RNA 편집의 신속한 검출을 위한 비시퀀싱 접근법

요약

게놈 규모에서 RNA 편집 이벤트의 신속한 탐지와 신뢰할 수 있는 정량화는 여전히 어려운 과제이며 현재 직접 RNA 시퀀싱 방법에 의존하고 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 RNA 편집을 감지하는 간단하고 빠르며 휴대용 방법으로 미세 온도 구배 겔 전기 영동 (μTGGE)을 사용합니다.

초록

RNA 편집은 RNA의 전사 후 서열 변경으로 이어지는 과정입니다. RNA 편집의 검출 및 정량화는 주로 Sanger 시퀀싱 및 RNA 시퀀싱 기술에 의존합니다. 그러나 이러한 방법은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 휴대용 마이크로온도 구배 겔 전기영동(μTGGE) 시스템은 RNA 편집의 신속한 검출을 위한 비시퀀싱 접근법으로서 사용된다. 이 과정은 고온을 사용하여 핵산 샘플이 폴리아크릴아미드 겔을 가로 질러 이동할 때 변성시키는 전기 영동 원리에 기반합니다. 다양한 온도에 걸쳐, DNA 단편은 완전히 이중 가닥 DNA의 구배를 형성하여 부분적으로 분리 된 가닥을 형성 한 다음 완전히 분리 된 단일 가닥 DNA로 구배를 형성합니다. 뚜렷한 뉴클레오티드 염기를 갖는 RNA 편집 부위는 μTGGE 분석에서 상이한 용융 프로파일을 생성한다. 우리는 μTGGE 기반 접근법을 사용하여 네 개의 편집된 RNA 단편의 용융 프로파일과 그에 상응하는 편집되지 않은(야생형) 단편 사이의 차이를 특성화했습니다. 패턴 유사성 점수(PaSSs)는 편집된 RNA와 편집되지 않은 RNA에 의해 생성된 밴드 패턴을 비교하여 계산되었고, 방법의 재현성을 평가하기 위해 사용되었다. 전반적으로, 여기에 설명된 플랫폼은 RNA에서 심지어 단일 염기 돌연변이의 검출을 간단하고, 간단하고, 비용 효율적인 방식으로 가능하게 한다. 이 분석 도구는 새로운 분자 생물학 발견에 도움이 될 것으로 예상됩니다.

서문

A-to-I, C-to-U 및 U-to-C 변이체를 포함하는 게놈 RNA의 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)는 RNA 편집 이벤트를 나타낼 수 있다. 그러나 RNA에서 SNV를 탐지하는 것은 기술적으로 어려운 과제로 남아 있습니다. 종래, 편집된 RNA와 편집되지 않은 RNA의 비율은 직접 시퀀싱, 대립유전자 특이적 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 변성 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 접근법 1,2,3,4,5,6에 의해 결정된다. 그러나, 이러한 접근법들은 특별히 시간- 또는 비용-효과적이지 않으며, 높은 수준의 잡음에 의해 야기되는 이들의 낮은 정확도는 RNA 기반 SNV 검출^(7,8)에 대한 기술적 병목 현상을 야기한다. 여기에서는 RNA 편집 분석에 대한 직접 RNA 시퀀싱 접근법의 필요성을 제거하는 대안 방법으로 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs)을 식별하기 위해 온도 구배 겔 전기 영동 (TGGE)에 기반한 프로토콜을 설명합니다.

전기영동은 생명 과학 실험실에서 생체 분자의 분리 및 분석을 위해 선호되는 방법이다. TGGE는 크기가 같지만 서열이 다른 이중 가닥 DNA 단편의 분리를 가능하게 합니다. 이 기술은 DNA 단편의 용융 온도에서의 서열 관련 차이 및 선형 온도 구배 ^9,10을 갖는 다공성 겔에서의 이동성의 후속 변화에 의존합니다. DNA 단편의 용융은 특정 용융 프로파일을 생성한다. 일단 가장 낮은 용융 온도를 갖는 도메인이 겔 내의 특정 위치에서 상응하는 온도에 도달하면, 나선형 구조로부터 부분적으로 용융된 구조로의 전이가 발생하고, 분자의 이동이 실질적으로 중단될 것이다. 따라서 TGGE는 DNA 단편의 이동성 (크기 정보)과 온도 유도 구조적 전이 (서열 의존 정보)를 모두 활용하여 DNA 단편의 특성화에 대한 강력한 접근 방식을 제공합니다. DNA 분자의 세 가지 구조적 전이에 해당하는 TGGE 용융 패턴의 특징점은 가닥 초기-해리점, 가닥 중간-해리점, 및 가닥 말단-해리점이다(그림 1). 도메인 내의 서열 변이, 심지어 단일 염기 차이조차도 용융 온도에 영향을 미치므로, 상이한 서열을 갖는 분자는 TGGE 분석에서 이산 용융 (변성) 패턴을 보여줄 것이다. 따라서 TGGE는 게놈 RNA에서 SNV를 분석하는 데 사용할 수 있으며 RNA 편집을 탐지하는 데 매우 중요한 고처리량 방법이 될 수 있습니다. 이러한 높은 처리량 이득은 전통적인 겔 전기영동 기반 TGGE가 사용될 때 손실된다. 그러나, microTGGE(μTGGE)로 명명된 TGGE의 소형화된 버전은 겔 전기영동 시간을 단축^{하고 생산성(}11)의 100배 증가로 분석을 가속화하는데 사용될 수 있다. μTGGE 방법의 단순성과 소형화는 현장에서 적용 가능하고 핸드헬드이며 저렴한 겔 전기영동 시스템인 PalmPAGE¹²의 도입으로 개선되었습니다.

