çıkarın ve üst cam kapağı çıkarın.
   7. Jel üzerine 300 μL 10x SYBR Gold lekesi dökün. Avuç içi boyutundaki elektroforetik cihaza takılı mavi LED el fenerini kullanarak eriyen profilleri görselleştirin.
      NOT: Jel görüntüsünün yumuşak bir dosyası, Desen Benzerlik Puanı (PaSS) hesaplaması için kaydedilmelidir.
   8. Verilerin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için her elektroforetik deneyi 3 kat tekrarlayın.

4. PaSS hesaplamaları

NOT: Hesaplamalar μTGGE Analyzer yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Yazılımı indirin ve açın.
2. Jel görüntüsünü içeren JPEG dosyasını açın. Yazılımın yalnızca JPEG formatındaki dosyaları kabul edeceğini unutmayın.
3. Çerçeve düğmesine tıklayın ve jel görüntüsünün uygun alanını (çerçeve) seçin.
4. Koordinat Düzeltme düğmesine tıklayın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi iki referans noktası ekleyin.
5. Özellik Noktalarının Eklenmesi düğmesine tıklayın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi örnek noktalar ekleyin. Ardından işlenen jel görüntü verilerini μTGGE (*.tgg) formatında kaydedin.
6. Örnek düğmesine tıklayın ve iki veya daha fazla görüntüyü karşılaştırmak için Basit Noktaları Ara seçeneğini belirleyin.

Sonuçlar

RNA düzenleme olaylarındaki tek nükleotid baz değişikliklerini tanımlamak için μTGGE kullanımı
Bu protokol için HEK293 hücrelerinde üretilen BFP geni de dahil olmak üzere dört düzenlenmiş gen kullanılmıştır (apolipoprotein B mRNA düzenleme enzim kompleksinin deaminaz enzimleri tarafından C-to-U RNA düzenlemesi ile; APOBEC1¹⁵), HEK293 hücrelerinde üretilen aşı boyası durdurma kodonu (TAA) içeren EGFP geni (RNA 1 üzerinde etkili ade...

Tartışmalar

RNA düzenleme biyolojide önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, kromatografi ve dizileme gibi RNA düzenlemesini tespit etmenin mevcut yöntemleri, yüksek maliyetleri, aşırı zaman gereksinimleri ve karmaşıklıkları nedeniyle çeşitli zorluklar ortaya koymaktadır. Burada açıklanan protokol, taşınabilir, mikrosifik, TGGE tabanlı bir sistem kullanan RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu sistem, Sanger diziliminden önce düzenlenmiş ve düzenlenmemiş ge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65