여기서, 새로운 TGGE 기반 프로토콜은 애기장대 조직으로부터의 두 개와 포유동물 HEK293 세포에서 발현된 두 개를 포함하는 네 개의 유전자에서 세 가지 유형의 RNA 편집 부위(A-to-I, C-to-U 및 U-to-C) 를 검사하는데 사용된다(도 1A). 이 프로토콜은 RNA 편집의 신속한 검출을 위한 휴대용 시스템인 PalmPAGE(하드웨어) 및 uMelt(소프트웨어)¹³의 사용을 통합합니다. 평균 실행 시간이 15-30분인 이 프로토콜은 직접 RNA 시퀀싱 접근 방식 없이도 RNA 편집을 빠르고 안정적이며 쉽게 식별할 수 있습니다.

프로토콜

1. 대상 조각의 최적화

참고: A. thaliana의 두 개의 핵 유전자(AT2G16586 및 AT5G02670)와 HEK293 세포에서 발현되는 청색 형광 단백질(BFP) 및 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 코딩하는 유전자를 포함하여 네 개의 편집된 유전자가 이 프로토콜의 개발에 사용되었습니다.

1. 편집된 영역과 편집되지 않은 영역을 나타내는 상이한 용융 프로파일을 갖는 유전자 단편을 확인하기 위해, 원래의 uMelt 소프트웨어⁽¹³)의 확장인 uMelt HETS 웹 기반 도구를 사용하여 예측된 용융 곡선을 생성한다.
   참고: 이 도구는 헤테로듀플렉스 및 호모듀플렉스 제품에 대한 용융 곡선의 모양을 예측합니다.
2. 각 표적 유전자에 대해, 세 쌍의 유전자 단편(길이 300-324 bp)을 설계한다. 각 쌍은 편집된 사이트를 갖는 단편과 편집되지 않은 사이트를 갖는 상응하는 야생형 단편으로 구성되며, 5'-말단 끝, 중간 위치 또는 3'-말단 말단에 위치한다.
3. 추가 분석을 위해 헬리시티 축의 용융 영역 간의 최대 차이를 표시한 편집되지 않은 쌍을 선택합니다. μTGGE 분석을 위해, 하기 섹션 2에 기재된 바와 같이 PCR 증폭에 의해 선택된 유전자 단편을 합성한다.
4. DNADynamo 소프트웨어 (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm)를 사용하여 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하고 NCBI Primer-BLAST 도구를 사용하여 검증하십시오.
5. 프라이머를 TE 완충액 (1 mM EDTA· 함유 10 mM Tris-HCl)에 희석한다. Na2) 100 pmol/μL의 농도로 보관하고 사용하기 전에 증류수를 사용하여 10 pmol/μL의 농도로 설정된 각 프라이머를 희석한다.

2. 표적 단편의 RNA 추출 및 RT-PCR 증폭

1. RNA 추출
   1. TRIzol 추출¹⁴ 또는 상업적으로 입수가능한 키트와 같은 표준 방법을 사용하여 편집 및 비편집 유전자의 공급원으로부터 총 RNA를 추출한다.
   2. 단계 2.2에 기재된 바와 같이 표준 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 상응하는 cDNA의 합성을 수행한다.
2. 역전사
   1. 1 μL의 올리고(dT) 프라이머, 1 μL의 10 mM dNTP 믹스, 10 μL의 총 RNA 및 10 μL의 멸균 증류수를 뉴클레아제가 없는 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다.
   2. 혼합물을 65°C에서 5분 동안 가열한 다음, 적어도 1분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.
   3. 2-3초 동안 최대 속도(12,000 x g)에서 원심분리하여 튜브의 내용물을 수집하고, 4μL의 5x ReverTra Ace 버퍼, 1μL의 0.1M DTT 및 1μL의 M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) 역전사효소(200 U/μL, Table of Materials)를 첨가한다.
   4. 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오. 랜덤 프라이머를 사용하는 경우, 튜브를 25°C에서 5분 동안 인큐베이션한다.
   5. 튜브를 55°C에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 디지털 건식 욕조/블록 히터에서 70°C에서 15분 동안 가열하여 반응을 불활성화시킨다.
   6. 분광광도계를 이용하여 cDNA의 농도를 측정하고 이를 -25°C에 보관한다.
3. PCR 증폭 및 제품의 확인 시퀀싱
   1. 뉴클레아제가 없는 마이크로원심분리 튜브에 다음 시약을 첨가한다: 4 μL의 5x Taq 중합효소 완충액, 2 μL의 2 mM dNTP 믹스, 2 μL의 25 mM_MgCl2, 1.6 μL의 프라이머 세트 (정방향 및 역방향; 각각 10 mM), 2 μL의 cDNA 주형, 0.1 μL의 Taq 중합효소 (2.5 U/μL), 및 8.3 μL의 멸균 증류수 (최종 부피, 20 μL).
   2. 다음의 사이클링 조건으로 PCR을 수행한다: 95°C에서 2분 동안 초기 변성; 95°C에서 2분 동안 변성시키고, 적합한 온도(사용된 특정 프라이머 세트에 따라)에서 30초 동안 어닐링하고, 72°C에서 2분 동안 연장하는 35 사이클; 이어서, 72°C에서 7분 동안 최종 연장하였다.
   3. PCR 산물을 정제하려면 엑소뉴클레아제 I 2U와 새우 알칼리성 포스파타제(ExoSAP) 0.5U를 첨가한다. 튜브를 37°C에서 1시간 동안 열 사이클러에서 인큐베이션하고, 이어서 80°C에서 15분 동안 인큐베이션한 다음, 다음 단계까지 4°C에서 유지한다.
   4. 확인 시퀀싱을 위해 11.5μL의 멸균 증류수, 2.5μL의 정방향 또는 역방향 프라이머 및 1μL의 PCR 산물(ExoSAP 포함)을 새로운 마이크로 원심분리 튜브에 첨가하십시오.
      참고: 시퀀싱 분석을 위해 DNA 시퀀싱 서비스(예: Eurofins Genomics)를 사용하십시오.
   5. PCR 산물의 특이성을 검증하려면 정방향 및 역방향 프라이머로 시퀀싱을 수행하십시오. 대표적인 분석에 사용된 프라이머 쌍은 표 1에 제시되어 있다.
   6. 정제된 PCR 산물을 탈이온수로 200 ng/μL의 농도로 희석하십시오. 다음으로, 정제된 생성물 6 μL를 250 μL 튜브에 3 μL의 6x 겔 로딩 염료와 혼합하고, 멸균수로 총 부피를 12 μL로 올렸다. μTGGE로 진행시킬 준비가 될 때까지 PCR 산물을 (-25°C에서) 하기에 기재된 바와 같이 저장한다.

3. μTGGE 분석

참고: μTGGE 분석은 소형화 및 경제 시스템을 사용하여 수행됩니다. 겔 카세트, 겔 카세트 홀더, 수평 겔 전기영동 플랫폼, 전원 공급 장치 및 겔 이미징 시스템을 포함한 전체 시스템의 개요가 그림 2에 나와 있습니다.

1. 젤 카세트의 조립
   1. μTGGE 분석에 사용된 겔 카세트는 도 2A에 도시되어 있다. 디자인은 세 개의 1 인치 젤 플레이트로 구성됩니다 : 하단 젤 플레이트, 상단 젤 플레이트 및 차선 형성기 플레이트. 상단 겔 플레이트를 다른 두 플레이트 사이에 샌드위치하고 겔 중합을 위해 겔 카세트 홀더에 조립하십시오.
2. 폴리아크릴아미드 겔 준비
   1. 7.2 g의 요소를 50 mL 튜브에 첨가하고 10 mL의 멸균수에 용해시킨다. 샘플을 전자 레인지에서 20-30 초 동안 가열 한 다음 실온 (RT)으로 가져옵니다.
   2. 5x 트리스/보레이트/EDTA(TBE) 버퍼 3mL(물자표), 40%(w/v) 아크릴아미드/비스(19:1) 2.25mL, 10x 과황산암모늄 75μL, 테트라메틸에틸렌디아민 15μL를 용액에 첨가한다.
   3. 즉시 젤 용액을 젤 카세트 홀더에 천천히 부어 기포가 형성되지 않도록하십시오.
3. μTGGE 단위를 사용한 용융 프로파일의 생성
   1. DNA 이동 방향에 수직으로 설정된 온도 구배(25-65°C)를 갖는 도 2에 도시된 μTGGE 장치의 소형화되고 경제적인 버전을 사용한다.
   2. 상부 및 하부 전기영동 버퍼 패드(0.5 cm x 2.5 cm)를 1x TBE 버퍼 2 mL에 담그십시오.
   3. 겔 카세트를 수평 전기영동 챔버 유닛에 놓고 그림 2와 같이 그에 따라 상부 및 하부 버퍼 패드를 배치한다.
   4. 다음으로, PCR 산물 10 μL를 중간(더 긴) 웰에 로딩하고 PCR 산물 1 μL를 각 측면 웰에 넣는다.
   5. 1분 기다린 후 전원 장치를 연결하고 25-65°C의 선형 온도 구배에서 12분 동안 100V를 공급합니다.
   6. 실행이 완료되면 카세트를 꺼내 상단 유리 덮개를 제거하십시오.
   7. 300 μL의 10x SYBR 골드 염색을 겔에 붓는다. 손바닥 크기의 전기 영동 장치에 설치된 파란색 LED 손전등을 사용하여 용융 프로파일을 시각화합니다.
      참고: 패턴 유사성 점수(PaSS) 계산을 위해 젤 이미지의 소프트 파일을 저장해야 합니다.
   8. 모든 전기영동 실험 3x를 반복하여 데이터의 재현성을 확인하십시오.

4. PaSS 계산

참고: 계산은 μTGGE 분석기 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.

1. 소프트웨어를 다운로드하여 엽니 다.
2. 젤 이미지가 포함된 JPEG 파일을 엽니다. 소프트웨어는 JPEG 형식 파일 만 허용합니다.
3. 프레임 버튼을 클릭하고 젤 이미지의 적절한 영역( 프레임 )을 선택합니다.
4. 좌표 보정 단추를 클릭하고 그림 1B와 같이 두 개의 참조 점을 추가합니다.
5. 피처 포인트 추가 버튼을 클릭하고 그림 1B와 같이 샘플 포인트를 추가합니다. 그런 다음 처리된 겔 이미지 데이터를 μTGGE(*.tgg) 형식으로 저장합니다.
6. 샘플 버튼을 클릭하고 단순 포인트 검색 옵션을 선택하여 둘 이상의 이미지를 비교합니다.

결과

μTGGE를 사용하여 RNA 편집 이벤트에서 단일 뉴클레오티드 염기 변화를 확인합니다.
HEK293 세포에서 생산된 BFP 유전자를 포함하는 네 개의 편집된 유전자가 이 프로토콜에 사용되었다 (아포리포단백질 B mRNA 편집 효소 복합체의 데아미나제 효소에 의한 C-to-U RNA 편집; APOBEC1¹⁵), HEK293 세포에서 생산된 황토정지코돈(TAA)을 포함하는 EGFP 유전자(RNA 1에 작용하?...

토론

RNA 편집은 생물학에서 중요한 역할을합니다. 그러나 크로마토그래피 및 시퀀싱과 같은 RNA 편집을 감지하는 현재의 방법은 높은 비용, 과도한 시간 요구 사항 및 복잡성으로 인해 몇 가지 과제를 제시합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 휴대용, 미세 크기, TGGE 기반 시스템을 사용하는 RNA 편집을 검출하는 간단하고 신속하며 비용 효율적인 방법입니다. 이 시스템은 Sanger 시퀀싱 전에 편집된 유전자?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2U ExoI	Takara	2650A	Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1)	Thermo fisher	AM9022
Ammonium persulfate (APS)	Thermo Fisher	17874
Centrifuge Mini spin	eppendorf	5452000034
Digital dry bath/ block heater	Thermo fisher	NA
Gold Taq Polymerase Master mixture	Promega	M7122
LATaq DNA polymerase	TAKARA	RR002A	Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder	BioSeeds Corp.	BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus	Lifetech Corp.	TG
micro-TGGE gel cassette	BioSeeds Corp.	BS-TGGE-C
NanoDrop 1000	Thermo fisher	ND-1000	Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit	Qiagen	74904
ReverTra Ace Master Mix	TOYOBO	TRT101	M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit	Qiagen	74104
Shrimp Alkaline Phosphatase	Takara	2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Thermo fisher	S11494
TBE buffer	Thermo fisher	B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Nacalai tesque	33401-72
Urea, Nuclease and protease tested	Nacalai tesque	35940-65